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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean J. Environ. Biol. Vol.38 No.4 pp.518-527
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2020.38.4.518

Toxic effects of new anti-fouling agents (diuron and irgarol) on the embryogenesis and developmental delay of sea urchin,
Hemicentrotus pulcherrimus

Hoon Choi1,2, Yun-Ho Park1, Ju-Wook Lee1, Ki-Young Kwon1, Un-Ki Hwang1,*
1Marine Ecological Risk Assessment Center, West Sea Fisheries Research Institute, National Institute of Fisheries Science
(NIFS), Incheon 22383, Republic of Korea
2Department of Life Science, Incheon National University, Incheon 22012, Republic of Korea
*Corresponding author Un-Ki Hwang Tel. 032-745-0680 E-mail. vngi1@korea.kr
13/10/2020 17/10/2020 21/10/2020

Abstract


The aim of this study was to define the toxic effects of diuron and irgarol, which are new-antifouling agents, on the fertilization rate and normal embryogenesis rate in the sea urchin, Hemicentrotus pulcherrimus. In addition, the study was intended to confirm the hindrance of development in sea urchins. The fertilization rate of H. pulcherrimus was not decreased by the tested concentrations. However, the normal embryogenesis rate was decreased in a concentration-dependent manner. The 50% effective concentrations (EC50) of normal embryogenesis rate were 7.12 mg L-1 and 2.31 mg L-1, respectively. As the embryos developed into pluteus larvae, after 18 h of exposure to diuron and irgarol at EC50, development of the early gastrula stage was delayed, and significant developmental delays were observed after 24 h. After this, continuous developmental delays were observed in the process leading to the early gastrular, gastrular, early pluteus, and pluteus stages. Therefore, the toxic effects of diuron and irgarol on sea urchins were attributed to the delay in the developmental processes in the early life stages. Diuron and irgarol are highly persistent in the environment and have known-well toxic effects on various marine organisms including invertebrates, as shown in this study. Therefore, it is urgent to establish an environmental protection strategy to prevent the pollution of and preserve the marine environment.



신규방오도료물질 (Diuron, Irgarol)이 말똥성게 (Hemicentrotus pulcherrimus)의 배아발생과 지연에 미치는 독성영향

최 훈1,2, 박 윤호1, 이 주욱1, 권 기영1, 황 운기1,*
1국립수산과학원 서해수산연구소 해 양생태위해평가센터
2국립인천대학교 생명과학과

초록


    National Fisheries Research and Development Institute(NFRDI)
    R2020027

    서 론

    다양한 생물로 인하여, 선박이나 양식 시설물을 포함 한 해양구조물에 생기는 경제적 손실을 막기 위하여 사 용되던 트리부틸주석이나 트리페닐주석과 같은 유기주 석 화합물 (Tributyltin; TBT)은, 1960년대 이후 급격한 사 용으로 해양생물에게 다양한 영향을 미치는 것으로 알 려져 있다 (Kim and Park 2001;Dubey and Roy 2003;Cho 2011;Dafforn et al. 2011;Han 2012). 국제해사기구 (IMO; International Maritime Organization)에서는 2003년부터는 사용금지, 2008년에는 선체 잔존금지 등의 사용 규제로 인 해 유럽을 중심으로 Copper (I) salt, Copper oxide (Cu2O) 와 Thiocyanate (CuCHNS), Zinc pyrithione (ZnPT)와 같 은 유기금속 방오도료 물질들이 개발되어 사용되어 왔으 나, 생물위해성이 지적되면서 (Karlsson et al. 2010;OSPAR 2010;Ytreberg et al. 2010;Cima and Ballarin 2012), 현재는 Diuron, Irgarol, Chlorothalonil, Dichlofluanid, Sea-nine 211 과 같은 비금속 유기방오도료 물질들이 개발되어 사용되 고 있다 (Voulvoulis et al. 2000;Cresswell et al. 2006;Yamada 2007;Chapman et al. 2014;Amara et al. 2018).

    신방오도료물질 중 Diuron과 Irgarol은 북서 유럽과 지 중해 연안에서 가장 높은 농도로 분포하는 물질이며 (Price and Readman 2013), 국내의 경우도 Diuron과 Irgarol은 선 박 이동량이 많은 연안 지역에서 가장 높은 농도 (Diuron: 35~1,360 ng L-1, Irgarol: 14 ng L-1)로 검출되고 있다 (Kim et al. 2014;Kim et al. 2015). Diuron과 Iragrol은 식물 광합성 계의 Photosystem II의 QB가 담당하는 플라스토퀴논의 결 합부위와 경쟁함으로써 광합성 과정 내 전자전달을 차단 하여, 식물성 플랑크톤을 포함한 일차 생산자에게 유해한 것으로 알려져 있다 ( Jones et al. 2003; Maccinnis-NG et al. 2003; Lambert et al. 2006;Bao et al. 2011). 이외에도 다수의 연구결과가 US-EPA에 보고되어 있으나, 연안 정착성 생물 에 대한 영향을 파악한 연구는 매우 부족한 실정이다.

    말똥성게 (Hemicentrotus pulcherrimus)는 한국, 중국 및 일 본 등과 같은 동북아 지역의 조간대 암반에서 주로 서식하 는 생물 (Agatsuma 2001;Hwang et al. 2014)로, 생식소를 식 용으로 이용하고 있어 수산학적으로도 매우 중요할 뿐만 아니라, 생식세포의 획득과 인공수정을 통한 배아획득이 쉬우며, 독성에 대한 민감성이 뛰어나 해양환경공정 시험 기준의 해양생물 공정시험법으로 등록된 유용 수산생물이 다 (Hwang et al. 2020).

    본 연구에서는 해양생태계 내 1차 소비자를 대표하 는 H. pulcherrimus를 이용하여 비금속 유기 방오도료 물 질인 Diuron과 Irgarol의 독성영향을 평가하고자 하였으 며, 이 결과를 바탕으로 무영향농도 (NOEC; Non-effective concentration), 최소영향농도 (LOEC; Low-effective concentration), 반수영향농도 (EC50; 50% effective concentration) 및 10% 영향농도 (EC10; 10% effective concentration) 등을 산출하여, 이 물질들의 해양환경 기준농도 설 정을 위한 자료로 활용하고, 더불어 이 물질들이 초기배아 발생 단계별로 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1. 시험생물 및 생식세포 획득

    말똥성게 (Hemicentrotus pulcherrimus)는 2020년 2월 전 라북도 부안군 격포리 연안 (35°38ʹ04ʺN, 126°27ʹ41ʺE) 암 반지대에서, 직경 3.5 cm 이상으로 충분히 성장한 개체를 선별하여 채집하였다. 채집된 H. pulcherrimus는 아이스박 스 내에서 저온상태로 실험실로 이송되어, 1 t 규모의 유수 식 수조에서 15±1°C로 순치한 뒤, 시험에 사용하기 전 개 체의 표면을 해수로 깨끗이 세척하여 사용되었다.

    생식세포는 체강 내에 0.5 M KCl 용액 1 mL를 주사하여 방란·방정을 유도하였으며, 필터해수가 담긴 비커에 H. pulcherrimus의 생식공을 노출시켜 생식세포의 자연배출을 유도하여 포집하였다. 포집된 생식세포는 멸균된 1회용 스 포이드를 사용하여 이물질을 제거한 뒤, 3회 이상 충분히 세정한 후에 시험에 사용하였다. 모든 시험 간 사용된 해수 는 자연해수를 membrane filter (pore size 0.45 μm)로 여과 하여 사용하였다.

    2. 시험용액 조성

    시험에 사용된 신방오도료 Diuron (C11H19N5S, Cas No. 28159-98-0)과 Irgarol (C9H10Cl2N2O, Cas No. 28159-98- 0)은 DMSO (Dimethylsulfoxide, Sigma-aldrich, USA)를 carrier solvent로 사용하여 고농도 (10,000 mg L-1)의 stock solution을 제작한 뒤, 여과해수로 희석하여 사용하였다. 이 때 시험생물에게 노출되는 DMSO의 농도는 DMSO의 최 종 농도는 NOEC 값인 0.1% 이하로 노출되도록 조성하였 다 (Manzo et al. 2006). 시험농도 범위는 예비실험을 통하여 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 mg L-1으로 설정되었으며, 모든 시 험간 대조구는 0.45 μm membrane filter로 여과된 자연해수 를 사용하였다.

    3. 수정률, 정상 배아발생률 시험 및 초기발달과정 확인

    수정률 시험의 경우, 6 well plate에 시험용액을 농도별로 10 mL씩 3반복으로 분주한 뒤, 시험용액당 1 μL의 정자를 분주하여 Diuron과 Irgarol에 30 min 동안 노출시켰다. 정자 가 시험물질에 30 min간 노출된 이후, well당 100~150개의 난자를 넣고, 10 min 뒤 수정막의 형성 유무로 수정률을 판 단하였다.

    정상 배아발생률의 경우, 방란·방정을 유도하여 얻은 난자에 정자를 넣어 10 min간 인공수정을 유도하였다. 10 min 이후 수정난을 현미경으로 관찰하여 90% 이상의 수 정률을 확인한 뒤 시험에 사용하였다. 시험용액은 6 well plate에 농도별로 10 mL씩 3반복으로 분주되었으며, 시험 용액당 수정란 100~150개씩 분주하여 온도 16±0.5°C, 광 량 100±10 μmol photons·m2·s-1, 광주기 8 Light : 16 Dark 하에서 배양하였다. 측정시기는 H. pulcherrimus가 인공수 정 후 pluteus 유생으로 발달되는 시기인 64 h에 각각 측정 하여 정상 배아발생률을 측정하였다 (Hwang et al. 2014). 정상 배아발생은 4-armed pluteus stage 유생의 4개의 arm 이 정상으로 발달하였는지의 유무로서 판단하였다. 본 시 험방법은, 해양환경공정시험기준의 해양생물공정시험기 준 제 25항, 성게를 이용한 해양생태독성 시험방법에 의 거하여 수행되었다 (Table 1). 또한, Diuron과 Irgarol이 H. pulcherrimus의 초기 배아발달과정에 미치는 영향을 확인하 기 위하여, 시험물질에 대한 64 h-정상 배아발생률의 반수 영향농도 (EC50)에 정상 수정란을 100~150개씩 분주하여 노출시키고, 1 h, 1.5 h, 2 h, 2.5 h, 6 h, 12 h, 18 h, 24 h, 42 h, 50 h, 64 h에 각각 현미경 하에서 수정란의 발달상태를 확인하 였다. 발달상태 확인방법의 경우, 관측시기별 무작위로 100 개의 수정란을 선정하여 관찰하였고, 해당하는 발달단계를 비율로 나타냈다 (Fig. 3).

    4. 통계분석

    실험 간 유의성 검정은 SigmaPlot 12.0 version (Systat Software, Inc., San Jose, California, USA)의 Student’s t-test 로 비교하였으며 p가 0.05 혹은 0.01 이하인 것을 유의한 것으로 판단하였다. 정상 유생발생률에 대한 EC50와 95% 신뢰구간 (95% Confidence Interval; 95% Cl)은 Toxicalc 프 로그램 (Toxicalc 5.0, Tidepool scientific software, USA)의 probit 통계법을 이용하여 분석하였다. NOEC 및 LOEC도 Toxicalc 프로그램의 Dunnett’s test를 이용하여 분석하였 다.

    결 과

    정상 수정률은 H. pulcherrimus의 정자와 난자, 수정 후에 수정막의 형성 유무로 판단되며 (Fig. 1a), 수정 후에 정상적 인 배아발생은 pluteus 유생으로의 형태 변이로 판단하나 (Fig. 1b), 비정상적으로 배아가 발생할 경우에는 Fig. 1c, d 에서 나타나듯이 anterior arm과 posterior arm가 나타나지 않는다.

    수정률의 경우는 Diuron과 Irgarol의 최고농도인 40 mg L-1에서도 수정률의 저해가 나타나지 않았으나 (Fig. 2a), 배아발생률은 농도의존적으로 감소하는 경향을 나타냈다 (Fig. 2b). Diuron에 노출된 H. pulcherrimus의 정상 배아발 생률은 5 mg L-1까지는 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 10 mg L-1에서 정상 유생발생률이 83.00%로 유의하게 감 소하여, 최고농도인 40 mg L-1에서는 정상 배아발생률을 관 찰할 수 없었다 (p<0.01). Irgarol의 경우는 실험 최소농도 인 1.25 mg L-1에서 정상 배아발생률이 84.00%로 유의적으 로 감소하기 시작하여 (p<0.01), 농도가 증가할수록 감소 하는 농도의존성을 나타내었다 (Fig. 2b).

    H. pulcherrimus에 대한 신방오도료의 독성값을 살펴보 면, 정상 배아발생률의 EC10 값은 Diuron과 Irgarol에 대하 여 4.11±0.30 mg L-1, 1.30±0.01 mg L-1을 나타냈고, EC50 값은 7.12±0.04 mg L-1, 2.31±0.07 mg L-1로 나타났다. NOEC와 LOEC 값은 Diuron에서 1.25 mg L-1, 2.5 mg L-1, Irgarol에서 0.625 mg L-1, 1.25 mg L-1로 나타났다 (Table 2). EC50 값을 기준으로 Diuron과 Irgarol의 독성민감성을 비교 해 보면, Irgarol이 약 2배가량 독성이 강한 것으로 나타났 다.

    또한, 64 h-정상 배아발생률의 반수영향농도 (EC50)에 정 상 수정란을 노출시켜 Pluteus 유생으로 발달하는 과정을 총 10단계 (Zygote, 2-cells, 4-cells, 8-cells, Morular, Blastula, Early gastrula, Gastrula, Early pluteus, Pluteus)로 나누어 발 달에 미치는 영향을 관찰하였다 (Fig. 3). 0~12 h까지 유의 미한 차이를 보이지 않았으나, 18 h에 early gastular stage 로의 발달이 지연되기 시작하여, 24 h부터는 유의한 차이 를 나타냈다. 24 h 관측결과 대조구에서 Early pluteus stage 가 77.7%를 차지하는 것으로 나타났으나, Diuron과 Irgarol 노출군에서는 Early gastular가 71.7%, 81.0%를 차지하여 gastular stage로의 발달이 지연되는 것으로 나타났다. 이 후 노출 24~50 h 동안 대조군에서는 Early pluteus에서 pluteus로 정상적으로 발달이 이루어져 50 h이면 대부분의 수정란이 pluteus 유생으로 발달하는 것에 비하여, Diuron 과 Irgarol에 노출군에서는 Early pluteus에서 Pluteus로 발 달하는 과정에서도 지연이 나타났다 (Fig. 4). 결과적으로 H. pulcherrimus의 초기 배아 발달과정에서 신방오도료물 질 Diuron과 Irgarol은 Early gastular-gastular-Early pluteus- Pluteus로 이어지는 과정에서 배아 발단을 지연하여, 64 h 에 정상 배아발생률에 차이를 나타낸 것으로 판단된다.

    고 찰

    우리나라는 해운 및 수산업의 발달로 인해 방오물질의 사용량이 많으며, TBT의 사용금지 조치 이후에 사용되기 시작한 신방오물질인 Diuron과 Irgarol은 한국 연안해역에 서 매우 높은 농도로 존재하며 가장 흔하게 검출되는 물질 이다. Kim et al. (2014)에 의하면, 전국 11개 주요항구 (인천, 군산, 목포, 여수, 광양, 통영, 부산, 울산, 포항, 울진, 속초) 중 42%, 진해만 내 13개 어항 중 73%, 마산만, 행암만, 고현 만 내 18개 지점 중 64%에서의 Diuron 농도는 영국의 환경 표준농도 (EQS; Environmental Quality Standard) 값인 100 ng L-1을 초과한 바 있다. 위에서 언급한 환경 내 Diuron 농 도 및 각국의 수질기준과, 본 연구에서 도출한 Diuron의 독성값을 비교해 보면, 정상 배아발생률의 반수영향농도 (EC50)와 최소영향농도 (LOEC)는 7.12 mg L-1, 2.5 mg L-1 로, 우리나라 전국 연안의 해수 내 Diuron의 분포범위인 5~1,360 ng L-1, 영국의 EQS 값인 100 ng L-1, EU의 예측무 영향농도 (PNEC; Predicted No Effect Concentration) 200 ng L-1, 네덜란드의 최대허용농도 (MPC; Maximum permissible concentration) 430 ng L-1보다 높은 것으로 나타났다. Irgarol 의 경우, EC50와 LOEC는 2.31 mg L-1, 1.25 mg L-1로 나타났 으며, 우리나라 전국연안의 해수 내 Irgarol의 분포범위인 0~14 ng L-1, 네덜란드와 영국의 EQS 값인 24 ng L-1, 영국의 PNEC 값인 43.9 ng L-1 보다는 상회하는 것으로 나타났다 (Table 2).

    이와 같이, 1차 소비자인 성게의 독성값이 환경 내의 농 도 및 각국의 수질기준과 가이드라인을 상회하며, 해양환 경 내의 신방오도료의 농도는 독성 영향을 일으킬 만큼 충 분히 높지 않다고 나타났다. 하지만, Diuron과 Irgarol 및 그 분해산물인 M1은 광합성작용 중 Photosystem II의 억제를 통한 식물독성으로 해양생태계와 생산자에게 잠재적으로 유해할 수 있다고 알려져 있을 뿐만 아니라 (Okamura et al. 2000;Zhang et al. 2008;Sjollema et al. 2014;Jung et al. 2017;Kottuparambil et al. 2017), 먹이연쇄를 통해 전이되어 생물 체 내에서 Cytochrome p450 산화반응과 Mitochondria의 전자전달 방해를 통해 활성산소 (ROS)를 발생시켜 세포 구 조 성분을 변화시키고 세포사멸을 일으키는 것으로 보고된 바 있다 (Michael et al. 2013;Tanja et al. 2018). 또한, Irgarol 은 해양환경 내에서 분해되어, M1 (2-methylthio-4-tert-butylamino- 6-amino-s-triazine), M2 (3-[4-tert-butylamino- 6-methylthiol-s-triazine-2-ylamino]propionaldehyde)와 같 은 형태로 존재하며 (Lam et al. 2004), 동일 지점에서 Irgarol 농도보다 14.38~30.81배 높게 분포하는 것으로 알려져 있 다 (Zhang et al. 2019). 또한, M2는 구조적으로 aldehyde 치 환기가 존재하기 때문에 생물군에 미치는 위해성이 Irgarol 보다 높은 것으로 알려져 있다 (Lam et al. 2006). 결과적으 로 Diuron과 Irgarol은 환경 내 농도에 비하여 해양생물에 미칠 수 있는 잠재적 독성영향이 과소평가된 경향이 있다.

    또한, 말똥성게 외에도 5종의 성게 (Mesocentrotus nudus, Lytechinus variegatus, Paracentrutus lividus, Anthocidaris crassispina, Glyptocidaris crenularis)의 독성값 중 EC50 값 을 기준으로 비교해 보면, H. pulcherrimus의 독성값은 M. nudus보다는 민감하고, L. variegatus, P. livividus, A. crassipina, G. crenularis보다는 둔감한 것으로 나타났다. 이는, 일반적 으로 동일 생물종에서도 환경 및 생태적 특이성에 의하여 독성 민감성에 차이를 나타낼 수 있기에, 구체적인 이유를 확인하기는 어렵다. 또한, 성게종마다 초기배아단계에서 의 생육 적정 수온이 상이하며, 발생시간에도 차이가 존재 하므로, 성게종 간의 민감도 차이는 이러한 생리·생태학적 특징에 기인하는 것으로 사료된다 (Choi et al. 2020).

    현재까지, Diuron과 Irgarol이 해양 무척추동물에게 미 치는 영향의 메커니즘은 알려져 있지 않다. 하지만, 무척 추동물의 초기 배아발생과정 중에 Diuron에 노출될 경우 발달에 방해가 일어난다고 알려져 있으며, Irgarol에 노출 된 경우, 주로 칼슘 항상성에 영향을 미쳐 골격 변형에 영 향을 받아 기형 유생이 관찰된다고 알려져 있다 (Manzo et al. 2006). 또한, Moon et al. (2019)에 의하면 신방오도 료는 수생생물의 신경계 및 근육세포 발달에 결함을 일으 키며, 면역계에 교란을 일으키고, 넙치의 배아형성에 결 함을 나타낸다고 한다. 본 연구의 결과에서도 Diuron과 Irgarol은 성게의 배아 발달을 지연시키는 것으로 나타났 으며, 2-cell, 4-cell, 8-cell, 상실기 이전까지는 저해가 나타 나지 않지만, 상실기부터 영향을 받기 시작해, 초기낭배기 (Early gastular)와 낭배기를 거쳐 초기 pluteus 유생에서 정 상 pluteus 유생으로 발달하는 과정에 지연 및 기형이 발생 하는 것으로 나타났다. 향후 골격형성, 단백질합성, 신경계 영향 등과 같이 초기발생에 관련된 유전독성 시험을 수행 하는 것은 Diuron과 Irgarol이 성게류의 초기발생의 지연에 작용하는 원리를 확인할 수 있을 것으로 보인다.

    Omae (2003)Moncada (2004)에 의하면, 해양환경 내 에서 잔류성이 높은 Diuron은 43~2,180일의 반감기를 가 지며, Irgarol의 반감기는 100~350일로 잔류성이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 또한, Diuron과 Irgarol은 제초제로 사 용되는 물질로서, 농업에 사용되고 강이나 하천을 따라 배 출되어 해양환경으로 지속적으로 유입된다. 이와 같은 신 방오도료물질의 특성은 결국 해양환경 내에서 농도를 지 속적으로 증가시킬 것으로 판단된다.

    연안유역의 대표적인 오염물질인 신방오도료물질은 시 험생물 및 노출 시간 등과 같은 차이로 인하여 생물체 내에 미치는 영향이 다양하게 나타날 수 있기에, 유용 시험생물 종을 이용한 시험방법의 표준화는 매우 중요하다. 본 연구 에서는 조간대 암반에 서식하는 H. pulcherrimus의 초기 배 아발생 단계를 이용해 신규방오도료에 대한 다양한 독성 값을 도출하였으며, 이들 독성값은 Diuron과 Irgarol과 같 은 해양환경의 오염물질에 대한 환경보호 전략 수립을 위 한 기초자료로 활용될 것이다.

    적 요

    본 연구에서는 신방오도료 Diuron과 Irgarol이 해양 무 척추동물인 말똥성게 (Hemicentrotus pulcherrimus)에게 미 치는 독성영향을 10 min-수정률과 64 h-정상 유생발생률의 EC50, NOEC, LOEC 값을 통하여 확인하였으며, 해당 오염 물질이 H. pulcherrimus의 초기발생단계에 미치는 지연효 과를 확인하고자 하였다. 실험결과, Diuron과 Irgarol은 시 험농도 (40 mg L-1)에서 H. pulcherrimus의 수정률에 영향을 미치지 않았으며, 정상 유생발생률에 대한 EC50값은 각각 7.12 mg L-1, 2.31 mg L-1로 나타났다. 또한, 수정란이 pluteus 유생으로 발달하는 과정에서 반수영향농도의 Diuron과 Irgarol의 노출 경과시간이 18 h에 도달하면, early gastrular stage로의 발달이 지연되기 시작하여, 24 h에서부터 유의미 한 발달지연이 확인되었다. 이후 지속적인 발달지연이 관 찰되어, Early gastrular-gastrular-early pluteus-pluteus로 이 어지는 과정에서 발달지연이 나타났다. Diuron과 Irgarol은 잔류성이 높으며, 본 연구결과와 같이 무척추동물을 포함 한 다양한 해양생물 군에 독성영향이 있는 것으로 알려져 있다. 이에, 해양 환경의 오염을 방지하고 보전하기 위하여, 관련된 규정의 마련을 통하여 환경보호 전략이 필요하다.

    사 사

    본 논문은 2020년도 국립수산과학원 경상과제 (R2020 027) 연구비 지원으로 수행하였습니다.

    Figure

    KJEB-38-4-518_F1.gif

    The malformed shapes of Hemicentrotus pulcherrimus in the observed early developmental stages. A normal fertilized egg and an abnormal fertilized egg (a) of H. pulcherrimus, determined by the presence or absence of a fertilized layer. Normal pluteus larva (b), undeveloped larva (c), and abnormal development larva (d) of H. pulcherrimus were observed under exposure to pollutants.

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    Fertilization rate (%) and normal embryogenesis rate (%) of sea urchin, Hemicentrotus pulcherrimus, exposed to serial dilutions of diuron and irgarol. The vertical bar denotes the confidence interval and the asterisks indicate significant differences (p<0.05*, p<0.01**) as determined by one-way ANOVA.

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    Early sea urchin developmental stages of Hemicentrotus pulcherrimus divided by observation time. The cleavage-stages of H. pulcherrimus embryos are described based on 2-, 4 -, or 16-cells, followed by the blastula (central cavity surrounded by an epithelial layer), and gastrula (formation of the archenteron) stages. The larva is defined morphologically as an early pluteus or pluteus larva.

    KJEB-38-4-518_F4.gif

    The ratio of developmental stages of Hemicentrotus pulcherrimus embryo cells at each observation time. The concentration of diuron and irgarol was set to 50% effective concenation values (EC50). The reason for the degradation of development at each observation time may be due to the delay in development over time. The development hindrance began to appear at 18 hours of observation, resulting in significant differences after 24 hours of exposure.

    Table

    Experimental conditions for this research using Hemicentrotus pulcherrimus

    Toxicity evaluation using normal embryogenesis of sea urchins exposed to the antifouling agents

    Reference

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