서 론

세계기상기구 (World Meteorological Organization; WMO)는 2021 세계 기후 상태 보고서를 통해 세계 각국의 이상 폭염, 폭우, 가뭄 사례들을 언급하며 이러한 극한 기상 현상이 기후의 새로운 표준인 뉴노멀이 되고 있다고 경고 하였다. 극한 기상 현상이 지속해서 발생함에 따라 다양한 생태 환경들이 영향을 받고 있으며 대표적으로 가뭄에 의 한 잎마름병 같은 작물 피해 사례들이 지속해서 관측되고 있다 (Chen et al. 2021). 가뭄뿐만 아니라 폭우에 의한 작물 피해 사례들도 계속해서 발생하고 있는데, 폭우에 의해 작 물이 필요 이상의 용수량을 공급받게 되면 습해 스트레스 를 입게 된다. 침수로 인해 피해가 발생하게 될 경우 토양 은 혐기 상태로 되고, 이로 인해서 작물 뿌리에 산소가 원 활하게 공급이 되지 않는다 (Park et al. 2005). 습해로 인해 계속해서 저산소 상태가 유지되면 작물 뿌리 조직의 변화 가 일어날 뿐만 아니라 잎에서도 노화 (황화)가 발생해 광 합성에 영향을 주게 된다 (Parsons et al. 2007). 이는 결국 작 물 생산량 감소로 이어지게 된다 (Daryanto et al. 2016).

이러한 침수 스트레스를 방지하거나 진단하기 위해서 는 메커니즘에 대한 세포 생화학적 분석과 이해가 필요하 다 (Yin et al. 2017). 침수 스트레스 하에서는 식물의 바이 오매스, 광합성 색소, 가스교환 등의 감소가 생산성 감소의 주요 원인으로 추정된다. 침수 스트레스를 받을 경우의 대 표적인 생리 화학적 반응은 호기적 호흡에서 혐기적 발효 로의 전환이다 (Kathleen et al. 2003). 발효 경로가 활성화 될 경우 생성된 ethanol을 acetaldehyde로 환원시키기 위 하여 alcohol dehydrogenase (ADH)의 활성이 증가하거나 reactive oxygen species (ROS) 축적으로 인하여 이를 중화 하기 위한 생화학적 반응들이 일어나게 된다 (Fernanda et al. 2016). 이론적인 반응들은 상당수 알려져 있지만 실제 작물에서의 생화학적 변화에 대한 연구는 미흡한 실정이 다.

최근 국내에서는 쌀 생산조정제 정책 추진으로 논에 밭 작물의 재배를 장려하고 있다 (Chun et al. 2017a). 논 토양의 경우 밭 토양에 비해 습해가 발생하기 쉬운 환경 조건을 가 지고 있는데 이에 더해 이상 폭우 등으로 인하여 논 토양 에서의 밭작물 재배가 보다 어려워진 상황이다 (Lee et al. 2004;Yoon et al. 2014). 이에 반해 다양한 밭작물들의 논 토 양 재배를 위한 기술은 연구가 필요한데 대표적인 밭작물 들의 예로 콩, 팥, 참깨, 들깨, 수수 등이 있다. 이러한 밭작물 들은 습해에 민감한 작물임에도 불구하고 기타 다른 환경 스트레스에 비하여 연구가 매우 빈약한 실정이다 (Sullivan et al. 2001;Jain et al. 2010;Chun et al. 2017b;Ryu et al. 2018).

본 연구에서는 여러 밭작물을 이용하여 습해 발생 시의 밭작물의 생장도와 생화학적 변화를 확인하고 ADH 활성, peroxidase (POD) 활성, lipid peroxidation 측정 등을 통해 서 추후 습해 조기진단의 실마리를 찾고자 한다.

재료 및 방법

1. 밭작물의 성장 및 침수 스트레스 조건

참깨 (건백), 들깨 (다유), 팥 (아라리), 수수 (남풍찰), 콩 (우람콩)의 종자는 농촌진흥청으로부터 제공받아 사용하 였다. 종자들은 플라스틱 포트 (12.5 cm×12.5 cm×11 cm) 에 파종하였고 4°C 환경에서 이틀간 춘화처리 후 23°C에 서 16시간의 명조건, 8시간의 암조건하에서 재배하였다. 토 양은 경북대학교 이인중 교수로부터 제공받아 실험에 사 용하였다 (pH 7.3, EC 0.23 dS m^-1, OM 32.4 g kg^-1, T-N 0.25 g kg^-1, Av. P₂O₅ 250 mg kg^-1, K 0.29 cmol_c kg^-1, Ca 6.41 cmol_c kg^-1, Mg 0.78 cmol_c kg^-1, Na 0.26 cmol_c kg^-1; Ryu et al. 2018). 침수 스트레스는 플라스틱통 (30 cm×45 cm×20 cm) 내부 를 물로 채운 뒤 포트가 반 정도 잠기도록 고정하는 방법으 로 처리하였다.

2. 광포화점 측정

광포화점은 Photosynthesis Yield Analyzer (MINI-PAM, WALZ, Germany)를 이용하여 측정하였으며 지표는 Eq. 1 을 사용하였다. 여기서 Φ_{PS II}는 2광계 유효 양자수율을 뜻 하며 F_m′는 최대 형광수율 Fs는 정상 상태 형광수율을 의미 한다.

이렇게 산출된 Φ_{PS II}를 이용하여 Eq. 2를 통해 광학 전사 수 송률을 계산하였다 (Genty et al. 1989). 여기서 ETR은 각 작 물의 광학 전사 수송률을 의미하며 PAR은 가시광선 영역 의 양자 농도를 의미한다.

3. ADH 활성 측정

ADH의 활성은 과습 처리 전을 0일차로 하고 과습 처 리 후 1, 3, 6, 9, 12, 15일째에 뿌리 시료를 채취하여 측정 하였다. 액체질소를 이용하여 시료를 간 뒤 추출 완충액 [0.01 M MgCl₂, 0.01 M KCl, 0.2 M sucrose, 0.04% EDTA, 2% polyvinyl-pyrrolidine (PVP), 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5)] 을 1 : 10 (시료 : 추출 완충액, w v^-1) 비율로 첨가 후 원심분 리 (12,000×g, 4°C, 15 min)하여 상등액을 분리하여 사용하 였다. 상등액 200 μL, 50 mM Tris-HCl (pH 8.5) 500 μL, 1.7 mM NAD 200 μL, 95% ethanol 200 μL를 넣어 잘 섞어준 뒤 분광광도계를 이용하여 340 nm 파장대에서 30초 간격으 로 3분간 흡광도를 측정하였다. ADH의 활성은 Eq. 3을 이 용하여 계산하였다. dA dt^-1는 분당 습해를 받은 식물의 흡 광도 변화량 - 분당 습해를 받지 않은 식물의 흡광도 변화량 을 의미하며 TV는 cuvette의 부피, V는 추출물의 부피, ε는 NADH의 340 nm에서의 몰흡광계수 (6.22)를 의미한다.

4. POD 활성 측정

POD 활성은 채취한 시료를 액체질소를 이용하여 갈 아준 후 추출 완충액 (50 mM HEPES, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl₂, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl (PMSF), pH 7.5)을 1 : 10 (시료 : 추출 완충액, w v^-1) 비율로 첨가 후 원심분리 (12,000×g, 4°C, 15 min)하여 상등액을 분리하여 사용하였다. POD 활성 측정은 3 mL cuvette에 1.9 mL 증류 수, 150 mM guaiacol 300 μL, K-Pi 완충용액 (pH 7.5) 300 μL, 650 mM H₂O₂ 300 μL를 넣고 상등액 200 μL를 넣는 즉시 분광광도계를 이용하여 560 nm 파장대에서 30초 간격으로 5분간 측정한 값을 Eq. 4를 이용하여 계산하였다.

5. Lipid peroxidation 측정

Lipid peroxidation 측정을 위하여 실험군 및 대조군 작물 의 잎 0.5 g을 액체질소를 이용하여 갈아준 후 추출 완충액 [0.1% TCA (trichloroacetic acid) 1 mL]으로 추출 후 원심 분리 (12,000×g, 4°C, 5 min)하여 상등액 200 μL를 800 μL 의 반응 버퍼 [0.5% TBA (thiobarbituric acid), 20% TCA]와 섞어 주었다. 이를 95°C에 25분간 반응 후 즉시 얼음에 식 히고 분광광도계를 이용하여 532 nm 파장대에서의 흡광도 변화를 MDA (malondialdehyde) 표품을 사용한 표준곡선 을 통해 정량하였다.

6. DAB 염색

DAB (3,3′-Diaminobenzidine) 염색을 위하여 30 mg DAB 을 27 mL 증류수에 넣고 0.2 M HCl로 pH 3.0까지 적정하 였다. 여기에 15 μL Tween 20 (0.05% v v^-1), 1.5 mL 200 mM Na₂HPO₄를 첨가하여 DAB 염색 시약을 제조하였다. 각 작 물의 잎을 잘라서 DAB 염색 시약에 넣은 뒤 5분씩 총 30 분 동안 진공 조건에서 염색하였다. 이후 37°C 진탕기에 서 150 rpm으로 4시간 진탕한 후 탈색 시약 (ethanol : acetic acid : glycerol=3 : 3 : 1)을 이용하여 탈색하였다. 마지막으 로 끓는 물에 20분 동안 열처리한 후에 새로운 탈색 시약 으로 바꾸어 결과를 확인하였다.

7. 통계분석

작물의 뿌리길이와 광포화점, 각각의 습해 지표들에 대 해 실험군 및 대조군의 수치를 조사하였다. 각 수치들의 통 계적 유의성을 확인하기 위해 0.001, 0.05, 0.1의 유의수준 에서 Student’s t-test를 실시하였다.

결과 및 고찰

1. 침수 스트레스에 의한 밭작물의 생육도

침수 스트레스 조건하에서의 작물들의 생육도를 측정하 기 위하여 3일 간격으로 샘플링 후 뿌리 길이, 지상부를 관 찰하였다 (Figs. 1 and 2). 참깨와 들깨의 경우 3일차부터 뚜 렷한 뿌리의 성장 저하가 관찰되었고 팥, 수수, 콩의 경우 6 일차부터 뿌리의 성장 저하가 관찰되었다. 지상부의 생육 도 6일차부터 그 차이가 나타나기 시작하는데 콩과 수수의 경우에는 큰 차이를 보이지 않았다. 또한 다른 생육 인자인 광포화점을 통하여 생육도를 조사하였는데 수수의 경우 그 차이가 뚜렷하게 보이지 않지만 콩, 팥, 들깨에서는 습해 스트레스 하에서 대조구에 비하여 광학 전자 수송률 (ETR) 이 포화되는 광합성 활동 방사 (PAR)의 값이 낮아진 것으 로 확인되었다 (Fig. 3). 이는 엽록체가 광합성하는 동안 발 생하는 전자의 이동이 증가하지 않는다는 것을 뜻하며 모 든 엽록체가 광합성에 참여하고 있는 것을 뜻한다. 광포화 점이 대조군에 비하여 감소하는 경향을 나타내므로 습해 에 민감하게 반응하는 것으로 판단된다.

2. 침수 스트레스에 의한 밭작물의 생화학적 반응

1) ADH 활성

작물이 침수에 의한 스트레스를 받을 경우 토양 내 산 소부족 현상 때문에 미토콘드리아에 의한 호흡이 중단되 고 혐기 대사인 발효과정으로 전환된다. 미토콘드리아 내 에서 호흡을 통한 ATP 생산에 있어 산소는 최종적인 전 자 수용체로 사용이 되며 이를 통해 작물의 생육에 필요 한 에너지를 생산할 수 있다. 작물이 과습에 의한 산소결 핍 환경에 놓이게 되면 미토콘드리아에서의 에너지대사가 원활하지 못하게 되어 발효과정으로 대사가 전환되게 된 다. 이러한 과습 조건에서 식물이 살아남기 위하여 alcohol dehydrogenase (ADH) 활성을 증대시켜 발효에 의해 생 성된 ethanol을 acetaldehyde로 환원시킨다 (Dolferus et al. 1994). 이때 ADH 활성의 증가를 과습 정도의 판단 지표로 이용하기 위하여 작물들의 과습 조건하에서 ADH 활성을 측정하였다 (Fig. 4). 그 결과 모든 작물에서 과습 1일차부 터 대조군에 비해 뿌리에서의 ADH 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 침수 스트레스를 받을 경우 ADH의 활성이 올라감을 확인하였고 ADH를 침수 스트레스의 판 단 지표로 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

2) POD 활성

식물의 과습 스트레스를 판단하기 위한 또 다른 지표로 ROS의 제거 활성을 조사하였다 (Fig. 5). 식물이 비생물학 적 스트레스 환경에 놓이면 ROS가 체내에 축적되고 이러 한 ROS에 의해 생성되는 물질 중 하나인 과산화수소는 기 공의 닫힘을 유도한다 (Bright et al. 2005). 이 ROS에 대한 저항 기작으로 POD의 발현이 증가하여 기공을 개방하게 되는데 이에 따라 POD의 활성을 측정하여 침수 스트레 스의 정도를 확인하였다 (Hoque et al. 2012). 들깨를 제외 한 모든 작물에서 POD의 활성이 높아지는 경향이 나타났 으며 6일과 9일째 가장 높은 POD 활성을 나타냈다. 일부 작물에서는 12일째에 오히려 POD 활성이 줄어드는 것을 확인하였는데 이는 극심한 스트레스로 인하여 대사과정 이 원활하지 않아서 발생하는 현상으로 판단된다 (Fig. 5c and e).

3) Lipid peroxidation

ROS 축적 정도를 확인하기 위한 척도로 lipid peroxidation를 측정하였다 (Fig. 6). 막 인지질이 ROS와 접촉할 때 lipid peroxidation이 발생하는데 이를 측정함으로써 ROS 에 의한 피해 정도를 확인할 수 있다 (Farmer and Mueller 2013). Lipid peroxidation은 세포 손상의 메커니즘으로 과산 화지질과 알데하이드의 생성 및 막 인지질의 파괴로 이어진 다. MDA (malondialdehyde)는 이 과정의 불포화지방산의 분 해 결과 최종 산물로써 MDA의 측정으로 lipid peroxidation 정도를 판별할 수 있다 (Leutner et al. 2001). 15일까지의 lipid peroxidation 정도를 확인하였는데 콩과 들깨를 제외한 작물들에서 습해 처리 6일째와 9일째에서 정도가 가장 높게 나타났다. 이는 습해 스트레스를 받은 작물에서 ROS가 생성 이 되어 lipid peroxidation이 유발된 것으로 판단된다.

4) DAB 염색

POD와 lipid peroxidation 측정으로 침수 스트레스에 의 하여 ROS가 발생하는 것을 확인하였고 과산화수소의 함 량을 증가시키는 것을 확인하였다. 이를 시각화하기 위하 여 DAB 염색 실험을 진행하였다 (Christensen et al. 1997) (Fig. 7). DAB 염색은 식물 체내의 과산화수소와 반응하 여 갈색 침전물을 생성한다 (Roles et al. 1975;Jambunathan 2010). 염색 결과 침수 스트레스를 받은 식물들이 대조군 에 비해서 염색이 더 강하게 되는 경향을 보였고 이는 기존 의 진단 방법인 식물의 전사체 분석을 통해 여러 후보 유전 자들의 발현 수준을 확인하는 방법에서 샘플링 및 RNA를 다루는 데서 오는 어려움을 줄이고 시각적으로 간편하고 빠르게 테스트해 볼 수 있는 방법으로 사용될 가능성을 시 사한다 (Ventura et al. 2020).

적 요

다양한 환경 스트레스 중 습해 스트레스의 경우 기타 가 뭄이나 저온, 고염 등에 비하여 메커니즘과 생화학적 이해 가 부족한 실정이다. 본 연구는 습해 스트레스 하에서의 밭 작물의 효소활성에 대하여 조사하여 습해 스트레스에 대 한 이해와 조기 진단을 위한 기초자료로 활용하고자 수행 하였다. 국내의 주요 밭작물인 참깨, 들깨, 팥, 수수, 콩 등을 대상으로 침수 스트레스를 주었을 시 생육도와 식물 내부 의 변화에 대하여 조사하였는데, 스트레스를 받을 경우 지 하부는 물론 지상부에서도 생육의 저하가 일어나는 것을 확인하였다. 식물체 내에서는 침수 스트레스에 의하여 혐 기적 발효가 일어나 대조군에 비하여 ADH의 활성이 높 아지는 것을 확인하였으며 스트레스를 받을 시 발생하는 ROS에 의한 변화 또한 확인하였다. 습해를 받은 식물들 모 두 POD 활성과 lipid peroxidation이 증가하였고 이를 시각 화한 DAB 염색에서도 염색 강도가 대조군에 비하여 진하 게 염색되었다. 지상부에서 표현형의 변화보다 식물 체내 의 효소활성의 변화가 비교적 빠르게 나타나므로 추후 작 물들의 습해 스트레스 조기진단을 위한 생체지표로써 활 용될 수 있을 것으로 사료된다.