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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean J. Environ. Biol. Vol.37 No.3 pp.372-379
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2019.37.3.372

Toxic evaluation of phenanthrene and zinc undecylenate using the population growth rates of marine diatom, Skeletonema costatum

Ju-Wook Lee, Hoon Choi, Yun-Ho Park, Yoon Lee, Seung Heo, Un-Ki Hwang*
Marine Ecological Risk Assessment Center, West Sea Fisheries Research Institute, National Institute of Fisheries Science, Incheon 22383, Republic of Korea
Corresponding author Un-Ki Hwang Tel. 032-745-0680 E-mail. vngi1@korea.kr
02/09/2019 16/09/2019 16/09/2019

Abstract


We evaluated the toxic effects of phenanthrene (PHE) and zinc undecylenate (ZU) on the population growth rate (r ) of the marine diatom, Skeletonema costatum. The r of S. costatum was determined after 96 hrs of exposure to PHE (0, 25, 50, 100, 200 and 300 mg L-1) and ZU (0, 5, 10, 15, 20 and 25 mg L-1). The results showed that r in the control (the absence of PHE and ZU) was greater than 0.04, while r in the treatment groups decreased with increasing PHE and ZU concentrations. PHE and ZU were shown to reduce r in a dose-dependent manner, with significant decreases occurring at concentrations above 50 and 10 mg L-1, respectively. The EC50 values of r in PHE and ZU exposure were 136.13 and 16.95 mg L-1, respectively. The no observed effect concentrations (NOEC) were 25 and 5 mg L-1, and the lowest observed effect concentrations (LOEC) were 50 and 10 mg L-1. These results indicated that concentrations of greater than 50 mg L-1 of PHE and 10 mg L-1 of ZU in marine ecosystems induced a toxic effect on the r of S. costatum. These results can serve as useful baseline data for the establishment of safety concentrations of PHE and ZU in marine ecosystems.


phenanthrene , zinc undecylenate , marine diatom , toxicity

해산규조류 (Skeletonema costatum)의 개체군 성장률을 이용한 phenanthrene와 zinc undecylenate의 독성평가

이 주욱, 최 훈, 박 윤호, 이 윤, 허 승, 황 운기*
국립수산과학원 서해수산연구소 자 원환경과 해 양생태위해평가센터

초록

    National Fisheries Research and Development Institute
    R2019025

    서 론

    인류의 생산 및 소비활동으로 인한 각종 오염원의 유입 이 해양오염의 상당부분을 기여하는 것으로 알려져 있으 나 (Reddy et al. 2005;Lee et al. 2017), 최근에는 해상 및 어로 활동에 의해 발생되는 유류 및 방오도료 (antifouling paints; AFPs)와 같은 유기물질에 의한 오염이 증가하는 추세다 (Martinez-Llado et al. 2007). 국제해사기구 (International Maritime Organization; IMO)는 유기오염물질의 농도를 저감하기 위하여 선박활동으로 유입되는 유류 유출 규 제를 강화시키고 있고 (Martinez-Llado et al. 2007), 독성 이 높은 방오도료의 사용을 점진적으로 금지하고 있지만 (Jacobson and Willingham 2000;Hwang et al. 2018), 이미 해 양환경으로 유입된 유류 및 방오도료는 해양환경 내 잔류 할 수 있기 때문에 지속적으로 해양생물에게 영향을 미칠 것으로 판단된다 (Stronkhorst and van Hattum 2003;Hwang et al. 2018).

    유류 유출사고 및 화석연료 연소 과정에서 발생하는 다 환방향족탄화수소류 (polycyclic aromatic hydrocarbons; PAHs)는 유류기원의 대표적인 오염물질로 수많은 화합물 이 존재하지만 naphthalene, benzopyrene 및 phenanthrene (PHE)과 같이 대부분의 구성성분이 독성이 높다고 알려 져 있다 (Chiapusio et al. 2007). 특히 PHE는 난분해성 물질 로 해양환경 내에서 다른 PAHs 보다 고농도로 존재하며, 생물 체내에 축적되어 해양생물의 대사 및 생존에 영향을 미칠 수 있다 (Shin and Kim 2003;Wu et al. 2013). 또한, 내분 비교란물질 (endocrine disruptors)로 밝혀져 IMO에서 사용 이 금지된 TBT (tributyltin)을 대체하기 위해 신방오도료로 cuprous oxide (Cu2O)와 copper thiocyanate (CuSCN)를 기 반으로 copper pyrithione (CP), zinc pyrithione (ZP), zineb, ziram 및 zinc undecylenate (ZU)와 같은 금속계와 irgarol, diuron, sea-nine 211 (SN) 및 chlorothalonil (CN)과 같은 비 금속계를 혼합하여 사용하고 있다 ( Jung 2012;Shin et al. 2015;Soroldoni et al. 2017;Amara et al. 2018). 현재 신방오 도료에 대한 생물영향 평가가 수행되고 있지만, ZU는 다른 방오도료에 비해 상대적으로 독성이 낮아 많은 연구가 수 행되고 있지 않다 (Lin et al. 2006;Hwang et al. 2018). PHE와 ZU 같은 유기오염물질은 해상활동이 빈번한 항구 주변에 서 높은 농도로 검출되며 (Lam et al. 2017), 대도시와 인접 한 연안에서 주변의 항구 및 수로보다 최고 200배 이상 높 게 보고된 사례가 있다 (Kim et al. 2008). 또한 해안선이 복 잡한 서해와 남해연안에서 신방오도료의 평균농도가 증가 하고 오염지역이 확대되는 것으로 보고되고 있다 (Lee et al. 2011;Lee et al. 2015). PHE와 ZU 같은 유기오염물질은 연 안에 서식하는 다양한 생물에게 영향을 줄 것으로 예상되 며 (Hwang et al. 2017, 2018), 직·간접적으로는 인류에게도 영향을 미칠 것으로 예상된다.

    본 연구는 해양생태계 내에서 생산자를 대표하며, 우리 나라 전 연안역에서 우점하는 식물플랑크톤인 Skeletonema costatum의 개체군성장률 (r)을 이용하여, 해양환경공정 시험법 해양생물공정시험기준 (MOF 2018)에 따라 PHE 와 ZU의 독성평가를 실시하였다. 또한, 무영향농도 (No Observed Effective Concentration; NOEC), 최소영향농도 (Lowest Observed Effective Concentration; LOEC) 및 반수 영향농도 (50% Effective Concentration; EC50)를 제시해, 이 들 유기오염물질에 대한 해양환경기준을 설정하기 위한 기초자료로 활용하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1. 시험생물

    시험생물은 해산규조류 S. costatum (Greville) Cleve이며, 한국해양미세조류은행 (Korean Marine Microalgae Culture Center; KMMCC)에서 분양받아 항온실에서 6개월 이상 계대배양하였다. 배양온도는 20.0±1.0°C, 광량은 형광등 을 이용하여 3,000~4,000 Lux, 광주기는 10 Light : 14 Dark 를 유지하며 f/2 배지 (Lananan et al. 2013)로 배양하였다.

    2. 유기오염물질 농도조성

    시험에 사용한 PHE (phenanthrene 98%, Sigma-aldrich, USA)과 ZU (zinc undecylenate 98%, Sigma-aldrich, USA) 는 DMSO (Demethylsulfoxide, Sigma-aldrich, USA)에 녹여 100,000 mg L-1의 stock solution으로 제조하였다. 시험용액 제조에 사용된 DMSO의 최대농도는 0.3%로 예비실험을 통하여 S. costatum의 성장에 영향을 미치지 않는 것을 확인 하였다 (Okumura et al. 2001). S. costatum 개체군성장률에 미 치는 유기오염물질의 영향을 살펴보기 위하여, PHE와 ZU 의 stock solution을 멸균된 자연해수로 희석하여 사용하였 다. 유기오염물질의 노출 농도는 예비실험을 통하여 PHE 은 0, 25, 50, 100, 200 및 300 mg L-1, ZU 는 0, 5, 10, 15, 20 및 25 mg L-1로 조성하였다.

    3. 배양조건

    50 mL test tube에 농도별로 조성한 시험용액을 각각 30 mL씩 분주하였고 시험은 대조구를 포함한 6구간, 각 농도 당 3반복으로 실시하였다. S. costatum의 세포수를 계수하여 초기 세포농도가 약 5,000 cell mL-1이 되도록 시험용액에 접종하고 f/2 배지를 540 μL 첨가하였다. 배양조건은 조도 3,000~4,000 Lux, 온도 20.0±1.0°C에서 96시간 배양하였으 며, 자세한 배양조건은 Table 1에 나타냈다 (MOF 2018).

    4. 개체군 성장률 측정

    96시간 배양 후 S. costatum의 r 을 계산하기 위해 fluorometer (Tuner Designs Model 10-AU, USA)를 이용하여 각 각의 test tube의 형광량을 측정하였다. 식물플랑크톤의 r (specific population growth rate)은 형광량으로 계산된 엽록 소 농도를 회귀방정식 (형광량=세포밀도)을 이용하여 세 포밀도로 환산한 후 아래와 같은 계산식으로 도출하였고, 대조구의 r 이 0.04 이상일 경우에 유의한 시험결과로 사용 하였다 (MOF 2018).

    r =(lnN t  -lnN 0 )/t

    • r=개체군 성장률, Nt=실험종료 후의 세포밀도,

    • N0=초기세포밀도, t=배양시간

    5. 통계학적 분석

    대조구와 시험구의 유의성 검정은 SigmaPlot software (SigmaPlot 2001, SPSS Inc., USA)의 Student’s t-test로 비교 하였으며 p가 0.05 이하일 때 유의한 시험결과로 판단하 였다. S. costatum의 개체군성장률에 대한 EC50과 95% 신 뢰구간 (95% confidence limit; 95% CI)은 ToxCalc software (ToxCalc 5.0, Tidepool scientific software, USA)의 probit 통계법을 이용하여 분석하였고, NOEC와 LOEC는 동일 software의 Dunnett’s test를 사용하여 분석하였다.

    결 과

    1. PHE가 S. costatum 의 r 에 미치는 영향

    PHE가 S. costatum의 r 에 미치는 영향은 Fig. 1에 나타 냈으며, 대조구의 r 은 0.04 이상으로 해양환경공정시험 법 해양생물공정시험기준 (MOF 2018)에 부합하였다. S. costatum의 r 은 최소농도인 25 mg L-1에서는 0.041±0.002 로 대조구와 유의한 차이가 없었으나, 그 이상의 농도에서 는 PHE가 증가할수록 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 50 mg L-1 농도에서 r 이 유의적 (p<0.01)으로 감소 하기 시작하여, 100 mg L-1 농도에서는 r 이 0.028±0.002로 대조구 대비 34%, 200 mg L-1에서 r 이 0.017±0.005로 61% 감소하였으며, 실험 최고농도 300 mg L-1에서는 r을 관찰 할 수 없었다 (Fig. 2).

    2. ZU가 S. costatum 의 r 에 미치는 영향

    ZU가 S. costatum의 r 에 미치는 영향은 Fig. 3에 나타냈 으며, 대조구의 r 은 0.04 이상으로 시험기준에 부합하였다. S. costatum의 r 은 ZU 농도가 증가할수록 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였고, 10 mg L-1 농도에서 r 이 0.040± 0.001로 대조구 대비 유의적 (p<0.05)으로 감소하기 시작 하여, 15 mg L-1 농도에서 r 이 0.033±0.001로 대조구 대비 21%, 20 mg L-1에서 r 이 0.006±0.001로 87%로 급격하게 감 소하였으며 최고농도 25 mg L-1에서는 r 을 산출할 수 없었 다 (Fig. 4).

    3. S. costatumr 을 이용한 PHE와 ZU의 독성평가

    PHE와 ZU에 노출된 S. costatum의 r 은 노출농도에 표 준독성반응인 Sigmoid 형태를 나타냈다 (Fig. 5). PHE 에 대한 S. costatumr 의 NOEC와 LOEC는 각각 25, 50 mg L-1, EC50은 136.13 mg L-1, EC50의 95% Fiducial limits는 85.90~198.28 mg L-1으로 나타났다. ZU에 대한 S. costatumr 의 NOEC와 LOEC는 각각 5, 10 mg L-1, EC50은 16.95 mg L-1, EC50의 95% Fiducial limits는 15.73~18.47 mg L-1로 나 타났다 (Table 2).

    고 찰

    PAHs는 화석연료를 구성하는 다양한 유기화합물 중에 서 반휘발성탄화수소 (semi-volatile hydrocarbons) 화합물 에 포함되며, 미국환경보호청 (US EPA)에서는 PAHs 중에 서 16종을 특별관리 대상물질로 지정하였다 (Ribeiro et al. 2012). PAHs는 주로 유류 유출 및 화석연료의 연소와 같 은 인위적인 활동을 통해서 해양환경으로 유입되며, 유 류에서 기원하는 PAHs는 PHE를 가장 많이 포함하고 있 다 (Achten and Hofmann 2009;Ribeiro et al. 2012). PHE는 성게 (Psammechinus miliaris)에서 난모세포의 성장과 성숙 을 억제하여 생식기능에 영향을 주고 (Schäfer and Köhle 2008), zebrafish의 경우에는 망막세포의 성장을 방해하여 망막발달 장애를 일으켰으며 (Huang et al. 2013), human B-lymphoblastoid cell line의 MCL-5에서는 돌연변이 유발 가능성 (Sasaki et al. 1997)을 나타내 생식, 성장, 유전변이 등 다양한 수준에서 생물독성을 나타낸다. TBT를 대체하 기 위해 사용되고 있는 신방오도료는 표적생물 이외의 해 양환경 및 다른 생물에게 독성 영향을 나타내지 않은 것 이 이상적이지만 (Nakanishi 2007;Antizar-Ladislao 2008;Oliveira et al. 2017;Zecher et al. 2018), 살생물제 (biocide) 특 성상 비표적 생물에게도 일부 독성 영향이 나타나는 것으 로 알려져 있다 (Jung et al. 2017). ZU는 신방오도료 중에서 도 가장 독성이 낮다고 알려져 있지만 (Lansdown 1991;Lin et al. 2006;Hwang et al. 2018), ZU를 구성하는 물질 중 Zn은 방오도료 입자에서 Cu 다음으로 가장 많이 검출되는 중금 속으로 해산로티퍼 (Brachionus plicatilis)의 r 을 억제할 수 있 으며 (Hwang et al. 2014;Soroldoni et al. 2017), undecylenate 의 항균작용으로 가시파래 (Ulva prolifera)의 포자 운동성 을 억제할 수 있는 것으로 알려지고 있다 (Jung 2012).

    본 연구결과 S. costatum의 r 은 PHE와 ZU의 농도가 증 가할수록 농도의존적 감소하는 경향을 보였으나, PHE 에 노출된 S. costatumr 의 EC50은 136.13 mg L-1로 녹조 류 (Pseudokirchneriella subcapitata)와 클로렐라 (Chlorella fusca)보다 PHE의 독성영향을 적게 받았다 (Altenburger et al. 2004;Baun et al. 2008;Turcotte et al. 2011;Zindler et al. 2016). ZU에 노출된 S. costatumr 의 EC50은 16.95 mg L-1로 zinc pyrithione (ZP)과 copper pyrithione (CP)과 같은 다 른 방오도료에 비해서 상대적으로 독성이 낮다고 판단된 다 (Fernandez-Alba et al. 2002;Onduka et al. 2010;Jung et al. 2017). 하지만 이온화된 undecylenate의 영향으로 박테리 아 (Bacillus subtilis)에서 독성영향은 ZP>Ziram>ZU>CP 순서로 ZU가 CP보다 약 두 배 정도 독성이 강한 것으로 나타나 ( Jung 2012), 생물 종에 따른 독성의 특이성도 나 타나는 것으로 판단된다. PHE와 ZU 같은 유기오염물질 은 노출초기에 물리·화학적인 요인으로 미세조류에 흡착 되며, 세포밀도가 높을 때 넓은 표면적으로 유기오염물질 이 더 빠르게 흡착하는 것으로 알려져 있으며 (Hong et al. 2008), 초기 흡착 이후 세포 내로 흡수되어 축적 및 분해과 정에서 미세조류 세포벽의 구성 및 효소와 같은 종 특이적 인 차이로 인해 흡수, 축적 및 독성영향이 차이가 나타나 는 것으로 알려져 있다 (Chan et al. 2006). 따라서, 본 실험 에 사용한 S. costatum과 같은 미세조류의 독성범위가 다양 하게 나타나는 이유는 PHE와 ZU 같은 유기오염물질을 대 사과정에서 제거할 수 있어, 특정 유기오염물질에 대해 내 성을 가질 수 있기 때문으로 판단된다 (Tam et al. 2002).

    우리나라는 3면이 바다이며 전체 인구의 35% 이상이 해 안에 근접하여 생활하지만, 주로 산업단지 및 항구 지역에 서 환경조사가 이루어지고 있다 (Kim et al. 2002). 특히, Yim et al. (2007) 연구에 따르면 우리나라 전국 117개 해안의 퇴 적물을 분석한 결과 PAHs 농도가 8.80~18,500 ng g-1 dry weight으로 분석되었고, 선박 및 해양활동을 통해서 방오 도료 입자가 지속적으로 해양환경으로 유출되어 서해와 남해에서 TBT를 제외한 방오도료의 농도가 지속적으로 증가하는 것으로 알려지고 있다 (Song et al. 2005;Lee et al. 2011, 2015;Soroldoni et al. 2017). 또한, Zn은 항구 및 조선 소 주변 퇴적물에서 Cu와 더불어 가장 높게 검출되며, 이 들 금속은 방오도료의 독성을 증가시킬 수 있는 것으로 알 려지고 있다 (Cedergreen 2014;Soroldoni et al. 2017). 따라 서, 연안역에 존재하는 PAHs와 신방오도료는 잔류 및 축 적되어 해양생물에게 지속적인 영향을 미칠수 있기 때문 에 수질, 퇴적물 및 생물체내 상시 모니터링과 더불어 다 양한 생물을 이용한 독성평가가 필요하다고 판단된다.

    적 요

    해산규조류 (Skeletonema cosatatum)의 개체군성장률 (r) 을 사용하여 연안 유기오염물질인 phenanthrene (PHE) 과 zinc undecylenate (ZU)의 독성평가를 실시하였다. S. costatum을 PHE (0, 25, 50, 100, 200, 300 mg L-1)와 ZU (0, 5, 10, 15, 20, 25 mg L-1)에 각각 96시간 노출한 이후에 r 을 산 출하였고, 대조구의 r 은 0.04보다 높아 시험기준에 적합하 였다. S. costatum의 r 은 PHE 50, ZU 10 mg L-1 이상의 농도 에서 대조구 대비 유의하게 감소하기 시작해 PHE와 ZU 의 농도가 증가할수록 감소되는 농도의존성을 나타냈으 며, 최고농도인 300과 25 mg L-1 농도에서는 r 이 나타나지 않았다. PHE와 ZU에 노출된 S. costatumr 의 반수영향농도 (EC50)은 136.13, 16.95 mg L-1, 무영향농도 (NOEC)는 25, 5 mg L-1, 최소영향농도 (LOEC)는 50, 10 mg L-1로 나타났다. 본 연구결과, 해양생태계 내에서 S. costatum의 r 은 PHE 50 mg -1, ZU 10 mg L-1 이상의 농도에서 독성영향으로 감소할 것으로 판단되며, PHE와 ZU의 기준농도 설정을 위한 기 초자료로 유용하게 사용될 것이다.

    사 사

    본 연구는 2019년도 국립수산과학원 경상과제 (R20 19025) 연구비 지원으로 국립수산과학원 서해수산연구소 해양생태위해평가센터에서 수행하였다.

    Figure

    KJEB-37-3-372_F1.gif

    Representative images of cell density of Skeletonema costatum exposed at different concentrations (0, 25, 50, 100, 200, and 300 mg L-1) of phenanthrene.

    KJEB-37-3-372_F2.gif

    Change in population growth rates in Skeletonema costatum exposed to phenanthrene. Vertical bars represent means±SD for three replicates. **indicates statistical significance at p<0.01 compared to control.

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    Representative images of cell density of Skeletonema costatum exposure at different concentrations (0, 5, 10, 15, 20 and 25 mg L-1) of zinc undecylenate.

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    Change in population growth rates in Skeletonema costatum exposed to zinc undecylenate. Vertical bars represent means ±SD for three replicates. * and ** indicate statistical significance at p<0.05 and p<0.01, respectively, compared to control.

    KJEB-37-3-372_F5.gif

    Concentration-response curves for the effects of phenanthrene (A) and zinc undecylenate (B) on population growth rate in Skeletonema costatum.

    Table

    Experimental culture condition of Skeletonema costatum

    Toxicity evaluation using population growth rate in Skeletonema costatum exposed to phenanthrene and zinc undecylenate

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    Vol. 40 No. 4 (2022.12)

    Journal Abbreviation 'Korean J. Environ. Biol.'
    Frequency quarterly
    Doi Prefix 10.11626/KJEB.
    Year of Launching 1983
    Publisher Korean Society of Environmental Biology
    Indexed/Tracked/Covered By

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