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1. 서 론
들깨 (Perilla frutescens)는 꿀풀과의 1년생 초본의 특용 작물이다. 한국에서 수백 년 동안 재배되어 왔으며, 독특한 향과 맛을 가진 잎은 흔하고 대중적인 엽채류로 (Lee et al. 1998;Seo and Baek 2009;Dhyani et al. 2019), 잎과 종자 모두 다양한 음식의 재료로 이용되고 있다 (Ko et al. 2021). 뿐만 아니라, HIV-1, SARS-CoV-2의 활성을 억제시킬 수 있는 물질을 함유하고 있어, 잠재적인 약용자원으로 활용 될 가능성이 있다 (Yamasaki et al. 1998;Asada et al. 1999;Kawahata et al. 2002;Tang et al. 2021). 국내에서는 재배 면적은 2020년 기준으로 충남, 경기, 전북 등 다양한 지역 에서 18,515 ha 재배되고 있다 (KOSIS 2020).
들깨에 감염하는 바이러스로는 일본에서 보고된 perilla mosaic virus (PerMV), 중국에서 보고된 broad bean wilt virus 2 (BBWV2) 그리고 국내에서 보고된 turnip mosaic virus (TuMV), cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV), tomato spotted wilt virus (TSWV) 등이 있다 (Cho et al. 2005;Kubota et al. 2020;Park et al. 2020;Xia et al. 2020;Cho et al. 2021).
잠두위조바이러스2 (Broad bean wilt virus2, BBWV2) 는 Secoviridae과 Fabavirus속의 대표적 바이러스로 (Taylor and Stubbs 1972), 넓은 기주 범위를 가지며 주로 목화진 딧물과 복숭아혹진딧물과 같은 진딧물에 의해 비영속적으 로 (non-persistent manner) 전염되는 것으로 알려져 있다 (Benner et al. 1985;Brunt et al. 1996). BBWV2는 25~30 nm 직경의 구형 입자로 되어 있으며, 유전자는 RNA-1 (약 6 kb), RNA-2 (약 4 kb)의 2개의 절편으로 이루어져 있다 (Nakamura et al. 1998;Kwak et al. 2013a).
BBWV2는 경제적으로 중요한 원예, 관상작물에 피해 를 주는 바이러스로, 세계적으로 분포되어 있으며 (Taylor and Stubbs 1972;Ferrer et al. 2011), 국내에서는 고추 (Lee et al. 2000), 완두 (Choi et al. 2001), 잠두 (Kwak et al. 2013b), 백합 (Chang and Chun 1987), 시금치 (Lee et al. 1979), 용담 (Roh and Chang 1998), 글라디올러스 (Park et al. 1998), 샐러리 (Hahm et al. 1998), 명월초 (Kwak et al. 2017) 등 다양한 식물에 감염하는 것으로 보고되었다. 특 히, 고추에서는 오이모자이크바이러스 (Cucumber mosaic virus, CMV) 등 다른 바이러스와 함께 복합감염되어 피해 를 주고 있다 (Kwak et al. 2013a). BBWV2에 감염된 잎의 피해 증상은 모자이크, 모틀, 엽맥 퇴록, 황화 반점, 시듦 증 상 및 위축 등의 증상을 보인다.
본 연구에서는 2019년 충남 금산 지역의 잎들깨를 재배 하는 농가에서 잎 엽맥을 따라 황화되고, 잎 표면에 황화 반점이 나타나며, 심한 모자이크와 퇴록 증상을 보이는 들 깨 잎을 수집하였고, 수집한 들깨 잎으로부터 BBWV2를 분리하여 전체 유전자 염기서열 분석 및 생물검정을 통하 여 잎들깨에서 분리된 BBWV2의 특성을 구명하였다.
2. 재료 및 방법
2.1. 바이러스 진단
2019년 충남 금산지역에서 친환경으로 재배되는 잎들 깨의 잎에서 황화 반점과 퇴록 등의 바이러스 병징을 보 이는 개체가 발견되었다 (Fig. 1). 병징은 병이 진행됨에 따 라 심한 모자이크 병징을 보이고 잎 전체가 퇴록되어 잎 들깨의 상품성을 떨어뜨렸다. 이러한 증상이 바이러스 에 의한 것인지 확인하기 위하여 투과전자현미경 (LEO 912AB; Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였고, 바 이러스의 정밀진단을 위해 total RNA를 추출하고 (Plant RNA Prep Kit, Biocubesystem, Korea), 들깨에 이러한 병 징을 일으킬 수 있는 주요 바이러스 10종에 대해 특이 프 라이머 (Supplementary Table A1)를 이용하여 역전사중 합효소 PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하였다. RT-PCR 반응은 onestep RT-PCR premix (Genetbio, Korea)를 이용하여 50°C 에서 30분간 역전사 반응을 수행한 후 95°C에서 10분 변성 후, 95°C 30초 denaturation, 55°C 30초 annealing, 72°C 1분 extension을 35회 수행 후 마지막으로 72°C에서 5분 extension 후 완료하는 조건 (Kwak et al. 2021)으로 진행하 였다.
2.2. 바이러스 분리 및 병원성 검정
감염된 들깨 잎 조직에 10배 (W/V)의 0.01 M의 인산완 충액을 첨가하여 마쇄한 뒤 분리기주인 (assay host plant) 흰명아주 (Chenopodium quinoa)에 즙액 접종하여 3차례 에 걸쳐 단일병반을 순수분리하고 (single local isolation), 담배 (Nicotiana benthamiana)에서 증식하여 접종원으로 사용하였다. 기주 범위와 병원성을 검정하기 위하여 7과 26종의 지표식물 (Table 1)에 3반복으로 접종하고 4주간 접 종엽과 상엽의 병징을 관찰하고, BBWV2 특이 프라이머를 이용한 RT-PCR 진단으로 감염 여부를 최종 확인하였다 (Kwak et al. 2013a). 이러한 기주 범위와 병원성 검정 결과 는 BBWV2-RP1 분리주의 병원성 검정 결과 (Kwak et al. 2016)를 대조군으로 하여 본 연구에서 분리된 BBWV2- GS-PF 분리주의 병원성을 비교하였다.
2.3. 바이러스 전체 염기서열 분석
BBWV2-GS-PF 분리주의 전체 염기서열 분석을 위하여 감염된 담배 (N. benthamiana) 잎으로부터 total RNA를 추 출하여 (RNeasy Plant Mini Kit, Qiagen, Germany), NGS (Next-generation sequencing)를 의뢰하였다. NGS는 Illumina NovaSeq 6000 system을 이용하여 마크로젠사에 서 수행하였다 (Macrogen Inc., Korea). 양 말단의 정확 한 염기서열 분석을 위하여, 특이 프라이머를 제작하여 (Supplementary Table A2), RACE (Rapid amplification of cDNA ends, 5′ and 3′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends kit, Thermo, USA)와 클로닝을 수행 하여 전체 염기서열을 얻었다. DNA Star v. 5.02 (Lasergene, Madison, USA)의 SeqMan 프로그램을 사용하여 DNA assembly를 수행하여 최종적으로 전체 염기서열을 결정 하였고, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 GenBank에 등록하였다. RNA-1과 RNA-2의 전 체 염기서열을 기반으로 한 계통분석을 수행하였다. NCBI GenBank에 등록되어 있는 BBWV2의 18개 분리주와 outgroup으로 BBWV1 (Broad bean wilt virus 1)의 2개의 분리 주를 이용하여 각각의 전체 염기서열을 Geneious Pro 10 software를 이용하여 alignment를 수행하였고 염기서열 상 동성을 분석하였다. 계통분석 (phylogenetic tree)은 MEGA X 프로그램의 Maximum likelihood method를 사용하였고 (Kumar et al. 2018), 계통수의 가지에 대한 통계적 유의성 은 bootstrap 1,000반복을 수행하는 방법으로 분석하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1. 잠두위조바이러스2 분리 및 생물학적 특성 분석
2019년 충남 금산지역의 잎들깨 재배농가에서 황화 반 점 및 퇴록 증상 등 바이러스 의심 증상을 보이는 잎이 발 견되었다. 이러한 잎은 투과전자현미경을 이용하여 세포질 을 관찰했을 때, 바이러스에 의한 세포막 증식 (membrane proliferation)을 확인할 수 있었고 (Fig. 2), 특이 프라이 머를 이용하여 진단한 결과 BBWV2 감염이 확인되었다 (Supplementary Fig. A1). 흰명아주 (C. quinoa)에서 3차례 에 걸쳐 단일병반 (single local lesion)을 순수분리하여 담배 (N. benthamiana)에 증식하였다. 분리한 BBWV2-GS-PF 분리주의 생물학적 특성을 구명하기 위하여 7과 26종의 지 표식물에 접종한 후 접종엽과 상엽에서 병징을 관찰하여, 기주 범위와 병원성을 확인하였다 (Table 1). 생물검정 결 과, BBWV2-GS-PF는 N. benthamiana를 포함한 13종에서 전신감염을 보였으며, 담배에서는 주로 접종엽과 상엽에 서 동일하게 원형 반점과 모자이크, 괴사 증상 등을 보였다. 또한 기존에 고추에서 분리된 BBWV2-RP1 분리주의 경 우 (reference isolate, Kim et al. 2021), 고추와 파프리카에 서 약한 모자이크 증상을 보이는 것과는 다르게, BBWV2- GS-PF는 모자이크 증상뿐만 아니라 접종엽과 상엽에서 모두 전형적인 원형 반점 증상을 보였다 (Table 2, Fig. 3). Nicotiana속 11종 중 N. clevelandii 등 6종에서는 접종엽에 서만 괴사 및 원형 반점 증상을 보이고 상엽에서는 병징이 나타나지 않았으며, 동부를 포함한 콩과 작물 3종에서는 접 종엽에서만 괴사 증상이 나타나거나, 병징이 나타나지 않 았다. 오이를 포함한 박과 작물 4종과 토마토 2종에서는 접 종엽과 상엽 모두에서 병징이 나타나지 않았다. 이러한 생 물검정 결과는 RT-PCR 진단으로 최종 확인되었다.
3.2. 잠두위조바이러스2 분리주의 유전학적 특성 분석
BBWV2-GS-PF 분리주의 유전자 분석을 위하여 NGS를 수행한 결과, RNA-1과 RNA-2의 거의 전체 염기서열을 얻 었다 (Supplementary Table A3). 양 말단의 정확한 염기서열 분석을 위하여, 특이 프라이머를 이용하여 RACE를 진행하 였고 시퀀싱을 통해 전체 염기서열을 얻었다. 이러한 염기 서열을 DNA star v. 5.02 (Lasergene, USA)의 SeqMan 프 로그램으로 DNA assembly를 수행하여 최종적으로 RNA- 1 (5,948 bp)과 RNA-2 (3,575 bp)의 염기서열을 결정하였고, NCBI의 GeneBank에 등록하였다 (Table 3). 기존에 NCBI GeneBank에 등록되어 있는 18개의 BBWV2 분리주와 2개 의 BBWV1 분리주의 RNA-1과 RNA-2의 전체 염기서열을 대상으로 (Table 3), Geneious Pro 10 software를 이용하여 alignment를 수행하고 상동성을 비교하였다. BBWV2-GSPF 분리주의 RNA-1은 한국의 마에서 분리된 BR 분리주와 80.6%의 가장 높은 상동성을 보였고 (Table 4), RNA-2는 한 국의 잠두에서 분리된 BB2와 익모초에서 분리된 LS2, 일본 의 고추에서 분리된 IP, 싱가폴의 적포화에서 분리된 ME 분 리주와 77.5%의 가장 높은 상동성을 보였다 (Table 5). 기존 에 알려진 BBWV2 분리주들은 RNA-1과 RNA-2 각각 크 게 2개의 그룹으로 나뉘고, 그룹 내 상동성은 약 90% 이상, 그룹 간 상동성은 약 78% 이상을 보여주었다 (Kwak et al. 2013b). BBWV2-GS-PF는 두 그룹과의 상동성이 각각 약 76~80% 나타내어, 어느 그룹에도 속하지 않는 것으로 보 인다. 또한, BBWV2 분리주들의 전체 유전자 염기서열을 대 상으로 MEGA X 프로그램의 Maximum likelihood method 을 이용한 계통분석 결과, BBWV2 RNA-1과 RNA-2는 크 게 2개의 그룹으로 나뉘는데, BBWV2-GS-PF의 RNA-1과 RNA-2는 두 개의 그룹에 속하지 않는 새로운 계통으로 분 화된 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 4).
3.3. 잠두위조바이러스2 병원성과 유전학적 특성의 관련성
대조군으로 사용한 BBWV2-RP1 분리주는 고추와 파프 리카에서 약한 모자이크 병징을 보였으나, 본 연구에서 분 리된 BBWV2-GS-PF는 고추와 파프리카에서 모자이크 증 상과 함께 전형적인 원형 반점 증상을 보였다 (Table 2, Fig. 3). 또한, 들깨와 담배 (N. benthamiana)에서도 BBWV2-RP1 은 황화 또는 약한 모자이크 증상을 나타낸 반면 BBWV2- GS-PF는 각각 모자이크와 원형 반점 증상을 나타냈다 (Table 2, Fig. 3). 이전 보고된 연구 결과에 따르면, BBWV2 의 유전자 중 RNA-2는 BBWV2가 감염시킬 수 있는 기주 범위나 병원성 등과 관련이 있으며 (Kwak et al. 2016;Kim et al. 2021), 특히 고추에서 병징의 심도는 RNA-2의 movement protein (MP) 부분에 의해 결정된다고 알려져 있다 (Seo et al. 2017). 위와 같은 이전 연구 결과에 따라서, BBWV2-GS-PF의 병원성 차이가 RNA-2 유전자 차이 때 문이라고 유추할 수 있는데, RNA-2가 encoding하는 아미 노산 상동성을 NCBI에 등록된 BBWV2의 다른 분리주들 과 비교하여 분석한 결과, MP의 아미노산 상동성이 large coat protein (LCP)와 Small coat protein (SCP)보다 비교 적 낮은 것을 확인할 수 있었다 (Table 5). 이러한 RNA-2가 encoding하는 아미노산의 유전적 차이가 실제로 병원성과 연계되는지는 향후 감염성 클론을 제작하여 연구할 계획 이다.
BBWV2는 국내 고추 포장에서 가장 많이 발생하는 바 이러스 중의 하나이다 (Kwak et al. 2013a). 들깨에서 새롭 게 분리된 BBWV2 계통은 들깨에서뿐만 아니라 고추로 확 산될 경우 피해가 우려된다. 새로운 계통에 대한 지속적인 모니터링이 필요할 것으로 사료된다.
적 요
잠두위조바이러스2 (BBWV2)는 경제적으로 중요한 원 예, 관상작물에 심각한 피해를 주는 바이러스 중의 하나 다. BBWV2의 넓은 기주 범위, 매개충 방제의 어려움 등 효과적인 치료제가 없기 때문에, 병을 예방하거나 저항 성 품종의 개발 등을 위해서는 BBWV2의 새로운 분리주 들의 특성 조사와 연구가 필요하다. 본 연구에서는 2019 년 금산지역의 잎들깨 재배농가에서 분리된 BBWV2 분리 주 (BBWV2-GS-PF)의 유전학적·생물학적 특성을 구명하 고 기존에 보고된 분리주들과의 특성을 비교하였다. 순수 분리된 BBWV2-GS-PF는 기존 분리주와 달리 들깨에서 심한 모자이크 증상과 고추에서 원형 반점 증상을 보였다. BBWV2-GS-PF의 유전자 계통분석 결과, 기존에 알려진 2 개의 그룹과 약 76~80%의 비교적 낮은 유전자 상동성을 보이며 계통이 분화된 것을 확인할 수 있었다.
