서 론

최근 기후변화에 의한 수온상승과 과다한 영양염류의 유 입으로 인한 부영양화로 대규모 유해조류 발생 (Harmful algal blooms, HAB)의 빈도와 정도가 증가하고 있다 (Paerl et al. 2001; Paerl and Huisman 2009). 이러한 HAB는 대부 분 Microcystis sp., Anabaena sp., Aphanizomenon sp. 등과 같은 남조류 (cyanobacteria)에 의해서 발생한다. 일반적으로 남조류는 불리한 성장환경에서 휴면포자 (akinete)를 형성하 며 성장환경이 개선되면 발아하는 특성을 가지고 있으며 영 양염류, 수온, 광량, pH 등의 환경인자에 영향을 받는다 (van Dok and Hart 1997; Ståhl-Delbanco et al. 2003; Park et al. 2014). 이러한 남조류들은 마이크로시스틴 (microcystins)이 나 아나톡신-a (anatoxin-a) 등의 조류독성물질을 분비하거나 식수의 이취미를 발생시키는 등 직접적인 환경문제를 발생 시킨다 (Watson et al. 2008; Li and Pan 2015). 유해조류 발생 시 상수도공급을 위한 정수처리 과정에서 여과지 폐색과 같 은 장애를 유발할 수 있고, 조류독성물질의 처리를 위한 상 수도 고도처리가 필수적임에 따라 정수처리 비용을 증가시 켜 경제적인 부담을 가중시킨다 (Steffensen 2008). 따라서 유 해조류 발생은 반드시 예방 및 처리되어야 한다.

유해조류의 발생 억제 및 제거를 위하여 과산화수소 (hydrogen peroxide), 오존처리 (ozone), UV처리 (UV irradation), 초음파처리 (ultrasonication), 상호대립억제작용물질 (alleochemicals), 여과 (filtration) 등의 물리, 화학적 처리방법이 개 발되어왔다 (Guan et al. 2014; Su et al. 2016). 그러나 이러한 물리, 화학적 처리방법은 화학물질의 직접적인 사용으로 인 한 환경 영향성과 2차 부산물의 생성, 고가의 시설투자비용 과 운전비용 등의 문제점이 있다 (Guan et al. 2014). 따라서 보다 친환경적이며 지속이 가능한 생물학적 유해조류 처리 방법이 주목을 받고 있다.

식물 (plants), 원생동물 (protozoa), 미세조류 (microalgae) 와 미생물 (microorganism) 등 다양한 생물자원이 생물학적 유해조류 처리를 위한 연구에 사용되었다. El Ella (El Ella et al. 2007)와 Zhou (Zhou 2010)는 쌀 짚과 보리 짚을 사 용한 조류발생 억제효과를 보고한 바 있다. Pedobacter나 Pseudomonas 종의 미생물은 유해조류인 M. aeruginosa에 대한 살조효과가 있다고 보고되었다 (Yang et al. 2012; Zhou et al. 2016). 또한, 일부 대형식물추출물의 유해조류의 성장 억제효과 역시 보고되었다 (Yang et al. 2009).

동물플랑크톤 (e.g. Daphnia sp.)을 이용한 유해조류 (남조 류) 억제의 경우, 동물플랑크톤이 섭취하기 어려운 남조류 의 군체 특성, 필수 영양소의 부족 및 동물플랑크톤의 성장 및 활동을 저해할 수 있는 2차 대사산물의 생성으로 인하여 적용이 어렵다고 알려져 있지만, 최근, 남조류 섭생에 대한 Daphnia의 적응성이 보고되고 있다 (Sarnelle 2007; Sarnelle et al. 2010). 따라서 본 연구에서는 동물플랑크톤인 D. magna 의 섭식활동을 통해 유해조류인 M. aeruginosa, A. variabilis, L. planctonica의 발생 억제효과를 평가하였다. 또한, D. magna의 2차 대사산물에 의한 유해조류 억제효과를 평가하였다.

재료 및 방 법

1.재료

NaNO₃, Citric Acid·H₂O, Na₂SiO₃·9H₂O는 Fisher Scientific Korea Ltd.에서 구매하였다. K₂HPO₄, MgSO₄ ·7H₂O, CaCl₂ ·2H₂O, Ferric Ammonium Citrate, Na₂EDTA·2H₂O, ZnSO₄ ·7H₂O, KCl, NaHCO₃, LiCl, RbCl, SrCl₂ ·6H₂O, NaBr, ZnCl₂, CoCl₂ ·6H₂O, Na₂SeO₃, NH₄VO₃, Cyanocobalamine, Biotin, Thiamine hydrochloride, FeSO₄ ·7H₂O는 Sigma- Aldrich Inc. (USA)에서 구매하였다. Na₂CO₃, H₃BO₃, MnCl₂ · 4H₂O, Na₂MoO₄ ·2H₂O는 JT Baker Chemical Co. (USA)에 서 구매하였다. CuSO₄ ·5H₂O는 MCiB Manufacturing Chemists Inc. (USA)에서 구매하였다. Co (NO₃)₂ ·6H₂O는 Mallinckroft Inc. (USA)에서 구매하였다. KH₂PO₄, CuCl₂ ·2H₂O는 Samchun Chemical Co. (Korea)에서 구매하였다. KI는 Daejung Chemical Co. (Korea)에서 구매하였다. M. aeruginosa 는 한국생명공학연구원으로부터 제공받았다. A. variabilis와 L. planctonica는 전라북도 전주에 위치한 덕진호수에서 채 취하였다. 동물플랑크톤 D. magna는 UMS-Carolina Biological Supply Company로부터 구매하였다.

2.균주의 채취 및 분리

호수에서 채취한 시료로부터 미세조류를 분리하기 위하여 다음과 같은 방법으로 균주를 분리하였다. 10 mL의 시료를 원심분리기 (Combi-514R, Hanil, Korea)를 이용하여 2,000 rpm, 4°C 조건에서 15분간 원심분리하고 상층액을 제거한 뒤 증류수를 사용하여 3회 세척하였다. 분리된 시료를 BG- 11 고체배지에 접종한 후 스프레더를 이용해 고르게 도포하 여 25°C, 50 μmol s^-2 m^-1 백색광에서 3일간 배양하였다. 플 레이트 상에 발현된 콜로니를 백금루프로 채취하여 12 well cell culture plate에 액체 BG-11 배지 4 mL와 함께 접종하고 25°C, 50 μmol s^-2 m^-1 백색광에서 7일간 배양하였다. 그 후 광학현미경을 이용하여 성장한 조류의 외형을 관찰하였고, 단일종으로 여겨지는 샘플을 BG-11 100 mL에 접종한 후 25 °C, 50 μmol s^-2 m^-1 백색광 하에서 배양하였다. 이때, 1 vvm 의 공기를 0.20 μm syringe filter로 여과하면서 공급해 주었다. D. Magna의 경우, M4 배지에서 25°C, 20 μmol s^-2 m^-1 백색 광 및 1 vvm의 공기 공급 하에서 배양을 진행했으며 이틀마 다 Chlorella vulgaris를 공급해 주었다. 사용한 BG11 배지와 M4 배지의 조성은 Table 1과 같다.

3.동물플랑크톤을 사용한 유해조류 제어

동물플랑크톤을 이용한 유해조류 제어는 살아 있는 동물 플랑크톤 (D. magna)을 유해조류에 접종한 후 세포 수 및 엽 록소의 변화를 측정하는 방법으로 진행했다. 먼저 250 mL 삼각플라스크에 0.05 g_dry L^-1의 유해조류를 가지는 BG11 배 지 20 mL와 80 mL의 M4 배지를 혼합시켰다. 이후 한 쪽 그 룹에만 D. magna 15개체를 넣어준 후 실험군과 대조군 모 두 23°C, 20 μmol s^-2 m^-1 백색광 및 1 vvm 공기 공급 하에 서 배양하였다. 2일과 6일 후 hemacytometer를 이용하여 M. aeruginosa의 세포 수를 측정하고, A. variabilis와 L. planctonia는 80% 아세톤과 비드 비터 (Minibeadbeater-16, Biospec products, USA)를 이용하여 엽록소를 추출하고 분광광 도계 (Genesys 10S UV-Vis, Thermo scientific, Germany)를 이용하여 다음의 식 (1)과 같이 계산하였다:

여기서 A₆₆₃과 A₆₄₆은 각각 663, 646 nm에서의 흡광도이다.

4.동물플랑크톤 대사산물/분비물의 유해조류 제어 평가

동물플랑크톤의 대사산물/분비물의 유해조류 제어 평가는 유해조류에 동물플랑크톤이 배양되었던 배지를 주입한 후, 세포 수 및 엽록소의 변화를 측정하는 방법으로 진행되었다. 250 mL 삼각플라스크에 0.05 g_dry L^-1의 유해조류를 포함하는 BG11 배지 20 mL를 넣어주었다. 이후 각 시료에 D. magna 15개체 및 M4 배지 80 mL, M4 배지 70 mL 및 동물플랑크톤 배양액 10 mL, M4 배지 70 mL 및 D. magna와 유해조류를 공생배양한 배지 10 mL를 각각 주입하였다. 배양 조건 및 성 장 측정은 유해조류 제어평가와 동일한 방법을 사용하였다.

결과 및 고 찰

1.균주의 분리, 동정

호수에서 채취한 샘플로부터 두 종의 개체를 분리할 수 있 었다. 18s rRNA 동정결과를 BLAST Search Program (NCBI) 을 사용하여 분석한 결과 분리된 균주는 Anabaena variabilis 와 Limnothrix planctonica에 상동성을 보였다.

2.D. magna의 남조류 제거효과

동물플랑크톤인 D. magna의 유해조류 M. aeruginosa, A. variabilis와 L. planctonica에 대한 제어 효율을 평가하기 위 하여 D. magna와 각 조류들을 공생배양 시킨 후, 2일과 6일 간 성장을 비교하였다 (Fig. 1). 유해조류의 성장 측정은 M. aeruginosa 경우 광학현미경 및 hemacytometer를 이용하여 전체 세포수를 측정하였고, A. variabilis와 L. planctonica는 형태학적인 특성상 직접적인 세포 수 측정 방법이 불가능 하여, 분광광도계를 이용하여 엽록소를 계산하는 방법을 통 하여 성장을 확인하였다. D. magna를 공생배양 시키지 않 은 경우, 모든 조류들은 배양이 진행됨에 따라 개체 수의 증 가를 보였다. M. aeruginosa (Fig. 1(A))는 배양 시작 2일 후, 6.45×10⁶ cell mL^-1의 개체 수를 보였으며 6일 후, 12.29× 106 cell mL^-1로 그 수가 약 2배 증가하였다. A. variabilis 와 L. planctonica의 경우 2일 후 각각 1.26과 2.06 mg L^-1의 엽록소가 검출되었고, 6일 후에는 각각 1.2배 (1.53 mg L^-1) 와 1.5배 (3.05 mg L^-1) 엽록소 양이 증가하였다. 반면에 D. magna와 공생배양을 시켰을 때, 각 조류의 개체 수가 대조 군에 비하여 감소하였다. 이는 공생배양 시 D. magna의 섭 생으로 인한 것으로 여겨진다. M. aeruginosa는 공생배양 후 2일과 6일에 각각 1.27×10⁶ cell mL^-1과 1.82×10⁶ cell mL^-1 의 개체 수를 보였으며 대조군과 비교하였을 때 개체 수가 약 4.5배와 6.5배 감소되었다. A. variabilis는 공생배양 2일 후, 0.76 mg L^-1의 엽록소 양이 검출되었으며 6일 후, 0.02 mg L^-1로 그 양이 큰 폭으로 감소하였다. L. planctonica는 공생배양 2일 후에 1.52 mg L^-1의 엽록소 양을 보였고 6일 후 2.36 mg L^-1로 검출되었다. 위의 결과를 종합하여 볼 때, D. magna는 A. variabilis와 M. aeruginosa에 대하여 억제효 과가 뛰어남을 확인할 수 있었고, L. planctonica에 대해서는 억제효과를 보이긴 하나 위의 두 종에 비하여 낮은 발생 억 제효과를 보였다.

3.유해조류에 대한 동물플랑크톤 유래 분비물질의 제어 효과

D. magna가 유해조류와 공생배양이 되는 동안 대조군과 다르게 조류의 침전을 관찰할 수 있었다 (Fig. 2). 이는 D. magna의 유해조류 섭생 이외에 배지 또는 D. magna가 배출 하는 대사/분비물질에 대한 영향으로 보여진다. 이러한 영향 을 확인하기 위하여 D. magna를 배양한 배지와 D. magna와 조류를 공생배양한 배지를 사용하여 유해조류 억제효과를 평가, 비교하였다. Fig. 3과 Table 2는 D. magna를 배양한 배 지와 공생배양한 배지를 주입한 후 평가한 조류성장 억제에 대한 결과이다. D. magna와 조류가 공생배양 될 경우, M. aeruginosa, A. variabilis 그리고 L. planctonica의 순서로 80.2±4.2, 39.7±4.0 및 25.9±10.9%의 제어 효율을 보였다. 또한, D. magna를 배양한 M4 배지 상층액을 주입했을 때, M. aeruginosa와 A. variabilis에 대하여 각각 24.9±9.9%와 8.9±4.9%의 제어 효율을 보였다. 하지만, 모든 종류의 조류 에서 D. magna와 조류의 공생배양 상층액은 제어 효과가 없 었다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때, D. magna는 M. aeruginosa, A. variabilis 그리고 L. planctonica의 발생을 제어할 수 있음을 확인하였다. 또한, 이러한 M. aeruginosa와 A. variabilis의 제어는 D. magna의 섭생과 D. magna가 생성하는 대사/분비물에 의하여 이루어지는 것으로 보인다. 반면, L. planctonica는 D. magna의 섭생에 의한 제어만 가능하였다.

대부분의 동물플랑크톤은 유해조류인 남조류에 의해서 생장 억제가 되는 것으로 알려져 있어 조류대발생 이후에 섭생에 의한 유해조류 제어에는 한계가 있다 (Scheffer and Rinaldi 2000). 하지만 동물플랑크톤 유래 물질을 통한 유해 녹조 제어는 조류대발생 이후에도 조류 제어에 응용이 가능 할 것으로 보인다. 따라서 대사/분비 물질 규명 결과에 따라 동물플랑크톤으로부터 유래한 대사/분비물을 이용한 녹조 제어는 효과적인 유해조류 제어 방안으로써 경쟁력을 가질 것으로 생각된다.

적 요

본 연구에서는 동물플랑크톤인 Daphnia magna를 이용하 여 유해조류인 Microcystis aeruginosa, Anabaena variabilis, Limnothrix planctonica에 대한 제어 가능성을 평가하였다. D. magna와 유해조류를 공생배양 시킨 경우, M. aeruginosa (80.2±4.2%), A. variabilis (39.7±4.0%) 그리고 L. planctonica (25.9±10.9%)의 순으로 조류 발생 억제효율을 보였 다. 동물플랑크톤의 섭생에 의한 조류 제어 효과 이외에 D. magna의 대사/분비물질의 조류 제어 가능성을 확인할 수 있 었다. D. magna를 배양한 배지를 유해조류 제어에 이용했을 때, M. aeruginosa와 A. variabilis에 대하여 각각 24.9±9.9% 와 8.9±4.0%의 성장 억제효과를 확인할 수 있었다. 하지만, L. planctonica에 대한 성장 억제효과는 나타나지 않았다. 본 연구의 결과를 통하여 동물플랑크톤인 D. magna를 활용한 친환경적 유해조류 제어기술 개발이 가능할 것으로 판단된 다.