서 론

포유류 암컷의 발정주기 (estrus cycle)는 생식호르몬의 분 비와 배란에 의한 주기적인 생리변화를 의미하며, 발정이란 교미가 가능한 생리적 상태를 의미한다. 포유류의 발정주기 는 환경과 신경내분비 인자 (neuroendocrine factors)에 의해 조절되는 시상하부 - 뇌하수체 - 난소주기의 상호조절작용으 로 이루어진다 (Mahoney et al. 2010).

난소호르몬, 에스트로겐 (estrogens)의 영향을 받는 질상피 는 발정기 동안 표층 세포층이 변화되면서 표층 상피세포의 각화와 박리가 일어난다. 이러한 세포층의 변화를 통해 가 장 간단하게 발정주기를 확인할 수 있는 방법이 질점막도말 법 (vaginal smear method)이다 (Organization for Economic Cooperation and Development [OECD] n.d. 2014). 각각의 단 계마다 나타나는 세포의 종류와 비율의 차이를 기본으로 하 여 발정전기 (proestrus), 발정기 (estrus), 발정후기 (metestrus), 발정휴지기 (diestrus)의 연속적인 4단계로 구분한다 (Akinloye and Oke 2010; Byers et al. 2012; Organization for Economic Cooperation and Development [OECD] n.d. 2014). 발정전 기와 발정기에는 에스트로겐이, 발정후기와 발정휴지기에 는 프로게스테론이 분비되어 순환적인 발정주기가 조절된다 (Wallen 1990; Mahoney et al. 2010).

생식생물학적 연구는 주로 랫 (rat), 햄스터 (hamster), 마우 스 (mouse) 등 실험동물을 대상으로 연구되어 왔으나, 최근 에는 생태적 지위가 낮은 종을 대상으로 개체수 유지를 통 한 생물다양성 증진을 목적으로 연구가 이루어지고 있다 (Merani and Lizarralde 1980; D’Andrea et al. 1996; Malekani et al. 2002). 비단털쥐 (Tscherskia triton)는 한국과 중국의 북 동부 지역 및 극동러시아 지역에만 서식하는 종으로 비단털 쥐과 (Cricetidae) 비단털쥐속 (Tscherskia)에 속하는 소형 설 치류이다 (Won 1964; Yoon et al. 2004; Han et al. 2011). 국내 에서는 Won (1964)에 의해 처음 보고된 이후 단편적인 포획 기록이 있을 뿐이다 (Kim et al. 2011; Koh et al. 2013; Park and Oh 2017). 최근 국내 비단털쥐에 관한 연구로는 분자 유전학적 연구 (Koh et al. 2013), 번식 및 성장과 발달 (Park and Oh 2017)에 대한 연구가 이루어졌으나 번식생물학적 연 구는 이루어진 바 없다. 일반적으로 같은 속 (genus)에 속하 는 종들의 발정주기 (estrus cycle)는 유사한 특징을 갖는 것 으로 알려져 있으나, 모든 포유류가 동일한 특징을 갖는 것 은 아니기 때문에 암컷의 발정주기와 행동학적 이해를 위 해 추가적인 정보를 얻기 위한 연구가 필요하다 (Conaway 1971; Smale et al. 2005). 이에 본 연구는 비단털쥐의 광주기 에 따른 발정주기 및 조직학적 특징을 밝혀 비단털쥐의 생 활사와 소형포유류의 생태를 이해하는 데 필요한 자료를 제 공하기 위하여 이루어졌다.

재료 및 방 법

1시료 채집 및 사육

연구에 이용된 비단털쥐는 제주특별자치도 한라산국립공 원 인근 관음사, 한화리조트, 별빛누리공원, 물장오리오름 지 역 등에서 2014년부터 2016년까지 3년간 매년 5월부터 11 월까지 매주 약 50~60개씩의 샤먼 생포트랩 (Sherman live trap, USA)과 재래식 철망 트랩을 설치하여 포획하였다. 트랩 은 하천 또는 건천이 있는 초목지와 관목림, 습지 등에 설치 하였고, 햄, 소세지, 어묵 등의 유인용 먹이를 사용하였다. 생 포된 암컷 6개체, 수컷 3개체는 온도 25~27℃, 습도 50~60 %, 광주기 16L : 8D이 유지되는 곳에서 사육하였고, 사료는 5L79 diets (PMI Nutrition, Brentwood, LA)와 물을 자율 공급 하였다 (Jackson and Van Aarde 2003; Yoon and Han 2004).

2배란주기 관찰

광주기 변화에 따른 배란주기의 조사는 야생 개체 (암컷 6 개체, 수컷 3개체)의 교배를 통해 태어난 F1 중 성성숙한 41 주령 암컷 3개체와 62주령 암컷 2개체를 대상으로 하였으며, 이 개체들은 각각 다른 케이지에서 사육하였다. 동일한 온 도와 습도 조건에서 광주기를 장일 광주기 (16L : 8D, longday photoperiod)와 단일 광주기 (8L : 16D, short-day photoperiod) 로 나누어 실험하였고, 광주기 변경 시 1주일 동안 적응 기간을 가진 후 30일 동안 관찰하였다. 매일 오전 9시 에 질구 (vaginal opening)를 디지털 카메라로 사진 촬영하 였으며, 질 내 세포구성의 변화를 관찰하기 위하여 질점막 도말법으로 실험하였다. 마이크로 스포이드를 사용하여 멸 균된 생리식염수 200 μL를 질 내에 주입 후 3~5번 정도 씻 어낸 액체를 멸균한 1.5 mL tube에 옮겼다. 슬라이드글라스 (Microscope slides, Paul Marienfeld GmbH & Co. KG)에 20 μL씩 도말하여 37℃ 가온판에서 건조 후, 95% ethanol로 고 정하여 상온에서 건조하였다. 헤마톡실린 (hematoxyline, 영 동제약)과 에오신 (eosin, Sigma Aldrich)으로 세포를 염색 (H&E staining)한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 소수의 유 핵세포 (nucleated cell)가 관찰되고, 많은 수의 백혈구 (leukocytes) 가 관찰되는 시기를 발정휴지기 (diestrus), 많은 유핵 세포 (nucleated cell)와 각질화된 편평 상피세포 (cornified epithelial cell)가 관찰된 시기를 발정전기 (proestrus), 각질 화된 편평 상피세포 (cornified epithelial cell)가 많고, 일부 는 덩어리져서 보이는 시기를 발정기 (estrus), 편평 상피세 포가 드물게 관찰되고 백혈구 (leukocytes)와 유핵 상피세 포 (nucleated epithelial cell)가 나타나는 시기를 발정후기 (metestrus)로 구별하였다 (Marcondes et al. 2002; Caligioni 2009; Byers et al. 2012).

3조직학적 관찰

난소와 자궁 조직의 관찰은 광주기 16L : 8D와 8L : 16D 조 건에서 사육 중인 성숙한 암컷 각각 5개체씩을 대상으로 실 험하였다. 적출한 난소와 자궁을 4% 포르말린에 고정한 후 파라핀으로 포매하였다. Microtome (LEICA RM2255)을 이 용하여 5 μm 두께로 절단한 후 헤마톡실린 (hematoxyline, 영 동제약)과 에오신 (eosin, Sigma Aldrich)으로 염색한 후 광학 현미경으로 관찰한 후 촬영하였다.

결과 및 고 찰

1배란주기와 질 세포의 변화

임신 경험이 없는 41주령 암컷 3개체와 62주령 암컷 2개 체를 대상으로 광주기 변화에 따른 질점막의 세포 변화를 관찰한 결과, 광주기가 16L : 8D일 때, 발정전기 (proestrus) 에는 둥글고 핵을 가지고 있는 많은 상피세포와 불규칙적 인 모양의 각질화된 편평 상피세포가 관찰되었다. 발정기 (estrus)에는 크고 불규칙한 모양의 상피세포들이 관찰되었 으며, 핵이 없는 각질화된 편평 상피세포 (large anucleated, cornified epithelial cells)가 대부분이었으나, 간혹 드물게 핵 이 있는 각질화된 편평상피세포 (large nucleated, cornified epithelial cells)가 관찰되었다. 발정후기 (metestrus)에는 핵이 없고 불규칙적인 모양의 각질화된 편평 상피세포의 수가 감 소하고, 백혈구와 크기가 작은 유핵 상피세포 (small nucleated epithelial cells)가 관찰되었다. 발정휴지기 (diestrus)에는 매 우 작은 다형핵 (polymorphonuclear)의 백혈구가 많이 관찰 되었으며, 매우 드물게 크기가 큰 유핵세포가 관찰되었다 (Fig. 1). 이러한 결과들은 Marcondes et al. (2002), Caligioni (2009), Byers et al. (2012) 등의 연구결과와 같이 각각의 단 계에서 관찰되는 세포의 종류는 유사하였다.

발정주기에 따른 각 단계별 질구 (vaginal opening)의 상 태를 관찰한 결과, 발정전기에는 질구가 열려 있고 (opened), 질점막이 약간 축축하였다. 발정기에는 질구가 열려있고 음 문 (vulva)의 음순 (labia)이 부어오른 상태가 확인되었다. 발 정후기와 발정휴지기에는 질구가 닫혀 있고 음문 (vulva)의 음순 (labia)은 부어있지 않았고, 질점막 표면에 흰색의 막 (whitish soft debris)을 관찰할 수 있었다 (Fig. 2). 이는 수 컷과의 교미로 인해 응고된 정액과 점액에 의해 생긴 질전 (vaginal plug)과는 다른 형태인데, 이는 발정기 이후에 생 기는 것으로 질구에 흰색의 막이 관찰되면 더 이상 번식 (breeding)이 이루어질 수 없다 (Croy et al. 2013)는 것을 예 시한다. 질 세포를 관찰하면서 간혹 발정전기는 관찰할 수 없었는데, 이는 가장 짧은 단계로서 관찰 시기에 따라 세포 구성의 변화만으로 정확히 구별하기가 어려운 단계이기 때 문이다. 따라서 발정전기 단계를 전후로 하여 늦은 발정휴 지기 - 이른 발정전기 (late diestrus-earyl proestrus) 또는 늦은 발정전기 - 이른 발정기 (late proestrus-early estrus)로 세분화 하기도 한다 (Cora et al. 2015).

실험을 통해 30일 동안 7~8번의 발정기가 발생하는 것으 로 확인되어 비단털쥐의 발정주기는 4~5일에 한번 일어나는 것으로 확인되었는데 (Fig. 3). 중국에서의 연구결과 (Zhang et al. 1999)인 3~4일과는 다소 차이가 있는 것으로 나타났다. 또한 데구과 (Octodontidae)에 속하는 Octodon degus의 발정 주기 3~4일과도 다소 차이가 있었으나 실험동물인 마우스 와 랫 (rat), 햄스터인 Siberian hamster (Phodopus sungorus) 의 발정주기 4~5일과는 유사하였다 (Labyak and Lee 1995; Marcondes et al. 2002; Vrooman and Young 2010; Croy et al. 2013). 그러나 다른 설치류인 붉은숲쥐과 (Nesomyidae) Cricetomys gambianus의 경우, 발정주기가 두 단계인 발정 기 (1.4~7.8일)와 발정휴지기로 구분되고, 발정주기는 3~15 일로 매우 불규칙적인 경우도 있다 (Malekani et al. 2002). 또한 쥐과 (Muridae) Apodemus sylvaticus는 3단계의 발정주 기를 가지며, 6~11일 주기로 반복된다 (Jonsson and Silverin 1997). 이처럼 같은 설치류라도 종에 따라 발정주기의 차이 가 있음이 확인된 바 발정주기는 비단털쥐의 종적특징을 보 여주는 한 가지 예라 할 수 있겠다.

일반적으로 번식기와 비번식기의 발정주기의 차이를 확 인하기 위하여 인위적으로 광주기를 조절하여 연구가 이루 어진다. 이때 장일 광주기 (long-day photoperiod)를 번식기 (breeding season), 단일 광주기 (short-day photoperiod)를 비 번식기 (non-breeding season)로 가정한다 (Galea et al. 1994). 동일한 암컷 5개체를 대상으로 인위적으로 광주기를 조절하 여 비번식기와 유사한 일조 환경을 만들어 준 후 질 세포 변 화를 관찰한 결과, 개체별 차이는 있었지만 42주령 암컷 2 개체는 1일부터 발정휴지기 상태를 유지하였고, 다른 한 개 체는 8일부터, 62주령 암컷은 6일과 12일부터 발정휴지기 상태를 계속 유지하여 발정주기 4단계를 확인할 수 없었다 (Fig. 3). Siberian hamster의 발정주기는 4~5일이지만, 광주 기를 조절하여 하루 12시간 이하 동안 빛에 노출될 경우 발 정휴지기 상태가 된다는 연구결과와 유사하였고, 12~14주 이상 짧은 광주기의 환경에 노출이 되면 배란이 되지 않거 나 배란 횟수가 감소하며, 난소의 무게, 성숙한 여포와 황체 역시 그 수가 감소한다 (Vrooman and Young 2010).

결론적으로 성숙한 비단털쥐 암컷 5개체의 발정주기는 4~5일임을 확인되었다. 일반적인 햄스터의 발정주기와 유 사하였고, 다른 설치류에 속하는 종에 비해 발정주기가 매우 규칙적이고, 짧은 것을 알 수 있었다. 장일 광주기일 때, 비단 털쥐 암컷의 발정주기는 비교적 규칙적으로 반복되는 것으 로 나타났으나, 단일 광주기에는 일정한 시기 이후 발정휴지 기 상태가 지속된다는 것을 확인할 수 있었다.

2생식기관의 조직학적 구조

비단털쥐의 난소와 자궁의 해부학적 구조는 두 개의 난소 (ovaries)와 짧은 나팔관 (oviducts)을 가지고 있으며, 긴 관 상구조의 자궁각 (uterine horns)은 두 개였다. 자궁각의 끝 부분에는 자궁경관 (cervix)이 있고, 자궁체 (uterine body)는 없었다 (Fig. 4). 이는 마우스, 햄스터와 유사한 구조이지만 (Suckow et al. 2012; Croy et al. 2013), 짧은 자궁체를 가지 고 있는 랫 (rat)의 한 종인 Cricetomys gambianus와는 구조 적 차이가 있는 것으로 나타났다 (Akinloye and Oke 2010).

난소와 자궁의 조직은 16L : 8D 광주기의 경우, 난소에서 1차 난모세포, 2차 난모세포, 잘 발달된 성숙난포와 황체 등 을 확인할 수 있었고, 두꺼운 자궁 내막에는 분비샘 (uterine glands)이 잘 발달되어 있었다 (Fig. 5). 그러나 광주기의 변 화를 주었을 때에는 난포강이 없는 2차 난모세포와 3차 난 모세포가 관찰되었고, 자궁의 두께는 얇았으며 자궁 내막에 있는 분비샘의 크기가 작아지는 것이 확인되었다 (Fig. 6). 이 는 인위적인 광주기 변화에 따른 결과로 자연상태에서의 번 식기와 비번식기에 따른 등줄쥐 (Apodemus agrarius) 난소와 자궁의 조직학적 특징과 유사하였다 (Yoon et al. 1997).

결론적으로 질점막도말법으로 확인한 결과, 비단털쥐의 발정주기는 4~5일 주기로 반복되고, 다른 설치류에 비하여 주기가 짧고, 광주기에 따른 발정주기의 변화와 난소와 자궁 의 조직학적 차이가 있다는 것을 확인할 수 있었다. 비록 대 상 개체수가 작아 연구의 한계점이 있음에도 광주기 변화에 따른 명확한 발정주기와 생식기관의 조직학적 변화가 분명 하다는 것은 주목할 만한 결과라 할 수 있다. 따라서 향후 충 분한 암컷 개체를 대상으로 24Light, 24Dark 등 다양한 광주 기에 따른 발정주기 연구 및 세포수 측정, 호르몬 측정과 같 은 연구가 병행된다면 서식환경이 발정주기에 미치는 영향 을 확인할 수 있을 것이라 판단된다. 또한 암컷 발정주기의 변화는 광주기뿐만 아니라 생체리듬 (circadian activity), 심 부체온 (core temperature), 먹이량, 활동량, 수컷과의 접촉 등 에 의해서도 영향을 받을 수 있다 (Wallen 1990; Mahoney et al. 2011). 따라서 인위적인 온도 변화, 먹이량 조절, 암컷 의 활동량 차이, 수컷 비단털쥐와의 접촉 시간 등 다양한 조 건에서의 연구는 비단털쥐의 기본적인 번식생물학적 특징 을 밝힐 수 있는 단서가 될 수 있다. 비단털쥐는 전 세계적으 로 국한된 지역에서만 서식하기에 연구된 결과도 매우 미흡 한 실정이다. 국내에서는 환경부 지정 관심대상종 (LC)으로 취급되고 있음에도 불구하고 일부 지역에만 분포하기 때문 에 단편적인 관찰 기록이 있을 뿐 종 다양성 유지에 필요한 생태나 번식생물학적 연구자료는 거의 없는 실정이다. 따라 서 본 연구는 비단털쥐의 번식생물학적 측면에서 볼 때 매 우 의미 있는 결과라 이후 생물학적 측면에서 종적 특징을 밝히는 자료로 제공되어 생물종 다양성 유지에 널리 활용될 것이다.

적 요

비단털쥐 (Tscherskia triton)는 중국 북부와 한국, 극동러 시아 지역 등 국한된 지역에 분포하며, 번식, 성장과 발달 및 분포에 관한 정보는 알려져 있으나 발정주기와 생식기관에 관한 번식생물학적 연구는 거의 연구된 바 없다. 이에 본 연 구는 제주도에서 포획된 개체를 사육하면서 광주기에 따른 암컷 비단털쥐의 생식주기 및 생식기관의 특징을 밝혀 비단 털쥐의 번식생물학적 정보를 제공하고자 진행하였다. 연구 결과, 평소 사육환경 (16L : 8D)에서의 비단털쥐 발정주기는 4~5일이었고, 발정 단계는 발정전기, 발정기, 발정후기, 발정 휴지기의 4단계로 구분되었다. 광주기 8L : 16D 환경에서 비 단털쥐의 발정주기는 6~12일째부터 발정휴지기 상태가 계 속 유지되었다. 광주기에 따른 비단털쥐 생식기관의 조직도 차이를 보였다. 16L : 8D 경우에는 발달된 난소 내에 다수의 성숙 난포와 황체가 관찰되었고, 자궁내막도 두껍고 분비샘 도 잘 발달되어 있었으나 8L : 16D 조건에서는 원시난포와 제2차, 3차 난모세포가 관찰되고 얇은 자궁내막과 발달되지 않는 자궁분비샘을 확인하였다. 이에 따라 광주기에 따른 비 단털쥐의 생식주기 변화와 난소와 자궁의 조직학적 차이를 확인하였다. 이 결과는 비단털쥐의 번식생물학적 측면에서 매우 중요한 단서가 되는 자료이기에 생물종 다양성 유지를 위한 자료로 널리 활용될 것이라 판단된다.