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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Environmental Biology Research Vol.30 No.1 pp.31-38
DOI :

한국산 Botryococcus braunii (Trebouxiophyceae)의 분리 및 계통분류학적 분석

이승훈1,3, 이찬희2, 조범호1, 안치용1, 김한순2, 오희목1,3,*
1한국생명공학연구원 환경바이오연구센터, 2경북대학교 생물학과, 3과학기술연합대학원대학교

Isolation and Phylogenetic Analysis of Botryococcus braunii (Trebouxiophyceae) from Korean Freshwaters

Hee-Mock Oh1,3,*, Seung-Hoon Lee1,3, Chan-Hee Lee2, Beom-Ho Jo1, Chi-Yong Ahn1, Han-Soon Kim2
1Environmental Biotechnology Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), Daejeon 305-806, Korea
2Kyungpook National University (KNU), Daegu 702-701, Korea
3University of Science and Technology (UST), Daejeon 305-350, Korea
( Received: 5 February 2012, Revised: 20 February 2012, Revision accepted: 24 February 2012 )

Abstract

Recently, energy security is one of the most important world-wide issues. Biodiesel derived from microalgae has received much attention as a renewable bioenergy. The green colonial alga, Botryococcous braunii, is characterized by the ability to produce and accumulate large amounts of hydrocarbons and fatty acids. In this study, we have isolated 5 strains of B. braunii from Korean surface waters using a microcapillary-pipetting method and identified them by morphological features and phylogenetic analysis of the 18S rRNA gene. Phylogenetic analysis indicates that 5 strains of B. braunii are placed in the class of Trebouxiophyceae, and strains belong to race A type producing hydrocarbons which are alkadienes and alkatrienes. In addition, we need further studies to find out optimal growth conditions for producing biodiesel.

05-한국산(컬러).155151.pdf432.4KB

서 론

산업화와 인구증가로 인한 에너지 수요의 폭발적 증가로 한정된 화석에너지 자원이 고갈되고 있으며, 이는 전 세계적인 이슈가 되고 있다 (Chisti 2007). 따라서, 증가하는 에너지 수요를 충족하기 위해서는 대체에너지자원의 개발이 절실히 요구된다. 최근 대체에너지자원의원료 중에서, 미세조류를 이용한 바이오디젤 생산이 많은 관심을 받고 있다(Casadevall et al. 1985; Chisti 2007).미세조류는 광합성 미생물로서 이산화탄소를 고정하여대기 중 온실기체를 저감시키고, 하∙폐수를 이용하여비경작지에서 배양이 가능하고, 비식량자원이며, 단위면 적 당 바이오매스 생산량과 지질생산량이 육상식물에 비해 훨씬 높다는 장점이 있다(Wijffels and Barbosa 2010).미세조류 중에서 군체성 녹조류인 Botryococcus braunii는분류학적으로 Trebouxiophyceae에 포함되고 (Casadevallet al. 1985), 연못, 호수, 저수지 등 담수에서 algalbloom (수화)를 발생시키는 것으로 알려져 있으며, 온대,열대, 극지방에 널리 분포하고 있다 (Hillen et al. 1982).B. braunii는 전형적으로 3차원의 무정형구조로서 그 형태가 포도 또는 서양배(pyriform) 모양의 세포가 서로 뭉쳐 있다(Largeau et al. 1980a). B. braunii는 많은 양의 탄화수소를 생산, 축적하기 때문에 재생에너지자원으로 주목받고 있다 (Banerjee et al. 2002). 자연계에서 B. braunii는 1976년 호주의 Darwin River Reservoir에서 대규모bloom을 형성하여 1,500톤의 건량을 형성하고 이중 30%가 오일성분으로 조사된 바 있다(Wake and Hillen 1980).흥미로운 사실은 지구화학적 분석을 통해 고대 B. braunii의대량 증식 및 축적이 오늘날 석유자원의 근원이라는 추정이 있다(Moldowan and Seifert 1980).  

B. braunii는 세포 내외에 생성, 축적되는 탄화수소의종류에 따라서 race A, race B, race L의 3 type으로 분류된다. Race A는 탄소수 C23-C33의 지방산에서 유래된 alkadienes과alkatrienes를 생성한다. Race B는 탄소수 C30-C37의 메틸기 치환된 botryococcene, squalene과 같은 triterpenes를생성한다. Race L은 tetraterpene과 lycopadiene을 축적한다. B. braunii는 이러한 재생가능한 에너지원인탄화수소를 건조중량의 26~86%로 많이 축적한다 (Metzgerand Largeau 2005). B. braunii에서 생성된 탄화수소는촉매반응으로 크래킹된 후 C7Hn-C11Hm은 가솔린, C12-C15는 항공연료, C16-C18은 디젤로 전환이 가능하다 (Hillenet al. 1982; Banerjee et al. 2002). 

본 연구에서는 전국적으로 물 시료를 채취하여 도립현미경을 이용하여 경검하였고, 5 strains의 B. braunii를분리하였다. 광학현미경을 이용하여 분리한 B. braunii를관찰하고, 형태학적 특징을 바탕으로 동정하였으며, 18SrRNA sequence analysis를 통해 B. braunii의 분자적 동정을 시도하였다. 또한, 본 연구에서 분리한 B. braunii와해외에서 도입한 B. braunii의 18S rRNA sequence를 바탕으로 계통분류학적인 관계를 비교, 분석하였다.  

재료 및 방법

1. 한국산 Botryococcus braunii의 분리 및 형태학적 동정

한국 내 분포하는 B. braunii를 분리하기 위하여 강원도, 경상북도, 제주도 내의 총 5지역에서 플랑크톤 네트를 이용하여 미세조류를 농축한 담수시료를 채취하였다(Table 1). 각 담수시료를 도립현미경 (Nikon TMS-F, Japan)상에서 B. braunii의 형태학적 특징에 근거하여 검경하여 microcapillary-pipetting method를 이용하여 분리하였다(Oh and Rhee 1990). 분리된 B. braunii는 수정된 BG-11 배지(Dayananda et al. 2007)에서 배양하였고, 그 조성은 (mg L-1): NaNO3 (1500), K2HPO4∙3H2O (39), MgSO4∙7H2O(75), CaCl2∙2H2O(36), Citric acid (6), Ammoniumferric citrate (6), Na2-EDTA (1), Na2CO3 (21), H3BO3(0.00286), MnCl2∙ H2O (0.00181), ZnSO4∙ 7H2O(0.000222), CuSO4∙5H2O (0.000079), Na2MoO4∙2H2O(0.000391), Co (NO3)2∙6H2O (0.0000494)이다. 배지는121°C에서 15분간 멸균하였다. 분리된 B. braunii를 광학현미경 (Nikon Eclipse 80i, Japan) 100~1,000배율 하에서검경하고, 사진을 촬영하여 형태학적으로 동정하였다(Yamagishi and Akiyama 1984; 정 1993).

Table 1. Sampling site and date for the isolation of Botryococcus braunii strains from Korean waters

2. Nile Red 염색

분리된 B. braunii 배양액의 1mL에 Nile Red (9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one) 5 mg을 20 mL의아세톤에 녹인 염색액을 4 μL를 첨가하여 교반한 다음5분 후 공초점형광현미경 (confocal fluorescence microscope,ZEISS LSM510Meta, Germany)과 형광현미경 (NikonEclipse 80i, Japan)을 이용하여 490nm에서 여기(excitation)시키고 585 nm에서의 방출 (emission)을 측정하여,세포 내외에 존재하는 지질과 탄화수소를 관찰하였다(Lee et al. 1998). 

3. DNA 증폭 및 염기서열 분석

Genomic DNA를 분리하기 위하여 배양된 B. braunii를 원심분리기로 4,000 rpm에서 농축하였다. GenomicDNA는 QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 추출하였다. MJ MINI Personal ThermalCycler (Bio-Rad, CA, USA)를 이용하여 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 하였다. 분리된 B. braunii로부터 18S rRNA sequence를 증폭하기 위하여 녹조류에 특이적인 primer set (forward, 5′-CGACTTCTGGAAGGGACGTA-3′; reverse, 5′-GAATCAACCTGACAAGGCAAC-3′)를 사용하였다. PCR 반응 조건은 총30 cycle을 하고 94°C에서 5분간 초기 열처리를 한 후,94°C에서 1분간 변성시키고, annealing은 55°C에서 1분을 수행하고, 신장을 위하여 72°C에서 1분간 반응시킨후 최종적으로 72°C에서 10분간 처리하고 반응을 중단시켰다(Moro et al. 2009). PCR 반응은 Maxime PC PreMixKit (Intron Biotechnology, Korea)를 제조사의 프로토콜에따라 사용하였다. PCR 산물을 ethidium bromide를 첨가한 1.0% agarose gel (Sigma-Aldrich, USA)에 loading한후 전기영동하여 ultraviolet transilluminator를 이용하여산물의 위치를 확인한 후 Gel extraction kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 정제하였다(고 등 2004). 정제된 PCR산물은 automatic DNA sequencer (model 377, AppliedBiosystems, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 

4. 계통분류학적 분석

분리된 B. braunii의 18S rRNA sequence는 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank database를 이용하여 BLASTsearch program을 통해 비교, 분석하였다. 또한, Senousyet al. (2004)과 Weiss et al. (2010)에서 얻은 accessionnumbers를 참고하여, GenBank database에 등록된 미세조류주의 18S rRNA sequence (Botryococcus, Chlorella,Scenedesmus)를 이용하여 계통분류학적 분석을 수행하였다 (Table 3). Clustal X 소프트웨어 (자동 설정값)를 이용하여 염기서열을 동일한 값으로 정렬하였다. 이때, 변이가 심한 영역은 BioEdit 7.0을 이용하여 육안으로 교정하였다. 계통분류학적 분석은 배열한 18S rRNA sequence를MEGA4.0에서 Neighbor-Joining 방법으로 실시하였다. Bootstrap 분석은 1,000회의 resampling을 통하여조사하였다(Tamura et al. 2007). 

Table 3. A list of Botryococcus, Chlorella and Scenedesmus species included in this study for phylogenetic analysis and GenBank accession numbers for their 18S rRNA sequences

결과 및 고찰

1. 한국산 Botryococcus braunii의 분리 및 형태학적 동정

전국적으로 강원도 정선군의 도롱이 연못, 경상북도청송군의 마뜰못, 제주도 애월읍의 숨은물뱅듸와 외도동광령지, 경상북도 경산시의 구룡저수지 등 5곳의 담수에서 2010년 4월부터 2011년 6월에 걸쳐 플랑크톤 네트를 이용하여 미세조류를 농축한 담수시료를 채취하였다(Table 1). 각 담수시료에서 Botryococcus braunii의 출현을 확인하고 microcapillary-pipetting method를 이용하여B. braunii KNU2, 5, 6, 7, 8의 5주를 분리하였다. 

분리된 B. braunii를 광학현미경 하에서 검경하고, 사진을 촬영하여 형태학적인 특징을 분석하였다 (Fig. 1).B. braunii는 삼차원의 무정형 군체를 형성하였으며, 그군체는 투명하거나 노르스름한 점액질에 둘러싸여 있었고, 각각의 군체에 길거나 짧은 젤라틴성 가닥(strand)으로 연결되어 있었다. 분리된 B. braunii의 군체, 세포, 세포를 둘러싼 점액질의 크기를 측정하였다 (Table 2). B.braunii KNU2, 5, 7, 8은 평균 직경이 45.5~60.0 μm로유사한 크기의 군체를 형성하였고, B. braunii KNU6은다른 분리된 B. braunii에 비해서 상대적으로 크기가 큰평균 직경이 76.5 μm의 군체를 형성하였다. 젤라틴으로싸여진 군체의 내부에는 난형 혹은 서양배모양의 세포가 주변의 세포 무리와 방사적으로 배열되어 있었고, B.braunii KNU2, 5, 7, 8의 세포 지름은 평균 직경이 9.5~12.0 μm였다. 그러나 B. braunii KNU6은 분리된 다른 B.braunii보다 평균 직경이 8.7 μm로 짧고 세포의 모양이더욱 불규칙한 형태이며, 3~5개 또는 그 이상의 세포가 더 두꺼운 젤라틴 속에 박혀있는 형태였다.  

Fig. 1. Light micrographs of Botryococcus braunii. (A), B. braunii KNU2; (B), B. braunii KNU5; (C), B. braunii KNU6; (D), B. braunii KNU7; (E), B. braunii KNU8. Scale bar indicates 20 μm.

Table 2. The morphological characteristics of Botryococcus braunii strains isolated from Korean waters

녹조류의 분류군에서 트레복시아조강 (Trebouxiophyceae)은 편모가 없는 단세포나 군체, 사상체이며, 주요계통군 중에서 Botryococcus 속은 4개의 종 (braunii, terribilis,protuberans, sudetica)이 보고되었으며, 이 중에서B. braunii는 난형 또는 구형의 작은 세포가 길거나 짧은젤라틴성 가닥으로 연결되어 불규칙한 모양의 군체를형성한다 (정 1993). 세포는 난형 또는 구형의 형태이며,이들은 각각 주변의 세포 무리와 방사적으로 배열되어있다. 또한 강하고 투명한 젤라틴성 점액질에 싸여있다.각 군체에는 16, 32개 또는 그 이상의 세포가 함께 있으며, 각 세포는 한 개의 엽록체를 갖고 있으며, 세포의 지름은 3~6 μm, 길이는 6~11 μm로 알려져 있다 (Yamagishiand Akiyama 1984). 

분리된 B. braunii를 Nile Red로 염색한 후 공초점형광현미경과 형광현미경을 이용하여 세포 내외에 존재하는지질과 탄화수소를 관찰하였다(Fig. 2). B. braunii가 생산하는 탄화수소의 대부분을 세포 밖에 저장하고, 세포 내에는 미량을 저장한다 (Largeau et al. 1980b). 전반적으로B. braunii는 세포 내에서 둥근 형태의 지방 과립을 보였고, 세포 밖의 젤라틴성 점액질에 훨씬 많은 비율로 탄화수소를 보였다. 그러나 B. braunii의 세포내 지질 과립의양과 세포 밖의 탄화수소의 양에는 차이가 있었다. B.braunii KNU2, 7은 세포 내의 지방과립의 양이 분리된 다른 B. braunii보다 작고, B. braunii KNU5, 6, 8은 세포 내의 지방과립의 양이 많았다. 특히, B. braunii KNU6는 세포 내의 지방과립의 크기가 분리된 다른 B. braunii보다크며, 세포 밖의 탄화수소의 양이 훨씬 많았다. 이는, 세포 밖의 탄화수소가 포함되어 있는 점액질의 비율이 B.braunii KNU6가 가장 크기 때문인 것으로 사료된다(Table 2).  

Fig. 2. Fluorescence micrographs of Botryococcus braunii stained with Nile Red. (A), B. braunii KNU2; (B), B. braunii KNU5; (C), B. braunii KNU6; (D), B. braunii KNU7; (E), B. braunii KNU8. Scale bar indicates 10 μm.

분리된 5 strains의 B. braunii가 분리된 장소에 따라서형태적으로 군체의 크기, 세포의 크기와 모양, 군체를 둘러싸고 있는 젤라틴성 점액질의 두께 등에 다소 변이를보였으나, 세포 내의 지방 과립의 양과 세포 밖의 점액질에 포함된 탄화수소의 양은 큰 차이를 나타내었다. 특히, B. braunii KNU6는 다른 분리된 B. braunii 주에 비해서 군체의 크기가 크고, 군체와 세포를 둘러싸고 있는젤라틴성 점액질의 두께가 두꺼우며, 세포 밖의 탄화수소의 양이 훨씬 많았다. 그러나 B. braunii KNU6와 같이제주도에서 분리된 B. braunii KNU7은 위와 같은 특징을 보이지 않았으며, B. braunii KNU5와 B. brauniiKNU8 역시 경상북도에서 분리 되었으나 군체의 크기와세포모양 등에 큰 차이가 있는 것으로 보아 한국 내에서 분리된 B. braunii의 지역적 변이는 없는 것으로 사료된다. 

2. DNA 증폭과 염기서열 분석

분리된 B. braunii의 18S rRNA sequencing 후, BLAST search를 통해 분석하였다. 분리된 B. braunii의 18S rRNAsequence의 범위는 980~1,079 bp이고, 모두 GenBank에등록하였다. 18S rRNA sequence의 accession number와sequence length는 Table 3에 나타내었다. 광학현미경 관찰을 통한 형태적인 동정 결과에서와 동일하게 BLASTsearch를 통해 분리된 모든 미세조류주가 B. braunii와 가장 높은 상동성을 나타낸 것으로 확인되었다(Table 4).B. braunii KNU2, B. braunii KNU6의 18S rRNA sequence는 B. braunii (GenBank accession No. FR865761), B. braunii(GenBank accession No. GU951518)와 각각 99%, 98%로 가장 높은 상동성을 보였다. 또한, B. braunii KNU5,B. braunii KNU7, B. braunii KNU8의 18S rRNA sequence는 모두 B. braunii (GenBank accession no. HM245352)와각각 98%, 99%, 99%로 높은 상동성을 보였다. 따라서,분리된 5 미세조류주의 염기서열이 모두 GenBank에 보고된 B. braunii의 18S rRNA sequence와 매우 높은 상동성을 보여 형태적 형질을 이용한 동정의 결과와 일치하였다. 

Table. 4. The similarity between amplified sequences and the closest relative sequence for Botryococcus braunii strains isolated from Korean waters

제주도에서 분리된 2 strains의 B. braunii의 18S rRNAsequence와 가장 높은 상동성을 보이는 미세조류주가다르지만, 경상북도의 마뜰못, 구룡저수지에서 분리된 B.braunii와 제주도의 광령지에서 분리된 미세조류주의18S rRNA sequence와 가장 높은 상동성을 보이는 미세조류주가 서로 같은 것으로 보아, 한국산 B. braunii 18SrRNA sequence의 지역적 상동성과 특이성은 없는 것으로 사료된다. 

3. 계통분류학적 분석

한국산 B. braunii의 진화, 계통분류학적 관계를 분석하기 위하여, 본 연구에서 분리된 B. braunii의 18S rRNAsequence와 GenBank에 등록되어 있는 Botryococcus,Chlorella, Scenedesmus의 18S rRNA sequence를 이용하여 Neighbor-Joining 방법으로 분석하였다. 분석에 사용된 미세조류주의 18S rRNA sequence는 Table 3에 나타내었다. 계통분류학적 분석의 결과(Fig. 3), 분리한 B. braunii와GenBank에 보고된 B. braunii는 단일 계통인 Trebouxiophyceae으로분지되었으며, Chlorophyceae의 Chlorella와Scenedesmus의 분류군과는 뚜렷하게 구분되었다.이는 형태학적 형질을 이용한 동정 결과와 일치하였다.B. braunii KNU2, 5, 7, 8은 분류군 내에서 매우 가까운거리에 위치하였으나, B. braunii KNU6는 다른 분리된B. braunii와는 같은 분류군 내에서 멀리 떨어진 거리에위치하였다. 즉, B. braunii KNU2, 5, 7, 8은 18S rRNAsequence를 이용한 계통분류학적 분석을 통해서는 매우유사한 미세조류주로 사료되며, B. braunii KNU6는 다른분리된 B. braunii와는 차이가 있을 것으로 사료되었다.이러한 결과는 군체 크기, 점액질의 두께, 탄화수소 양등에 기반한 형태적 분석의 결과 B. braunii KNU6가 다른 분리된 B. braunii 주와 구분되는 것과 일치한다. 

Fig. 3. Phylogenetic tree showing the relationship among 18S rRNA sequences of 5 B. braunii strains from Korean waters and 13 B. braunii strains, 3 Chlorella strains and 4 Scenedesmus strains from NCBI nucleotide database. A, B, and L types are given in parentheses at the end of each strain.

18S rRNA sequence에서 가까운 거리에 위치한 B. brauniiKNU2, 5, 7, 8은 조금의 차이는 있으나 군체의 크기와 세포의 모양과 크기 등 형태적으로 유사하였으나, 멀리 떨어진 거리에 위치한 B. braunii KNU6는 다른 분리된 B. braunii에 비해서 군체의 크기가 크고, 세포의 크기가 작으며, 군체를 둘러싸고 있는 젤라틴성 점액질의두께가 더욱 두꺼운 형태적인 차이를 보이고, 세포 내의지방과립의 양과 크기, 그리고 세포 밖의 탄화수소의 양이 분리된 다른 B. braunii보다 많았다. 이는 한국 내에서 분리된 B. braunii의 18S rRNA sequence를 이용한 계통분류학적 분석 결과와 형태적인 특징이 서로 무관하지 않음을 나타내었다. 

B. braunii는 생산하는 탄화수소의 종류에 따라서 뚜렷한 세 개의 race type으로 정의된다(Metzger and Largeau2005). 또한 세 개의 race type은 계통분류학적 분석을 이용하여 뚜렷하게 구분된 분류군을 형성한다 (Senousy etal. 2004; Weiss et al. 2010). 본 연구에서도, 이전의 연구결과와 동일하게 단일분류군인 Trebouxiophyceae는 raceA type을 포함하는 계통과 race B type, race L type을 포함하는 계통으로 뚜렷하게 분리된 분류군을 형성하였다.Race B type와 race L type이 Trebouxiophyceae의 분류군내에서 가까운 거리에 있는 것은 두 type 모두 Isoprenoid유래의 탄화수소를 생산하기 때문이라고 제안되었으며(Weiss et al. 2010), Race A type은 지방산 유래의 탄화수소를 생산한다고 알려져 있다. 계통분류학적 분석의 결과로 보아 한국에서 분리된 B. braunii는 모두 race A type의 분류군에 함께 포함되었다. 따라서 본 연구에서 분리된 모든 B. braunii는 race A type 이고, 탄소수 C23-C33의탄화수소인 alkadienes과 alkatrienes를 생산하는 것으로사료된다. 향후, B. braunii를 이용한 바이오디젤을 생산하기 위하여, 최적의 배양조건을 찾는 연구가 필요하다. 

적 요

한국 내 전국적으로 5곳의 담수에서 2010년 4월부터2011년 6월에 걸쳐 담수시료를 채취한 후, 각 담수시료에서 Botryococcus braunii의 출현을 확인하고 microcapillary-pipetting method를 이용하여 5주를 분리하였다. 분리된 B. braunii의 18S rRNA sequencing 후, BLAST search를통한 분석 결과는 B. braunii와 가장 높은 상동성을 나타낸 것으로 확인되어 형태적 동정결과와 일치하였다. 진화, 계통분류학적 분석결과, 분리된 5주의 B. braunii는단일 계통인 Trebouxiophyceae으로 분류되었다.18S rRNA sequence의 계통 분류학적 분석에서 B. brauniiKNU6는 다른 분리된 B. braunii와 같은 분류군 내에서거리의 차이가 있었고, 또한 세포크기, 점액질의 양 등의형태적 특징도 차이를 보였다. 한국에서 분리된 5주의B. braunii는 모두 race A type의 분류군에 포함되며, 탄소수 C23-C33의 지방산에서 유래된 alkadienes과 alkatrienes를생산하는 것으로 사료되며, B. braunii를 이용한바이오디젤을 생산하기 위한 최적의 배양조건을 찾는연구가 필요하다. 

사 사

본 연구는 교육과학기술부 글로벌프런티어사업 (Advanced Biomass R&D Center)의 연구비 지원으로 수행되었습니다. 

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