서 론

잉어과 (Cyprinidae) 납자루아과 (Pisces: Acheilognathinae) 어류는 몸이 납작하고 체고가 높은 소형 담수어류로서 전 세계에 약 40여종이 보고된 바 있으며 (Bogutskaya and Komlev 2001; Damme et al. 2007), 그 중 우리나라에는 2 속 14종이 기록되어 있다 (Kim and Park 2002). 납자루아 과 어류는 담수산 석패과 (Bivalvia: Unionidae) 패류의 아가 미 안에 산란하는 독특한 생물학적 특징을 가지고 있다 (de Wit 1955). 수컷은 산란시기에 화려한 혼인 색을 띠며, 숙 주조개 주위에서 자신의 영역을 방어하고, 암컷은 긴 산란 관을 발달시켜 숙주조개의 아가미 안에 난을 산란한다. 산 란 직후 수컷은 숙주조개의 아가미에 자신의 정자를 방출하 고, 숙주조개의 호흡에 의해 조개 속으로 정자가 옮겨지며, 조개 내에서 난의 수정이 일어난다 (Smith et al. 2004). 수 정이 이루어진 뒤 약 3~6주 발생과정을 거친 후 유영능력 을 획득하게 되면 조개 밖으로 이동하여 독립된 생활을 한 다 (Uchida 1939; Aldridge 1999). 이러한 독특한 번식 행동 (reproductive behavior)을 가진 담수어류 종은 생활사 초기 단계가 숙주조개에 전적으로 의존되기 때문에 서식처 환경 에 숙주조개 개체 수 감소 시 멸종위기 가능성이 높아진다 고 보고되었다 (David et al. 2010).

최근 인간의 인위적인 간섭에 의한 오염 및 하천사업으 로 납자루아과가 숙주로 이용하는 석패과 패류의 개체수 가 급격히 감소하고 있으며, 이로 인해 납자루아과의 개체 수가 전 세계적으로 감소하고 있는 추세이다 (Bogan 1993; Watters 1996). 우리나라 또한, 총 4종의 납자루아과 어 류 종인 한강납줄개 (Rhodeus pseudosericeus), 임실납자루 (Acheilognathus somjinensis), 묵납자루 (A. signifer) 및 큰줄 납자루 (A. majusculus)가 야생생물 보호 및 관리에 관한 법 률 시행규칙 (2017년 12월 29일 개정)에 근거하여 멸종위기 야생생물 I·II급으로 지정되어 보호받고 있으며, 한국의 멸 종위기 야생생물 적색 자료집 (Red Data Book)에서는 위기 (EN; endangered)종, 준위협 (NT; near threatened)종 및 관심 대상 (LC; least-concern)종으로 포함되어 있다 (NIBR 2011).

국내의 경우 납자루아과 담수어류에 대한 산란양상을 파 악하기 위한 생태학적 연구가 진행된 바 있으나, 난 및 치어 의 동정을 위해 발생과정을 형태적으로 확인하여 종 동정 을 수행하였다고 보고된 바 있으며 (Kim et al. 2013, 2014), 아직 유전학적인 방법을 이용한 숙주조개 속 난 및 치어에 대한 종 판별 연구는 수행되지 않았다. 따라서, 본 연구에서 는 PCR (polymerase chain reaction) 기반 RFLP (restriction fragment length polymorphism; 제한절편 길이 다형성) 분자 기법을 이용하여 홍천강 지류인 덕치천 (북한강수계)에 동서 하고 있는 납자루아과 어류 3종 묵납자루, 줄납자루 및 각시 붕어의 난 및 치어를 대상으로 정확한 동정을 수행하여 납 자루아과 담수어류의 산란양상을 보다 정확히 규명하고 향 후 이들 자연개체군의 효과적인 유지, 관리 및 보전 방법 개 발에 활용할 수 있는 과학적 기초 데이터를 제공하고자 하 였다.

재료 및 방 법

1. 연구대상 지역

연구대상 지점의 선정은 납자루아과 담수어류가 2종 이상 동서한다고 알려져 있으며, 과거 문헌조사 결과 개체수가 풍 부한 하천을 기준으로 선정하였다. 연구대상 지역인 덕치천 (Fig. 1)은 한강대권역, 한강수계, 북한강, 홍천강 본류로 유 입되는 지류이며, 덕치천의 하류는 환경부에서 수행한 제3 차 전국자연환경조사 (덕치천 유역의 담수어류)결과 본 연구 대상종인 납자루아과 어류 묵납자루 (A. signifer)와 줄납자루 (A. yamatsutae)가 다수 분포한다고 알려져 있다.

Sampling Site: 강원도 홍천군 동면 덕치리 덕치천 (N 37°41ʹ52.98ʺ, E 127°55ʹ41.72ʺ)

2. 재료 및 방법

1) 납자루아과 담수어류의 난 및 치어확보

납자루아과 담수어류의 난 및 치어의 확보를 위해 본 연 구 대상종의 산란시기에 대한 문헌조사를 수행하였고 (Song 2004; Baek 2005; Kim et al. 2015), 조사결과 덕치천 일대의 납자루아과 어류의 산란시기가 겹치는 5월~6월에 시료채집 을 실시하였다. 현지 어류정량조사 결과 기존 문헌으로 확인 된 묵납자루 (A. signifer)와 줄납자루 (A. yamatsutae)가 서식 하고 있는 것을 확인하였으며, 같은 납자루아과에 속하는 각 시붕어 (R. uyekii)가 추가적으로 관찰되었다. 따라서, 묵납자 루, 줄납자루 및 각시붕어 3종을 대상으로 본 연구를 수행하 였다.

납자루아과 어류의 숙주조개로 알려진 작은말조개 (Unio douglasiae sinuolatus)의 채집은 현장에서 주로 손으로 채 집하였으며, 어류의 채집은 투망 (망목 7×7 mm)과 족대 (망 목 5×5 mm)를 이용하였다. 문헌조사 결과 묵납자루가 출현 한다고 보고된 바 있어 법정보호종인 묵납자루의 포획은 원 주지방환경청의 포획허가 (2015-17, 2017-10)를 취득한 후 조사를 진행하였으며, 어류의 동정은 기존에 발표된 검색표 (Kim 1997; Kim and Park 2002)의 분류 체계에 따라 동정하 였다. 채집된 납자루아과 어류의 동정은 추후 실험실에서 숙 주조개 내 육안으로 확인된 난 및 치어의 잠재적인 대상 종 을 파악하는데 이용하였다.

채집된 납자루아과 어류는 현장에서 동정하고 사진촬영 후 기록하고 방류하였다. 채집된 숙주조개는 각각 1개체씩 test tube (50 mL, Falcon^TM, Fisher Scientific, USA)에 넣어 99% 에틸알코올에 고정 후 실험실로 운반하였고, 실험실로 운반된 숙주조개의 아가미 속 난 및 치어를 추출하여 99% 에틸알코올이 들어있는 micro-centrifuge E-Tube (1.5 mL)에 넣어 보관하였다. 채집된 33개 숙주조개 내 총 161개의 난 및 치어가 확인되었으며, 제한효소를 선정하기 전 난과 치어 의 동정을 위해 육안으로 식별 가능한 크기와 모양이 다른 31개체를 무작위로 선별하여 미토콘드리아 DNA COI과 cyt b 유전자 염기서열을 분석한 결과, 묵납자루 8개체, 줄납자루 4개체 및 각시붕어 19개체로 문헌 및 현지조사 시 확인된 3 종이 모두 관찰되었다.

2) Genomic DNA 추출 및 미토콘드리아 DNA PCR (Polymerase Chain Reaction)

Genomic DNA의 추출은 채집한 난 및 치어의 일부 대 략 2 mm를 절단하여 G-spin Total DNA Extraction Kit (INTRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 추출하였으며, 추출된 DNA의 확인은 fluorometer (Invitrogen, USA)를 이 용하여 DNA의 농도를 확인 후 실험에 이용하였다.

미토콘드리아 DNA의 COI (cytochrome oxidase I)과 cyt b (cytochrome b) 유전자를 대상으로 PCR을 통해 유전자 증폭 실험을 수행하였으며, 기존 연구에서 어류를 대상으로 개발 된 primers를 이용하였다 (Ivanova et al. 2007; Chang et al. 2014).

사용된 primer 뉴클레오티드 (nucleotide) sequences (5ʹ-3ʹ) 는 다음과 같다.

PCR 반응은 sterilized water 8.9 μL, 10X Green buffer (Thermo Scientific Inc., USA) 1.5 μL, forward/reverse primers 0.5 μL, dNTP (Bio Basic Inc., Canada) 1.5 μL, Taq Polymerase (Thermo Scientific Inc., USA) 0.1 μL 및 genomic DNA 2 μL를 사용하여 총 15 μL로 수행하였고, PCR 증폭은 2720 thermal cycler (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 COI 유전자의 경우 94℃에서 2분간 초기 변성 (denaturation) 후 94℃에서 30초간 denaturation, 52℃에서 40초간 결합 (annealing), 72℃에서 1분간 신장 (extension) 반응을 35회 반복하였으며, 이후 72℃ 10분으로 최종 extension 후 증 폭을 완료하였다. Cyt b 유전자의 경우 94℃에서 4분간 초 기 변성 후 94℃에서 1분간 denaturation, 55℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 반응을 35회 반복하였 으며. 이후 72℃ 5분으로 최종 extension 반응 후 증폭을 완 료하였다.

3) RFLP (restriction fragment length polymorphism) 실험

RFLP 분석을 위해서 NCBI (national center for biotechnology information)의 GenBank로부터 문헌 및 덕치 천 현지조사 결과 관찰된 묵납자루 (A. signifer), 줄납자루 (A. yamatsutae) 및 각시붕어 (R. uyekii)의 미토콘드리아 DNA COI과 cyt b 유전자 염기서열을 확보한 후 (GenBank Accession Nos.: HQ536266.1, HQ536281.1, HQ536507.1, KF410748.1, and EF483937), Bioedit ver. 7.2.5을 이용하 여 Clustal W 분석을 통해 각각 종별로 특이 단일염기변이 (Single Nucleotide Variation; SNV)를 가진 염기서열을 확인 하였다. 염기서열 분석 결과, 묵납자루의 cyt b와 줄납자루와 각시붕어의 COI 유전자의 경우 종 내 개체 간 염기서열 변 이 수준이 높아 제한효소 선정에서 제외하였다. 제한효소의 선정은 ‘Restriction enzyme digest of DNA’ (San Millán et al. 2013)에서 제공하는 제한효소 검색 프로그램에 각각 종별 특이 염기서열을 입력한 후 각 제한효소 최소 인식 서열 크 기 (minimum recognition size for each restriction enzyme)는 “4”로 설정하여 이용하였다. 종 동정을 위한 RFLP 마커로 결정된 제한효소는 Apal I (GʹTGCA_C), Stu I (AGGʹCCT) 및 EcoR V (GATʹATC)로 총 3개의 제한효소 (Enzynomics, Korea)를 이용하였으며, Apal I 효소의 경우 묵납자루 미토 콘드리아 COI의 유전자 부위 (660 bp)에서 217 bp 부분을 절 단하였고, 나머지 2종의 경우 절단되는 부분이 없었다. Stu I 효소의 경우 줄납자루 미토콘드리아 cyt b의 유전자 부위 (1140 bp)에서 143 bp 부분을 절단하였고, 각시붕어의 경우 절단되는 부분이 없었다. EcoR V 효소의 경우 각시붕어는 동일한 유전자 부위 (1140 bp)에서 413 bp 부분이 절단되었 고, 줄납자루는 절단되는 부분이 존재하지 않았다 (Fig. 2).

RFLP 실험은 sterilized water 10 μL, buffer (Apal I, Stu I - 1X EzBuffer IV, EcoR V - 1X EzBufferIII) 1 μL, restriction enzyme (10 units μL^-1) 0.2 μL 및 PCR products 5 μL로 총 16.2 μL의 양을 반응시켰고, 2720 thermal cycler (Applied Biosystems)를 이용하여 37℃에서 약 3~4시간 반응하였 다. 반응이 완료된 산물은 1.2%의 Agarose gel로 약 20분 간 전기영동을 수행하였으며, 100 bp DNA Ladder (INtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 각각 밴드의 위치를 확인 하였다 (Wolf et al. 2000).

결과 및 고 찰

1. PCR-RFLP 실험을 이용 전기영동을 통한 종 판별

납자루아과 어류인 묵납자루 (A. signifer), 줄납자루 (A. yamatsutae) 및 각시붕어 (R. uyekii) 3종에 대한 유전자부 위, PCR product의 크기 (bp), 제한효소 처리 후 얻은 DNA 단편 길이의 크기 (bp)와 위치를 파악한 결과 묵납자루 (A. signifer)의 경우 미토콘드리아 COI 부위를 대상으로 PCR한 결과 총 660 bp에서 제한효소 Apal I에 의해 GʹTGCA_C의 염기서열이 위치한 217 bp 부분을 인식하여 절단하였고, 줄 납자루의 경우 미토콘드리아 cyt b 부위를 대상으로 PCR한 결과 총 1140 bp에서 제한효소 Stu I에 의해 AGGʹCCT의 염 기서열이 위치한 143 bp 부분을 인식하여 절단하였으며, 각 시붕어의 경우 미토콘드리아 cyt b 부위를 대상으로 PCR한 결과 총 1140 bp에서 제한효소 EcoR V에 의해 GʹTGCA_C 의 염기서열이 위치한 412 bp 부분을 인식하여 절단하였다 (Table 1; Fig. 3).

PCR-RFLP 실험은 각각 종별로 최소 10개체 이상 수행하 였고, 제한효소처리 이후 전기영동 결과 묵납자루의 경우 미 토콘드리아 COI 부위에서 Apal I효소에 반응하여 2개의 밴 드가 확인되었으며 (lane B), 나머지 줄납자루와 각시붕어는 Apal I효소에 반응 하지 않고 1개의 밴드가 나타났다 (lane C, D) (Fig. 3). Apal I효소의 처리로 묵납자루 종 개체를 식별 한 후 나머지 개체들을 대상으로 추가적인 PCR-RFLP 실험 을 수행하였고, 그 결과 줄납자루의 경우 미토콘드리아 cyt b 부위에서 Stu I효소에 반응하여 2개의 밴드가 확인되었으며 (lane E), 나머지 각시붕어는 효소에 반응하지 않고 1개의 밴 드가 나타났다 (lane F). 각시붕어의 경우 동일한 미토콘드리 아 cyt b 부위에서 EcoR V효소에 반응하여 2개의 밴드가 확 인되었으며 (lane H), 줄납자루는 효소에 반응하지 않고 1개 의 밴드가 나타났다 (lane G) (Fig. 3).

기존에 선행된 연구의 경우 납자루아과 어류가 동서할 때 난 및 치어의 동정을 위해 직접 패트리디쉬에서 인공 수 정시킨 후 발생과정을 기록하여 형태적으로 확인하는 방법 으로 종 동정을 수행하였다고 보고된 바 있으며 (Kim et al. 2014), 본 연구에서는 같은 서식처에 동서하는 3종의 납자 루아과 어류인 묵납자루, 줄납자루 및 각시붕어 난 및 치어 를 대상으로 유전자 염기서열 분석을 통해 각각 종별로 특 이성을 가진 염기서열을 확인하여 종별 특이 단일염기변이 (SNV)를 이용하여 제한효소를 선정하였고, 선정된 제한효 소를 통하여 각각 3종 어류의 난 및 치어의 동정을 성공적으 로 수행하였다.

RFLP 분자기법의 이용은 어류뿐만 아니라 식물과 균류의 DNA 지문검색 (DNA fingerprinting) 방법으로 오랜 기간 동 안 널리 이용되고 있으며 (Weising et al. 1994), 최근 한국산 전복 속 (Haliotis) 4종에 대한 종판별 방법으로도 효과적으 로 적용된 바 있다 (Kang 2017). 이러한 방법은 연구 대상 생 물 종 개체의 특정 유전자부위를 모두 DNA 염기서열 결정 (sequencing) 없이 개발된 RFLP 마커를 이용 실험실에서 유 전자 증폭 후 간단한 제한효소처리만으로 비교적 저비용, 단 시간에 정확한 종 동정을 수행할 수 있다는 점에서 효율성 이 있어 오랜 기간 동안 사용되고 있다.

본 연구 결과를 바탕으로 RFLP 분자기법을 이용하여 납 자루아과의 난 및 치어에 대한 종판별 결과, 문헌 및 현지 조사 시 확인되었던 3종의 납자루아과 어류가 전기영동 밴 드 상 모두 뚜렷하게 종간 차이가 나타났다 (Fig. 3). 본 연구 에서 새로이 개발된 RFLP 마커는 기존 연구에서 사용된 난 및 치어 대상 형태적으로 종을 확인하는 방법보다 좀 더 빠 르고 효과적이며 정확하게 3종을 판별할 수 있으나, 우리나 라에 현재 서식하고 있는 납자루아과 어류 2속 14종의 모든 염기서열을 비교 분석하여 개발된 분자마커는 아니기 때문 에 본 연구에서 개발된 제한효소마커는 묵납자루, 줄납자루 및 각시붕어 3종에 국한되며 향후 본 연구방법을 적용하여 납자루아과 어류 2속 14종에 대한 RFLP 마커가 개발될 경 우 우리나라에 서식하는 납자루아과 전체 어류종의 산란 양 상, 번식생태 및 행동을 이해하는데 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

적 요

본 연구는 PCR 기반 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한절편 길이 다형성) 분자기법을 활용하 여 난 및 치어 대상 납자루아과 어류 3종의 동정을 좀 더 빠 르고 정확하게 파악하고 납자루아과 어류의 종별 산란양 상 및 번식생태 이해에 대한 기여가 목적이다. 본 연구를 위 해 기존 선행된 문헌자료를 확인하고 납자루아과 어류가 2 종 이상 동서하고 있는 지역을 확인하여 현지조사를 수행 하였다. 현지조사 결과 확인된 납자루아과 어류는 묵납자루 (Acheilognathus signifer), 줄납자루 (A. yamatsutae) 및 각시 붕어 (Rhodeus uyekii)로 총 3종이 확인되었으며, 확인된 납 자루아과 어류와 동서하고 있는 숙주조개 (작은말조개; Unio douglasiae sinuolatus)를 채집하여 숙주조개 속 납자루아과 어류의 난 및 치어를 확보하였다. 현지조사 결과 확인된 납 자루아과 어류 3종을 대상으로 미토콘드리아 DNA COI과 cyt b 유전자 염기서열을 비교하여 각각 종별로 특이성을 지 닌 부위 (단일염기변이; Single Nucleotide Variation: SNV)에 맞는 제한효소를 선정하였고, 숙주조개 속 난 및 치어를 대 상으로 genomic DNA를 추출하여 PCR-RFLP 실험을 수행 한 결과 현지조사 시 확인된 납자루아과 어류 3종의 독특한 제한절편 길이 양상을 전기영동을 통하여 확인하였다. 본 연 구를 통해 묵납자루, 줄납자루 및 각시붕어의 종을 판별할 수 있는 RFLP 마커를 개발하였으며, 숙주조개 난 및 치어를 대상으로 정확한 종의 동정을 보다 빠르고 효과적으로 수행 하여 각각 납자루아과 종별 산란양상을 보다 정확히 규명하 고 향후 이들 자연개체군의 효과적인 유지, 관리 및 보전 방 법 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.