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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean J. Environ. Biol. Vol.32 No.4 pp.382-388
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2014.32.4.382

The Infection of Heterosporis anguillarum in Cultured Shortfin Eel (Anguilla bicolor pacifica)

Jin-Do Kim, Jeong-Wan Do, Hye-Sung Choi, Hyae-in Jo, Nam-Sil Lee1, Young-Dae Kim2*
Pathology Division, Aquaculture Research Institute, National Fisheries Research & Development Institute, Busan 619-705, Korea
1New strategy Research Center, NFRDI, Busan, Korea
2Korea Fisheries Resource Agency, Western Branch, Gunsan 573-030, Korea
Corresponding Author: Young-Dae Kim, Tel. 010-2616-3981, Fax. 063-443-3934, kyd@fira.or.kr
October 20, 2014 November 27, 2014 November 28, 2014

Abstract

Shortfin eel (Anguilla bicolor pacifica) is a species of commercial importance and its production is greatly affected due to the infection by Heterosporis anguillarum. In this study, we evaluated the effect of H. anguillarum infection on the growth of Shortfin eel. A disease that trunk muscle of cultured shortfin eel, Anguilla bicolor pacifica, were irregular and resulted in death, breakout of the commercial eel culture farm.

We observed that the trunk muscle of infected eels were irregular and represented white or yellowish externally. Histopathologically, a great numbers of large or small spores and sporophorocysts were also observed in degenerated muscle layer.

The cloning of specific gene of H. anguillarum, encoding small subunit ribosomal RNA (SSU-rRNA) was amplified by the polymerase chain reaction(PCR) from the muscle lesion of diseased eel. The size of clone gene is well matched with the size of small subunit ribosomal RNA of H. anguillarum and thus confirming the infection by H. anguillarum.


양식동남아산 뱀장어(Anguilla bicolor pacifica)의 Heterosporis anguillarum 감염

김 진도, 도 정완, 최 혜승, 조 혜인, 이 남실1, 김 영대2*
국립수산과학원 병리연구과
1국립수산과학원 전략연구단
2한국수산자원관리공단

초록


    National Fisheries Research and Development Institute
    RP-2014-AQ-132

    서 론

    국내에서 양식되고있는 극동산 뱀장어(Anguilla japonica) 종묘의 어획량이 최근에 남획으로 인해 감소하였다. 이에 뱀장어 양식업계에서는 대체품종으로서 동남아 지 역에서 수집되는 Anguilla bicolor bicolor, A. bicolor pacificaA. marmorata의 실뱀장어를 수입하여 양식을 하였다. 그러나 이들은 극동산과는 다른 생태적 특성을 지니고 있어 사육초기에 감모가 많이 발생하여 손실이 크다.

    양식어업인 및 연구자들이 여러 방면의 사육기술개발 및 질병 예방 등에 많은 노력을 기울이고 있으며, 동남아 산 뱀장어의 질병에 관한 연구로는 Anguillid herpesvirus 에 관한 보고 외에 아직 국내에서는 이에 관한 연구 자 료가 없다(Park et al. 2012).

    뱀장어에 나타나는 일명 “요철병”이라고 불리우는 질 병은 근육 내에 미포자충인 H. anguillarum이 감염되어 몸쪽 근육에 요철현상을 발생시킨다(Kim et al. 2006). 이 포자충에 감염된 뱀장어는 성어에서는 폐사율은 낮으나 근육에 생긴 요철현상 때문에 상품가치가 저하되며, 치어 에서는 만성적으로 나타나서 폐사율이 높다(Park and Oh 2011).

    본 질병은 1930년대에 일본의 노지 양만장에서 사육 중이던 유럽산 뱀장어에서 최초로 발견되었으며, 원인충 은 Plistophora anguillarum으로 보고되었다(Hoshina 1951). 이후 H. anguillarum으로 명명되게 되었다(Lom and Dykova 1992, 2002).

    뱀장어(A. japonica)에서는 전자현미경적 관찰(Hashimoto and Takinami 1976; Lom et al. 2000), 병리조직학적 변화(Suh and Chun 1988), 자연감염(Joh et al. 2007) 등에 관한 보고가 있다.

    본 연구는 동남아산 뱀장어에 감염되어 폐사를 일으킨 미포자충인 H. anguillarum임을 확인하고, 감염어의 병리 조직학적 변화 및 분자생물학적 동정을 실시하였다.

    재료 및 방법

    병어의 채집은 사육 중이던 10 cm 전후의 뱀장어 치어 가 몸통 근육이 함몰되어 요철현상을 나타내면서 하루에 10마리 이상의 폐사개체가 나타난 뱀장어 양식장으로부 터 증상이 심한 개체를 무작위로 채집하였다. 증상을 나 타내는 병어는 수면 위를 힘없이 유영하다가 순환여과식 수조의 찌꺼기 수거장치에 주로 모여 있어 이들을 수시 로 쉽게 채집할 수 있었다. 또한 채집된 대부분의 시료어 는 육안적으로 관찰하였을 때 몸통부위의 요철현상이 심 하게 나타났다(Fig. 1). 이들 몸통부위 근육에 이상이 있 다고 판단된 10마리의 뱀장어 치어를 채집하여 개체별로 근육의 요철부위만을 메스를 사용하여 잘라서 Homogenizer로 마쇄하였다. 그 마쇄액을 면봉으로 취하여 슬라 이드 글라스에 도말, 고정한 후, Loffler’s methylene blue 액으로 2분간 염색하였다. 염색된 슬라이드 표본으로 광 학현미경 200배 배율 하에서 포자충을 확인하였다. 또한 병어의 근육조직 내에 조직학적 병화을 관찰하기 위해 실험어로부터 조직을 절취하여 Bouin액에 고정한 다음, 상법에 따라 파라핀으로 포매된 조직을 5~7 μm 두께로 연속절편하고, H-E 대비염색하여 광학현미경으로 관찰하 였다(Zeiss, Germany).

    감염이 확인된 포자충의 동정을 위해서는 이전의 보고 된 논문을 참고로 하여 H. anguillarum이 공통적으로 가 지는 유전자인 SSU-rRNA를 증폭하기 위해 primer를 제 작하여 동정을 진행하였다(Hung et al. 1998).

    감염된 뱀장어의 근육조직 50 μg과 DEPC 300 μL를 섞 어서 Homogenizer로 마쇄한 후, 원심분리(8,000 rpm, 1 min)하여 상층액 100 μL를 DNA 추출에 이용하였다.

    DNA의 추출은 Roche kit를 이용하였다. 먼저 상층액 100 μL에 Lysis buffer 200 μL, Proteinase K 40 μL를 넣어 55°C Heat block에서 1시간 동안 반응시키고 Binding buffer 200 μL를 분주하여 Vortex한 후 다시 72°C Heat block에 10분간 반응시켰다.

    다음에 Isopropanol 100 μL 분주하여 충분히 섞어서 Column tube에 분주하여 8,000 rpm, 1분간 원심분리 한 후, 그 용출액은 제거하였다. 다시 새로운 튜브에 Column 을 꽂고 Inhibitor Remover buffer 500 μL를 분주하여 원 심분리(8,000 rpm, 1 min)한 후 Wash buffer 500 μL를 넣어 원심분리를 2회 반복하여 용출액은 제거하였다. E-tube에 Column을 꽂고 70°C에 예열된 Elution buffer 50 μL를 분 주 후 원심분리(8,000 rpm, 1 min)를 진행하여 DNA Product를 얻었다. 이렇게 추출된 근육 조직의 DNA를 Template로 하여 Bioneer-PCR premix를 이용하여 PCR을 진 행하였다. 실험에 사용된 primer는 다음과 같다.

    18F(5′-CACCAGGTTCATTCTGCC-3′),1537R:(5′-TTA TGATCCTGCTAATGGTTC-3′)/V1:(5′-CACCAGGTTG ATTCTGCCTGAC-3),1392R:(5′-GAGACGGGCGGTGT GTACAAAGAAC-3′)/H1:(5′-ACTTAGACGAAGACGG GTACGG-3′),

    H2:(5′-CACTHACCTHTTCTTHACCCTTCC-3′) 세가지 Set이며 PCR의 조건은 다음과 같다. 18F, 1537R Primer 를 이용하여 94°C-2 min, /94°C-0.5 min, 50°C-0.5 min, 72 °C-2 min, /72°C-5 min - 40 Cycles 조건으로 V1, 1392R과 H1 ,H2 Primer의 경우 94°C-2 min, /94°C-1 min, 55°C-1 min, 72°C-3 min, /72°C-5 min - 40 Cycles 의 조건으로 PCR을 진행한 후 1.2% Agarose gel에 PCR product를 로딩하여 확인하였다.

    PCR product를 gel elution (Roche kit)한 후 pGEM-T Easy Vector에 Cloning하였으며 Plasmid Kit (Bioneer)를 이용하여 Plasmid를 추출하였다. 서열의 분석은 Solgent 사에 의뢰하였으며, 그 결과에 의해 H. anguillarum Small subsnit ribosomal RNA gene (Gene bank Accession No. AB 623036)의 서열과 함께 Bioedit Clust W 프로그램을 이용 하여 비교분석하였다.

    결과 및 고찰

    폐사되기 전의 병어는 몸통부분의 요철현상이 심하였 으며 그 부분의 근육을 마쇄하여 Loffler’s methylene blue 액으로 염색하여 관찰한 결과, 수많은 포자가 확인되었 다(Fig. 2). 근육 내에 형성된 포자낭(sporophorocyst)을 확인하기 위하여 조직표본을 제작하여 관찰한 결과, 근육 층 내 상피(epidermis)와 진피(dermis)의 변화는 정상조 직과 감염조직 사이에 변화가 거의 없는 데 반하여, 감염 어의 경우, 근육층(muscle layer) 내에 많은 수의 포자낭 형성이 관찰되었다(Fig. 3). 포자낭 내에 형성된 포자는 크기가 일정하지 않았으며, 대형(6~9 μm)과 소형(3~5 μm)으로 구분되었다(Kim et al. 2006). 시스트를 둘러싼 근섬유는 괴사로 인한 단백질 변성이 진행되어 호산성의 붉은 염색성을 나타내는 유리질화, 균질화된 형태로 관찰 되었다. 또한 근섬유 주변에는 많은 수의 포자가 흩어져 있었는데 이는 시스트가 파열되면서 포자가 빠져나온 것 으로 추측되었다. 어류의 미포자충은 조직표본의 관찰이 나 전자현미경적 미세조직상을 관찰하여 종을 동정하고 있다(Lom et al. 2000). H. anguillarum의 경우, 감염어에 Xenoma를 형성하지 않으며, Sphorophorus vesicle (SPVs) 가 근육과 분리되어 있다고 알려져 있다(Lom 1992; Bruno et al. 2006). 그러나 최근에 이들에 관한 유전자 정보가 확립되어, 본 연구에서 병어의 근육 내에 형성된 시스트 덩어리를 사용하여 PCR을 실시한 결과, H. anguillarum이 가지는 특정 유전자인 Small subunit ribosomal RNA (SSUrRNA) 를 증폭할 수 있었다. Primer 18F과 1537R을 이용 하여 PCR을 실시하여 1366 bp (Lane1)의 산물을 얻었고 V1과 1392R를 이용하여 PCR을 실시하여 1200 bp (Lane 2)의 산물을 얻었으며 H1과 H2를 이용하여 PCR을 실시 한 결과, 800 bp (Lane 3)의 산물을 얻을 수 있었다. 본 연 구에서 동남아산 뱀장어에 감염된 포자충은 H. anguillarum임을 동정할 수 있었다(Fig. 4). 보다 더 정확한 동 정을 위하여 PCR product를 Cloning하여 Sequencing을 실시한 결과, H. anguillarum Small subunit ribosomal RNA 서열과 일치하였다(Tsai et al. 2002).

    기준이 된 서열은 H. anguillarum Small subunit ribosomal RNA gene (Gene bank Accession No. AB623036)이며 이를 토대로 PCR product의 각각의 서열과 aligment 하여 비교해 본 결과 서열이 일치하였다. 서열비교에 사용한 프로그램은 Bioedit의 Clust W를 이용하였으며 총 4개의 서열을 비교한 결과 18F/1537R과 V1/1392R의 서열은 23 bp부터 일치하고 있으며 H1/H2서열은 237 bp부터 일 치하게 나타났다. 또한 H1/H2 primer의 PCR product의 경 우 나머지 두 product와 공통적인 서열을 가지고 있었으 며 이는 800 bp 정도 일치함을 볼 수 있었다. 위의 결과에 의해 본 연구에서 조사된 포자충은 H. anguillarum으로 동정을 할 수 있었다(Fig. 5).

    최근, 국외의 한 연구에 의하면 파충류인 가터뱀(Thamnophis sirtalis)의 근육 내에도 본 포자충이 감염된 예가 있으므로 타 어종 및 유사 동물에 대한 감염의 발견 및 인위감염 등에 의한 숙주의 범위 및 그 유해성에 관한 연구가 필요할 것으로 사료된다(Richter et al. 2014). 뱀장 어는 국내의 주요 양식대상 종이므로 본 포자충에 감염 된 종묘 및 성어의 이동 시에는 질병의 확산속도가 빠를 수 있으므로 그 예방에 대한 대책이 필요하다. 그러므로 본 연구에서와 같이 원인충에 대한 PCR 방법에 의한 신 속 정확한 진단을 실시한다면 사전에 감염의 확산을 방 지할 수 있을 것으로 사료된다.

    포자충의 구제를 위한 치료약제에 관한 연구가 시도되 었으나, 약제의 가격이 비싸고 치료기간이 길어 효율성이 낮은 것으로 평가되고 있다(Kano and Fukui 1982a, b). Buchmann et al. (1992)은 극동산 뱀장어의 면역반응에 관한 연구에서 감염이 되지 않는 뱀장어는 선천적인 조 건 및 양어지 내에서의 항원에 대한 노출로 약한 체액 성 면역성을 가진다고 설명하였다. 이는 본 포자충의 감 염에 의한 폐사율이 낮은 점, 감염 증상이 천천히 나타나 는 등의 사실과 일치한다고 생각된다.

    적 요

    최근 뱀장어 양식장에서 사육 중이던 동남아산 뱀장어 에 몸통 근육의 요철현상을 나타내면서 폐사를 일으키는 질병이 발생하였다. 병어의 몸통 근육 내 환부는 흰색 또 는 황색으로 변해있었다. 병리조직학적인 변화는 근조직 내에 수많은 포자와 크고 작은 시스트들이 변형된 근육 근섬유 내에 관찰되었다. 병어의 근육 환부를 취하여 PCR을 실시하여 H. anguillarum이 가지는 특정 유전자인 Small subunit ribosomal RNA (SSU-rRNA)를 증폭하였다. 좀 더 정확한 동정을 위해 PCR product를 Cloning 후 Sequencing하여 서열들을 분석한 결과 H. anguillarum의 Small subunit ribosomal RNA (Gene bank accession number: AB623036) 서열과 일치하게 나타남을 확인할 수 있었다. primer 18F과 1537R의 PCR product는 약 1366 bp 길이가 일치하였으며, V1과 1392R를 이용한 PCR product는 1200 bp가 일치하게 나타났다. 또한 H1과 H2의 PCR product 의 경우는 800 bp 정도 일치하였으며 이의 서열은 나머 지 2개의 product가 공통적으로 가지고 있는 서열이었다. 이를 토대로 본 연구에서는 동남아산 뱀장어에 감염된 포자충은 H. anguillarum임을 동정할 수 있었다.

    Figure

    The young eel, A. bicolor pacifica, infected with H. anguillarum.

    The small or large spore stained with Loffler’s methylene blue solution.

    The normal (A) and abnormal (B) histological features in skin and muscle of sampled eel, A. bicolor pacifica. Ed+D: epidermis+ dermis, ML: muscle layer, *: the largest sporophorocyst.

    PCR amplication of H. anguillarum-infected shortfin eel, A. bicolor pacifica. M: marker, Lane 1: primers 18F and 1537R, Lane 2: primers V1 and 1392R, Lane 3: primers H1 and H2 used PCR resulted.

    Comparison of H. anguillarum Small subunit ribosomal RNA (Gene bank Accession Number AB623036) sequences and H1/H2 , 18F/ 1537R, V1/1392R PCR products sequences.

    Table

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