서 론

해산송사리 (marine medaka, Oryzias dancena)는 담수 와 기수에 서식하는 최대 전장이 3.1 cm에 이르는 소형 어 류로, 인도, 방글라데시, 스리랑카, 미얀마 및 태국 등지에 서 서식한다 (Abraham 2011). 본 종은 전장 약 3 cm 정도 의 소형이고, 미립자 시판사료나 먹이생물인 brine shrimp (Artemia salina)의 nauplus로도 수월한 사육 (Lim et al. 2012;Im et al. 2016), 담수에서 해수까지에 이르며 사육 가 능한 광역성 (euryhaline) (Inoue and Takei 2003;Kang et al. 2008;Cho et al. 2010a), 손쉬운 산란유도 및 인공수정 (Lim et al. 2012;Im et al. 2016), 부화 후 2~3개월에 생식 가담 가능함 (짧은 generation time) (Lim et al. 2012) 및 암·수 성 적이형 (sexual dimorphism)이 명확함 (Im et al. 2016)으로 인해 한국에서는 실험동물인 일본송사리 (O. latipes)와의 관련 연구에 있어 그 특성이 비견하거나 월등하다고 가치 성이 인식되어 우수한 실험동물로 각광받고 있다. 이와 같 은 연유로서 Institute of Marine Living Modified Organisms (iMLMO)에서 living modified organism (LMO) evaluation project의 검증 model animal로 선정·연구된 바 있다 (Cho et al. 2010a, b, 2012;Im et al. 2016).

실험동물로서 가치성을 지닌 해산송사리를 대상으로 한 유도 3배체 관련 연구로는 유도 3배체와 2배체와의 세포 및 핵 크기 비교 (Goo et al. 2015), 성장과 생식소 성숙 비 교 (Park et al. 2016a), 세포유전학적 연구 (Park et al. 2016b), 유도 3배체에서의 amitosis-like 핵분열 현상 (Park and Choi 2018), 배수화와 sex에 따른 비대칭 (Park and Gil 2018) 및 유도 3배체의 계측형질 특성 (Park et al. 2018)이 보고된 바 있다.

어류에서의 3배체 (triploid)는 자연계에서도 발견되며, 수산양식 산업에서는 어류 유도 3배체가 생식세포분열 (meiosis)시 상동염색체의 짝짓기의 이상에 기인되어 배 우자를 형성하지 못함으로 인해 그 기능적 불임의 효과를 이용하고 있다 (Thorgaard 1983;Yoo et al. 2018). 이와 같은 수산양식 대상 어류 유도 3배체는 그 자체의 불임으로 인 한 생식에 사용되는 에너지를 체성장으로 재회수 함으로 써 성적 성숙기나 산란기에 2배체에 비해 지속적인 성장 을 보이며, 수산양식 산업의 관점에서 불리한 요소인 어류 2배체에서 나타나는 식욕 감퇴, 사료효율 감소, 육질 감소 및 1회 산란 후 사망하는 연어과 어류나 은어 (Plecoglossus altivelis)의 산란 후 사망을 방지할 수 있는 방편으로 어 류 3배체가 유도되고 있다 (Thorgaard 1983;Park and Kim 1994;Kim et al. 1994;Kim et al. 2001;Goo et al. 2015;Yoo et al. 2018). 아울러 어류 유도 3배체 기법은 생산된 유도 3 배체의 불임으로 인해 외래 유입종이나 LMO의 자연수계 로의 탈출로 인한 수계 생태계로의 오염을 제거하거나 감 소시키는 효과적인 방편으로도 사용되고 있다 (Kim et al. 1994;Dunham and Devlin 1999;Cho et al. 2012).

유세포분석기 (flowcytometry)는 유액 상태의 세포 집 단을 대상으로 세포 크기, 세포 내부 조성 정도, 세포주기 (cell cycle) 분석 및 세포 기능 인지 등과 같은 한 세포가 갖는 여러 특징을 분석 가능하다 (Vanparys et al. 2006). 최 근 기기 발전, 환산 방법 개선과 향상된 시약 기능 등으로 유세포분석기는 DNA함량 분석에 그 사용 효과의 장래성 을 보이고 있다 (Estevam et al. 2011). 최근, Gil et al. (2017) 은 2배체와 유도 3배체 메기 (Silurus asotus)의 꼬리지느러 미 조직과 아가미 조직을 대상으로 세포주기를 조사, 분석 비교한 결과, 메기 2배체와 유도 3배체 조직에서의 세포주 기가 유의한 차이를 보인다고 보고한 바 있다. 본 연구는 해산송사리 2배체와 유도 3배체에서의 세포주기를 유세 포분석기를 사용하여 꼬리지느러미, 간 및 아가미 각 조직 별 비교하여 그 차이를 2배체, 유도 3배체 및 조사된 각 조 직들에서의 생리적인 물질대사 측면에서 분석·논의하고 자 한다.

재료 및 방법

해산송사리 (Oryzias dancena) 유도 3배체는 Goo et al. (2015)의 방법에 의거 수정 후 45분에 4°C의 수온으로 수정난을 2분간 처리하여 생산하였다. 이후, 유도 3배체 처리군과 2배체군은 Park et al. (2011)의 방법으로 사육 하였으며, 부화 후 3개월에 유 세포분석기 (PA-II, Partec, Germany)로 3배체 처리군을 대상으로 배수화 분석 후 유 도 3배체를 선별하였다. Park et al. (2011)의 해산송사리 마 취법을 기준으로 100 ppm의 clove oil (85% eugenol 포함; Sigma, St. Louis, MO, USA)로 2배체와 유도 3배체군에서 의 각 개체들을 마취 후 꼬리지느러미 끝 일부분 조직을 표본하였다. 표본된 각 꼬리지느러미로부터의 106개 세포 를 모아서 상온, 암조건으로 15분간 high-resolution DNA staining kit (Partec, GmbH, Germany)로 염색하였다. 염색 된 각 세포들은 유세포분석기로 상대적 DNA 함량을 파악 하여 유도 3배체를 선별하였다.

부화 1년 후 해산송사리 2배체군과 유도 3배체군을 대 상으로 100 ppm clove oil로 마취 후 꼬리지느러미, 간 및 아가미 조직을 각각 채취하였다. 표본된 꼬리지느러미, 간 및 아가미 조직은 10 mL의 냉 70% ethanol (Sigma, St. Louis, MO, USA)로 고정 후 부유된 세포들은 30 μm로 여 과 후 4°C에서 냉장보관 하였다. 해산송사리 2배체군과 유도 3배체군의 각 개체로부터의 10⁶개의 세포들을 highresolution DNA staining kit로 상온, 암조건 하에서 15분 간 염색하였다. 세포주기 파악을 위하여 유세포분석기로 해산송사리 2배체군, 유도 3배체군 세포 집단에서의 gap 1 (G₁), synthesis (S) 및 gap 2+mitosis (G₂+M)기의 백분 율을 각각 계산하였다. 각 실험군 간 유의성 차이는 SPSS (Spss 9.0, SPSS Inc. Chicago, IL, USA)로 Student’s t-test (n=20, 3반복 실험, p<0.05) 검증하였다.

결과 및 고찰

세포주기에 관한 대부분의 유세포분석기 기법은 G₁, S 및 G₂+M기에 세포들의 분포에 의해 결정된다 (Dean and Jett 1974). Fig. 1과 Fig. 2는 2배체와 유도 3배체 해산송사 리 (Oryzias dancena)의 꼬리지느러미 조직, 간 조직 및 아 가미 조직의 histogram을 각각 나타낸 것으로 background correction도 나타나 있다. Fig. 1에서 나타나듯이 해산송사 리 2배체 세포의 G₁, S 및 G₂+M기 해당 빈도는 꼬리지느 러미 조직, 간 조직 및 아가미 조직에서 80.5%, 12.6%, 6.9% 과 79.0%, 8.9%, 12.0% 및 78.2%, 14.5%, 6.7%를 각각 보였 다. Fig. 2에서 나타나듯이 해산송사리 유도 3배체 세포의 G₁, S 및 G₂+M기 해당 빈도는 꼬리지느러미 조직, 간 조 직 및 아가미 조직에서 89.6%, 4.6%, 5.8%와 84.0%, 10.4%, 5.6% 및 80.2%, 11.7%, 8.1%를 각각 보였다.

꼬리지느러미 조직과 비교 시 간 조직과 아가미 조직은 G₁, S 및 G₂+M기 그리고 2배체 유도 3배체에서 유의한 차이를 보였다 (p<0.05) (Table 1). 유도 3배체 각 조직들 은 2배체 각 조직들에 비해 세포주기 각 단계에서 Park et al. (2016b)의 결과와 동일하게 DNA함량 증가 경향을 보 였으며, 세포주기를 고려 시 G₂+M기에서 2배체는 유도 3 배체에 비해 1.3~1.4배를 보이고 특히, 조사된 조직 중 아 가미 조직은 1. 4배의 높은 G₂+M기 분포를 보였다 (Table 1). Gil et al. (2017)은 메기 (Silurus astous) 2배체와 유도 3 배체를 대상으로 유세포분석기를 사용하여 꼬리지느러미 조직과 아가미 조직에서 본 실험과 같은 세포주기를 조사 한 결과, 본 실험과 유사한 세포주기 경향을 보고한 바 있 다. 메기 2배체와 유도 3배체의 모든 각 조직, 각 세포주기 에서 본 실험 결과와 동일하게 꼬리지느러미 조직의 세포 분포 비율이 아가미 조직의 세포 분포 비율에 비해 유의 하게 낮게 나타나서, 꼬리지느러미 조직이 아가미 조직, 간 조직에 비해 세포분열이 낮음을 보였다 (Gil et al. 2017).

어류에서 2배체에 대한 유도 3배체의 본 연구 결과 와 같은 낮은 세포분열 경향은 여타 연구에서는 낮은 물 질대사에 기인된 다양한 생리현상으로 나타나, 산천어 (Oncorhynchus masou) 유도 3배체는 2배체에 비해 적혈 구 수는 감소되고 여러 혈액 성상은 높게 나타나고, 산소 소비량 및 호흡율에 있어 높은 값을 보인 바 있다 (Park and Kim 1994;Park and Park 1995). 이런 현상은 미꾸라지 (Misgurnus mizolepis)와 미꾸리 (M. anguillicaudatus)의 잡 종 3배체화시 유도된 잡종 3배체는 3배체화에 기인되어 이들의 잡종에 비해 적혈구 세포 및 핵 크기, 망막 내과립 층 horizontal cell 핵 크기, 망막신경절 신경세포층의 신경 세포, 시개과립층의 신경세포 핵 및 trunk kidney 2차 근위 뇨세관 세포 및 핵 크기에서 증가한 반면, 망막 외과립층 수와 2차 근위뇨세관 핵 수에서는 감소를 보였다 (Park and Kim 2000). 이와 유사하게, 2배체에 대비한 유도 3배체의 낮은 생리현상은 메기 유도 3배체에서도 나타나, 메기 유 도 3배체는 메기 2배체에 비해 적혈구 수는 감소된 반면, 여러 혈액 성상과 호흡 빈도에서 높은 수치를 보였으며, 낮은 혈장 cortisol과 glucose 농도를 보인 바 있다 (Seol et al. 2008;Lim et al. 2017, 2018;Lee et al. 2018). 이와 같이 어 류 3배체에서 세포 크기 증가에도 불구하고 그 세포 수 감 소와 이에 따르는 여러 낮은 생리 현상은 어류 3배체화시 배수화에도 불구하고 거대화 (gigantism) 효과가 나타나지 않는 이유이다 (Ueno 1984;Sezaki et al. 1988;Park and Park 1995). 이와 더불어 Wolters et al. (1982)와 Lincoln and Bye (1984)가 지적했듯이 어류 유도 3배체는 3배체화시 정상 2배체에 대비한 유도 3배체 자체의 유전물질 증가 (염색체 배수화: 돌연변이)에 따른 shy함에 따라 불가피하게 2배체 와 유도 3배체를 혼합사육시 유도 3배체가 2배체와의 먹 이경쟁에서 뒤쳐지기 때문에, 이를 극복하기 위해 3배체 유도 시 높은 3배체 유도율이 필요한 이유이기도 하다.

본 연구에 사용된 실험어 해산송사리 유도 3배체는 이 미 Park et al. (2016a)이 보고한 연구 결과, 생식소숙도 지 수, 생식소의 조직학적 조사, testosterone과 estradiol-17β의 성호르몬 수준에서 불임을 보이며 아울러, 그 불임 정도가 수컷보다는 암컷에서 현저함을 보인 바 있다. 이와 같이 해산송사리 유도 3배체는 명확한 불임을 보이고는 있으 나, 해산송사리 2배체에 비해 망막을 구성하는 각 층에서 크게 나타나며 망막의 outer layer cell nucleus 수는 2층으 로 2배체의 3층에 비해 그 수가 적었으며 (Goo et al. 2015), 비정형 적혈구 출현 빈도가 높았고 (Park and Choi 2018), fluctuating asymmetry (발생 비대칭성)이 높게 나타난 바 있다 (Park and Gil 2018). 본 연구 결과, 해산송사리 유도 3 배체는 2배체에 비해 세포주기가 늦어 생리적으로 지연됨 을 보였으며, 세포주기 분석에 사용시 꼬리지느러미보다 는 간 조직 및 아가미 조직이 세포분열 활성이 높아 꼬리 지느러미보다는 간 및 아가미의 조직이 세포주기 분석에 더욱 유리함을 알 수 있었다. 본 연구와 더불어 어류 유도 3배체의 세포주기와 연관된 물질대사 측면에서의 차후 부 가적인 생리학적 연구가 필요하리라 사료된다.

적 요

해산송사리, Oryzias dancena 2배체와 유도 3배체 각 조 직에서의 세포주기를 비교, 분석하였다. G₁, S, G₂+M기의 분포 빈도에서 꼬리지느러미인 경우 2배체에서는 85.8%, 7.6% 및 6.9%이었으며 유도 3배체에서는 91.2%, 3.6% 및 5.2%이었다. 간 조직인 경우 2배체에서는 78.4%, 10.6%, 및 11.0%이었으며 유도 3배체는 86.2%, 5.9% 및 7.9%이었다. 아가미 조직인 경우 2배체에서는 79.3%, 9.4% 및 11.3%이 었으며 유도 3배체는 85.7%, 5.4% 및 8.9%이었다. 2배체와 유도 3배체에서 조직 간 세포 주기 빈도에서 유의한 차이 가 있었다 (p<0.05). Mitosis (체세포분열)은 유도 3배체에 비해 2배체가 더욱 활성이 있었으며, 이러한 체세포분열 은 2배체와 유도 3배체 모두에서 꼬리지느러미 조직 보다 는 간 조직과 아가미 조직에서 더욱 왕성하였다.