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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean J. Environ. Biol. Vol.43 No.1 pp.91-101
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2025.43.1.091

Optimization of culture conditions for enhanced production of biomass and fatty acids by freshwater microalga, Tetradesmus obliquus

Shin-young Yun1, Seong-Joo Hong1,2, Min-ju Jeong1, Hyeon-jong Ji1, Sun-Woo Hong1, Choul-Gyun Lee1,2, Chang Soo Lee3, Seung Hwan Lee4, Huisoo Jang1, Hyun-Jin Jang5, Z-Hun Kim6,*, Suk Min Yun3,*
1Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Republic of Korea
2Industry-Academia Interactive R&E Center for Bioprocess Innovation, Inha University, Incheon 22212, Republic of Korea
3Biological Resources Research Department, Nakdonggang National Institute of Biological Resources, Sangju 37242,
Republic of Korea
4Department of Biotechnology and Bioengineering, Chonnam National University, Gwangju 61186, Republic of Korea
5Department of Food Science and Nutrition, Jeju National University, Jeju 63243, Republic of Korea
6Biotech R&D center, Hu EverGreen Pharm Inc., Incheon 21447, Republic of Korea
*Corresponding author Co-corresponding authors Z-Hun Kim Tel. 032-438-7010 E-mail. kimzhun@gmail.com
Suk Min Yun Tel. 054-530-0844 E-mail. horriwar@nnibr.re.kr

Contribution to Environmental Biology


▪ This study provides an effective strategy for increasing biomass production of Tetradesmus obliquus using sequential optimization process.


▪ Microalgal fatty acid content is significantly improved by adjusting N or P in the culture media.


31/12/2024 26/02/2025 04/03/2025

Abstract


Microalgae are efficient fatty acid producers owing to their high photosynthetic activities. They can act as sources of biofuel, feed, and various bioactive compounds. This study aimed to determine optimal culture conditions, including culture medium, temperature, and light intensity, to enhance the biomass and fatty acid content of the indigenous freshwater microalga, Tetradesmus obliquus. Evaluation using a high-throughput photobioreactor revealed that the optimal culture temperature and light intensity were 25°C and 300 μmol m-2 s-1, respectively. Additionally, we optimized components (N, P, and Mg) of the BG-11 medium to enhance the microalgal biomass. Modified BG-11 medium increased the T. obliquus biomass by 37% compared to the standard BG-11 medium. Subsequently, the culture medium was replaced with N- and P-depleted media to determine the abiotic stress factor that could increase the cellular fatty acid content. Notably, fatty acid content was significantly increased from 8.5% up to 14.6% on day 7 of culture in N-deficient (N-P+ and N-P-) media. Sequential optimization effectively increased the biomass by 83% and fatty acid content by >76% in T. obliquus. Our optimization method can be used to enhance the biomass and fatty acid contents of various other microalgae.


Tetradesmus obliquus , statistical optimization , photobioreactor , fatty acid , nutrient starvation

담수 미세조류 Tetradesmus obliquus로부터 바이오매스 및 지방산 생산 향상을 위한 배양조건 최적화

윤신영1, 홍성주1,2, 정민주1, 지현종1, 홍선우1, 이철균1,2, 이창수3, 이승환4, 장희수1, 장현진5, 김지훈6,*, 윤석민3,*
1인하대학교 생명공학과
2인하대학교 산학융합 인터랙티브 바이오공정 혁신 교육연구단
3국립낙동강생물자원관 생물자원연구실
4전남대학교 생물공학과
5제주대학교 식품영양학과
6(주)휴에버그린팜 바이오텍 연구개발센터

초록

    1. 서 론

    미세조류는 수생 생태계의 주요 생산자로서 광범위한 환경 조건에서 서식하며 광합성을 통해 산소를 배출하는 지속 가능한 친환경 생물자원이다. 미세조류는 지구상에 20만 종 이상 서식하는 것으로 알려져 있어, 생물다양성이 풍부하여 잠재적으로 산업적 활용 가능성이 높다 (Nam et al. 2021;Kwon et al. 2024). 미세조류는 최근 들어 급속한 산업화와 화석연료 사용으로 증가한 환경오염원을 효과적으로 제거할 수 있어 큰 장점이 있는 것으로 알려져 있다 (Hou et al. 2024). 또한 육상식물에 비해 고효율의 광합성 기구를 이용하여 대기 중의 이산화탄소를 흡수하고 에너지 밀도가 높은 지질이나 탄수화물뿐만 아니라 생리활성이 우수한 다양한 생물소재 (e.g., 비타민, 색소, 불포화지방산 등)의 생산이 가능하다 (Rizwan et al. 2018). 그 밖에도 가축 사료, 화장품 원료, 바이오 플라스틱 등으로 활용이 가능하여 전세포 (whole cell) 활용 공정의 구축이 가능한 장점이 있다 (Nitsos et al. 2020).

    이 중에서도 미세조류의 지질은 고갈되어 가고 있는 화석연료를 대체할 수 있는 바이오디젤 (biodiesel)뿐만 아니라, 인체 건강에 필수적인 지방산 공급원으로 활용이 가능하다. 인체 생리에서의 지방산은 산화를 통해 얻게 되는 주요 에너지원인 동시에 인지질 구성 및 세포막 형성 등의 중요한 역할을 하고 있어 대사에 반드시 필요하다. 세포막을 구성하는 지방산은 막의 물리적인 유동성과 상관관계가 있으며 세포 신호 전달 과정에 관여하여 생물학적 활동에 영향을 미친다. 또한 많은 지방산이 전사 인자 발현이나 생리활성을 조절하는 기능을 가지고 있어 지방산 산화, 지단 백질 합성, 호르몬 생산과 같은 대사 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Calder 2015;De Carvalho and Caramujo 2018). 미세조류는 지방산의 함량이 높고 특히 생리활성이 우수한 불포화 지방산이 풍부하여 지방산 섭취의 불균형을 이루는 현대 식단을 보조할 방안으로도 주목받고 있다 (Conde et al. 2021).

    미세조류로부터 지방산을 효과적으로 생산하기 위해서는 종의 생리적 특성을 이해하여 배양 조건을 설정하여야 한다. 연구 보고에 따르면 생장과 지질 유도 과정이 나눠져 있는 2단계 배양법이 널리 활용되고 있다. 구체적으로 1단계에서는 배양 조건에 대한 최적화로 바이오매스 생산성을 극대화한 후에, 그 다음 단계로 생장은 증가하지 않는 상태에서 지방산의 축적을 유도하는 비생물학적 스트레스 (abiotic stresses)를 적용하여 지방산 함량을 증가시키는 전략이다 (Su et al. 2011). 예를 들어, 최근 연구에서 미세조류의 생장과 지방산의 생산성은 pH, 온도, 광도 (Sakarika and Kornaros 2016;Chaisutyakorn et al. 2018;Maltsev et al. 2021), 배지 내의 영양염의 농도 (e.g., 질소, 인, 마그네슘) (Kamalanathan et al. 2015;Polat et al. 2020;Abomohra et al. 2022), 염도 (Elloumi et al. 2020;Kim et al. 2021) 등 다양한 비생물학적 스트레스의 영향을 받는다. 또한 특정 영양염의 농도에 따른 배지 조성은 미세조류의 생장과 지방산의 생산성에 직결된다. 보고에 따르면, Chlorella는 질소 결핍 조건에서 지질 함량이 증가하였으며 (Chu et al. 2019), Scenedesmus sp.는 인 공급원 제한 조건에서 지질 축적 증가를 확인하였다 (Xin et al. 2010). 마그네슘은 엽록소 분자의 구성 요소이며, 생체 내 아세틸-CoA 카복실화효소 (acetyl-CoA carboxylase) 활성을 향상시켜 지방산 합성을 강력하게 조절이 가능한 것으로 알려져 있다 (Polat et al. 2020). 따라서 미세조류는 종에 따라 배양 시 효과적인 스트레스 조건이 다름으로 종에 대한 가장 효과적인 배양 환경을 찾고 적용하는 것이 지방산 생산성 증대에 효과적일 것이다.

    본 연구에서는 국내 담수에서 분리한 녹조류인 Tetradesmus obliquus KGP-10을 이용하여 바이오매스 생산의 극대화를 위한 기초 배양 조건 (온도, 광도)을 탐색하였다. 또한 통계적 방법으로 배양배지 조성 (질소, 인, 마그네슘) 을 최적화하여 조류주 생장 맞춤형 배지 개발로 바이오매스 생산성을 증가시키고자 하였다. 최종적으로 질소나 인이 결핍된 조건에 노출시켜 효과적인 지방산 함량 증대 방법을 선별하여 효율적인 생물공정을 구축하고자 하였다.

    2. 재료 및 방법

    2.1. 미세조류주 및 유지

    본 연구에 사용된 담수 미세조류인 Tetradesmus obliquus KGP-10은 강원도 강릉시 주문진읍 향호리 향호 (37°54ʹ 45.8ʺN 128°48ʹ36.5ʺE)에서 분리하였다. 세포는 BG-11이 100 mL가 담긴 250 mL Erlenmeyer 플라스크에 분주하여 배양하였다. BG-11의 조성은 NaNO3 1.5 g L-1, K2HPO4 0.04 g L-1, MgSO4·7H2O 0.075 g L-1, CaCl2·2H2O 0.036 g L-1, citric acid 0.006 g L-1, ferric ammonium citrate 0.006 g L-1, EDTA (disodium magnesium salt) 0.001 g L-1, Na2CO3 0.02 g L-1, Trace-metal mix A5 (H3BO3 2.86 g, MnCl2·4H2O 1.81 g, ZnSO4·7H2O 0.222 g, Na2MoO4· 2H2O 0.39 g, CuSO2·5H2O 0.079 g, Co(NO3)2·6H2O 0.0494 g L-1) 1 mL L-1이며, 제조된 배지는 121°C, 1.5기 압에서 15분간 멸균한 후 사용하였다. T. obliquus가 접종된 플라스크는 진탕 배양기 (VS-8480SF; Vision Scientific Co., Ltd., Daejon, Korea)에서 130 rpm의 회전 속도로 배양하였다. 온도는 22±1°C를 유지하였으며, 50 μmol m-2 s-1의 광도를 연속적으로 공급하였다. 생물학적으로 활성을 보이는 안정적 조류주 보존을 위해 10일 간격으로 주기적인 계대배양을 실시하였다.

    2.2. T. obliquus 의 최적 생장 온도 및 광도 조건 탐색

    T. obliquus의 생장에 적합한 온도 및 광도 조건 탐색을 위해 고처리 광생물반응기 (PhotoBiobox; Shinhwa Science, Daejeon, Korea)를 이용하였다. 접종 농도를 일정하게 하기 위해 Multimode Plate Reader Victor X3 (PerkinElmer, Singapore)로 OD720에서의 흡광도를 측정하여 0.045로 조절하였으며, 24-well culture plate (Eppendorf, Hamburg, Germany)에 2 mL씩 분주하여 접종하였다. 온도는 15°C 부터 40°C까지 5°C 간격으로 총 6구간을 설정하였으며 (n=6), 광도의 경우 50 μmol m-2 s-1부터 450 μmol m-2 s-1까지 총 4구간을 설정하였다 (n=4). 48시간 동안 배양하여, OD720에서의 배양 전과 후의 흡광도 차이를 구하고 Eq. 1을 이용하여 생장 평가를 수행하였다 (Yim et al. 2022).

    μ = ln ( X 2 ) − ln ( X 1 ) t 2 − t 1
    (Eq. 1)

    μ는 비생장속도 (day-1)이며, X1과 X2는 두 배양 시점 t1과 t2에서의 세포 농도 (g L-1)를 나타낸다.

    2.3. T. obliquus 의 생장 증대를 위한 배지 조성 최적화

    T. obliquus의 생장 증대를 위한 배지 최적화를 위해 MINITAB (V14.12, Minitab Inc., State College, PA, USA) 을 이용하였다. 생장에 중요한 영향을 미치는 인자를 평가하기 위해 BG-11 내 질소 (nitrogen), 인 (phosphorus) 및 마그네슘 (magnesium) 함량을 실험인자로 선정하였고, Appendix Table A1과 같이 3단계로 수준을 설정하여 실험을 진행하였다. 미세조류 생장을 분석하기 위해 100 mL (운전 부피 80 mL)의 원통형 광생물반응기 8기로 구성된 다중 배양기 (Multi-cultivator; MC1000-OD, PSI, Drasov, Czech) 2기를 이용하였다. 배양 조건은 고처리 광생물반응기 실험 결과를 이용하여 배양하였다. 샘플은 24시간 간격으로 채취하여 Coulter Counter (Multisizer 4e; Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA)로 정밀하게 세포 농도를 측정하였다.

    측정된 세포 농도와 실험인자 간 상관성은 Eq. 2를 이용하여 2차 회귀함수를 통해 도출하였다. 2차 회귀함수의 종속변수인 세포 농도와 독립변수인 실험인자 값의 상호 관계에 따라 반응표면분석법에 기반한 모델, 일차항, 이차항, 교차항 및 적합성의 유의성 (p-value) 여부를 확인하였고 (p<0.05), 결정계수 (R2)를 확인하여 예측치와 실험값의 합치도에 기반한 회귀함수의 신뢰도를 판정하였다.

    Y = β 0 + ∑ i = 1 k β i X i + ∑ i = 1 k β i i X i 2 + ∑ ∑ i < j β i j X i X j + ε
    (Eq. 2)

    Y는 반응값으로 세포 농도 (g L-1)를 나타내며, Xi와 Xj는 실험인자 값으로, β0과 βi, βii, βij는 절편항과 계수를, ε은 오차항을 의미한다. 본 연구에서는 3가지 요인에 대해 배양 실험을 수행하여 Eq. 2를 이용하여 회귀방정식을 도출 하였다. 결과는 3차원 그래프를 사용하여 분석되었으며, Minitab statistical software의 최적화 도구를 이용해 세포 생산 및 성장 속도를 최적화하기 위한 값을 선정하였다.

    2.4. T. obliquus 의 생장 최적화 배지의 검증

    T. obliquus의 배양에 최적화된 질소, 인 및 마그네슘 함량에 따른 배지 조성의 영향을 평가하기 위해 대조군 배지와의 비교 검증을 진행하였다. 세포에 남아 있는 배지 성분을 제거하기 위해 3,200 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포를 침전하여 상등액을 제거한 후, 세포만을 회수 하였다. BG-11 배지와 같은 조성을 가진 대조군 배지 (표준 BG-11)와 최적화된 배지에 미세조류를 0.1 g L-1로 0.5 L 원통형 광생물반응기 (bubble column photobioreactor, BC-PBR)에 접종하였다 (n=2). 가스공급은 0.2 vvm으로 2% 이산화탄소가 포함된 공기를 연속적으로 광생물반응기 하단으로부터 폭기하였다. 광도와 온도 조건은 동일하게 실시하였다. 샘플은 24시간 간격으로 채취하여 Coulter Counter를 이용하여 세포 농도와 생장을 분석하였다.

    2.5. 질소와 인의 결핍에 따른 T. obliquus 의 생장 및 지방산 분석

    배지 내 질소와 인의 결핍 조건에 따른 미세조류 생장 및 지방산 생산 변화를 분석하기 위해 Table 1과 같이 배지를 준비하였다. 질소 또는 인 단일결핍 조건은 질소와 인이 결핍된 BG-11 배지에서 NaNO3 747 mg L-1와 K2HPO4 34 mg L-1를 각각 첨가하여 배양하였고, 질소와 인 복합결핍 조건은 질소와 인이 모두 결핍된 배지에서 배양하였다. 최적 배양 조건인 온도 25°C, 광도 300 μmol m-2 s-1 조건 으로 0.5 L 원통형 광생물반응기를 이용하여 배양하였다 (n=2). 원활한 광합성과 탄소원 공급을 위해 5% 이산화탄소가 혼합된 공기를 반응기 하단부로부터 0.1 vvm으로 공급하였다.

    2.6. T. obliquus 의 지방산의 함량 및 조성 분석

    T. obliquus의 지방산 측정은 직접 전이에스테르화 (transesterification) 반응을 통한 지방산 메틸에스테르 (Fatty acid methyl ester, FAME) 유도체화와 가스 크로마토그래피 (gas chromatography)를 이용하였다. 미세조류 배양액 150 mL를 50 mL conical tube 3개에 나누어 담고, 3,200 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 세포 만을 회수하였다. 수확한 세포는 -20°C에서 12시간 이상 냉동한 뒤, 동결건조기 (LP 10; ilShinBioBase, Korea)로 -80°C에서 동결건조하였다. 동결건조 샘플 20 mg에 내부 표준물질인 C19 : 0 지방산 (Supelco, Bellefonte, PA, USA) 100 μL를 첨가하고 메탄올 (methanol)로 희석한 5% (w v-1) 아세틸 클로라이드 (acetyl chloride) 1 mL와 혼합한 다음 오븐에 80°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응물에 헥산 (n-hexane) 1 mL를 넣어 FAME을 추출하였다. FAME 함량과 지방산 조성은 가스 크로마토그래프 (Acme 6000 GC; Younglin, Seoul, Korea)를 이용하여 분석하였다. 초기 오븐 온도 140°C에서 1분간 정치하였고, 240°C까지 5°C min-1로 승온하여 10분간 정치하였다. Capillary column (HP-INNOWax; Agilent, CA, USA)으로 유량 3 mL min-1의 헬륨가스를 이동상으로 이용하였다. 샘플을 주입하고 FAME standard mixture (F.A.M.E. MixC4-C24; SUPELCO, Bellefonte, PA, USA)와 미세조류 유래 FAME 의 체류 시간을 비교하여 미세조류 세포 내 지방산 함량과 조성을 구하였다.

    3. 결과 및 고찰

    3.1. T. obliquus 생장 온도 및 광도 조건 탐색

    T. obliquus의 최적 배양 온도 및 광도를 탐색하기 위해 고처리 광생물반응기를 이용하여 온도 15~40°C, 광도 50~450 μmol m-2 s-1에서 각각 48시간 배양하였다. Figure 1에 도시된 것처럼, 온도별 배양실험에서는 25°C 에서 0.27±0.05 day-1로 비교군 중 가장 높은 생장을 보였으며, 이상의 온도에서는 생장이 감소하는 경향을 보였다. 광도별 실험에서는 300 μmol m-2 s-1까지는 공급된 광도에 비례적으로 생장이 높아졌다. 이보다 높은 광 조건 (450 μmol m-2 s-1)에서는 유의미한 생장의 증가는 확인하지 못하였다. 따라서 상기 실험에서 확인한 온도와 광도 조건인 25°C와 300 μmol m-2 s-1를 T. obliquus 실험의 기본 배양 조건으로 활용하였다.

    3.2. BBD 모델을 이용한 T. obliquus 배지 최적화

    T. obliquus의 배지 조성 변화로 생장을 증가시키기 위해 통계적 방법을 통한 배지 최적화를 수행하였다. 본 연구는 BG-11을 기본 배지로 하여 박스-벤켄 설계법 (Box- Behnken design, BBD) 모델로 실험을 설계하였다. 박스- 벤켄 설계법은 1960년에 Box와 Behnken에 의해 발표된 반응표면설계의 일종으로 적은 실험 횟수로도 분석이 가능하고 여러 가지 독립변수들의 반응관계의 해석이 가능하다는 장점이 있어 생물의 최적 조건 수립에 활용되고 있다 (Gilmour 2006;Hong and Lee 2008;Kim and Park 2010). T. obliquus의 생장 증가를 위해 BG-11의 질소, 인 및 마그네슘을 실험인자로 설정하였다. 이들은 미세조류가 생장에 필수적인 주요 영양 성분으로 단백질과 엽록소의 구성성분일 뿐만 아니라, 생체에너지 생산 및 세포 분열 등에 다양한 중요 세포 대사에 관여하여 미세조류의 생장과 바이오매스에 직접적인 영향을 미칠 수 있기 때문이다 (Hong and Lee 2008). 질소 농도의 중간값은 BG-11 의 절반의 농도로 설정하였고, 인과 마그네슘의 중간값은 BG-11의 농도로 설정하였다 (Rippka et al. 1979). 각 변수의 농도 범위와 질소 농도의 중간값은 기존에 보고된 담수 미세조류 Chlorella pyrenoidosa의 배지 성분 최적화에 대한 실험설계를 참고하였다 (Bajwa et al. 2019).

    T. obliquus 배지 최적화를 위해서 BBD 실험 계획에 따라 T. obliquus를 다중 배양기에서 4일간 배양하며, 세포 농도 (g L-1) 변화를 측정하였다. 이때 온도는 25°C, 광도는 300 μmol m-2 s-1 조건에서 실험을 진행하였다. Figure 2에 도시된 것처럼, T. obliquus의 생장은 총 13종의 다른 조성의 배지에서 다르게 나타났다. 세포의 생장 데이터와 영양염 농도의 상관성을 알아보기 위해 통계 분석을 수행하였다. Table 2에서는 반응표면분석을 통해 회귀변수와 p-value에 대한 분석 결과를 나타냈다. Eq. 3은 반응치인 세포 농도 (Y)에 대한 각 독립변수인 실험인자 값들의 2차 회귀방정식이다.

    Y = 0.417 + 0.0774 X 1 − 0.00459 X 2 + 0.0317 X 3 − 0.0931 X 1   2 − 0.0534 X 2   2 − 0.0557 X 3   2 − 0.0247 X 1 X 2 + 0.0931 X 1 X 3 + 0.00760 X 2 X 3
    (Eq. 3)

    Eq. 3에서 X1, X2, X3는 각각 NaNO3, K2HPO4, MgSO4· 7H2O이다. 결정계수 R2은 92.8%로 나타나며, p-value는 0.021로 나타났다. 각 실험인자 값인 독립변수의 p-value 는 X1=0.005, X2=0.792, X3=0.113으로 나타났다. 이에 따라, 질소원인 NaNO3 (X1)는 통계적으로 유의한 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 실험인자 간 상호작용은 Table 2에 나타난 X1X2, X1X3, X2X3로 각각 NaNO3와 K2HPO4, NaNO3와 MgSO4·7H2O, K2HPO4와 MgSO4·7H2O를 의미한다. 이 가운데 X1X3의 p-value는 0.010으로 나타나, 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다. Table 2에서 가장 큰 계수를 가진 NaNO3와 MgSO4·7H2O를 주요 영향 변수로 해석할 수 있으며, 마찬가지로 상호작용 중에서는 NaNO3 와 MgSO4·7H2O 간의 상호작용 (X1X3)이 가장 큰 것으로 확인되었다. 반면, K2HPO4, MgSO4·7H2O, NaNO3와 K2HPO4, K2HPO4와 MgSO4·7H2O는 개별적으로는 유의하지 않지만, 모델의 해석 가능성과 상호작용의 영향을 고려하여 회귀식에 포함되었다.

    질소와 마그네슘 결핍은 광합성 생물의 백화증 (decolorization) 과 생장 지연을 유발하며, 둘 중 하나만 부족해도 엽록소 함량이 감소된다고 알려져 있다 (Hermans and Verbruggen 2005;Cakmak and Kirkby 2008). 마그네슘은 질산염 수송체를 활성화하여 질산염의 흡수를 촉진시켜 NaNO3와 MgSO4·7H2O의 상호작용이 주요하게 나타난 것을 뒷받침한다 (Peng et al. 2020).

    바이오매스 생산을 최적화하기 위해 2차 회귀함수를 Figure 3과 같이 3차원 그래프로 바이오매스와 NaNO3, K2HPO4, MgSO4·7H2O의 관계를 시각화하고자 하였다. Figure 2를 통해 1개의 실험인자를 고정하고, 2개의 실험인자를 변화시켜 세포 농도에 미치는 영향과 상호작용을 확인할 수 있었다. 세포 농도는 NaNO3 747 mg L-1, K2HPO4 34 mg L-1, MgSO4·7H2O 147 mg L-1 조건에서 2차 회귀방 정식의 최댓값인 0.47 g L-1임을 확인하였다.

    3.3. 최적 배양배지를 이용한 T. obliquus 의 생장 검증

    BBD 모델을 이용하여 얻은 T. obliquus의 세포 농도가 최대가 되는 질소, 인 및 마그네슘 함량이 실제로 생장 증대에 유의미하게 기여하는지 확인하기 위해 대조군 배지와의 생장 비교 검증 실험을 진행하였다. T. obliquus를 0.5 L 원통형 광생물반응기에서 4일간 배양하며 세포 농도 (g L-1)를 측정하였다. Figure 4a에 나타난 것처럼, 대조군 배지 (표준 BG-11)의 세포 최고농도 배양 4일째 0.73±0.18 g L-1를 얻었으며, 최적화 배지의 경우 배양 3일째인 0.96± 0.05 g L-1로 대조군에 비해 37% 높았다. 이를 바이오매스 생산성으로 비교하면 최적화 배지의 경우 0.33±0.02 g L-1 day-1로 대조군 배지 (0.18±0.01 g L-1 day-1)에 비해 83% 향상된 수치이다 (Fig. 4b). 따라서 상기 실험 결과로부터 BG-11 내 주요성분을 T. obliquus에 생장에 맞게 최적화함으로써 향상된 바이오매스 농도와 생산성을 확보할 수 있었다.

    3.4. 질소와 인의 결핍에 따른 미세조류 생장 및 지방산 분석

    미세조류는 배양환경이 변화하면 생존을 위해 빠르게 대사활동 변경이 가능하여 필요한 특정 대사물질을 높게 축적하는 경향이 있다. 이러한 특징을 이용하여 미세조류로부터 목적산물의 함량과 생산성을 향상시킬 수 있는 효과적인 배양전략으로 활용이 가능하다. 특히 지방산 생산의 경우 배지 내에 사용가능한 질소나 인의 농도가 감소하면 세포의 생장 및 분열보다는 에너지 밀도가 높은 탄화수소 화합물을 축적하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 미세조류 세포 내 지방산의 함량의 증가를 위해, 질소나 인이 결핍된 BG-11에서 배양하여 지방산 생산 증대에 효과적인 비생물학적 스트레스 조건을 찾고자 하였다.

    Figure 5는 질소나 인이 결핍된 배지에서 7일간 생장한 T. obliquus의 생장곡선과 지방산 함량과 조성을 분석한 데이터이다. 세포 내의 지방산의 분석에 필요한 세포 농도를 확보하고자, 접종 농도를 3.5 g L-1로 시작하였다(Appendix Table A2). Figure 5a에서 알 수 있듯이, 미세조류의 분열에 필요한 성분의 결핍으로 인해 뚜렷한 세포 분열과 생장은 확인되지 않았다. 이에 반해, 지방산의 함량은 N-P+ 배지에서는 15.4%, N+P- 배지에서는 9.57%, N-P- 배지에서 는 13.9%로 분석되어 대조군 (표준 BG-11)의 8.5%에 비해 확연한 증가를 확인하였다 (Fig. 5b). 특히 인의 결핍보다는 질소의 결핍에서 보다 효과적인 지방산 유도가 확인 되었으며, 이를 통해 T. obliquus로부터 지방산 유도는 질소가 큰 영향을 미치는 것으로 사료된다. 같은 종으로 질소와 인의 농도별로 배양한 연구 보고에서도 지질 생산에 질소의 농도가 인의 농도보다 더 크게 기여하는 결과와 일치한다 (Kim et al. 2019). 지방산의 조성적인 측면에서는 배양 조건과 달라져도 조성의 큰 변화는 확인되지 않았다. T. obliquus의 주요한 지방산은 탄소사슬 (carbon chain) 16개에서 18개를 갖는 지방산이 대부분이었으며, palmitic acid (C16 : 0), linoleic acid (C18 : 2), oleic acid (C18 : 1) 순으로 함량이 높았다. 기존의 Tetradesmus 연구와 비교하였을 때, arachidic acid (C20 : 0)와 behenic acid (C22 : 0)가 일부 검출되었지만, 주요한 지방산 조성은 주로 C16 : 0, C18 : 1, C18 : 2, C18 : 3이며 총 지방산 함량의 80% 이상을 차지하고 있었다. Tetradesmus종은 긴 탄소 사슬의 지방산보다는 탄소 16개와 18개의 지방산을 생산하는 종적 특성을 갖는 것으로 사료된다 (Rajabi and Assareh 2019;Gao et al. 2021).

    4. 결 론

    본 연구에서는 국내 담수에서 신규 분리된 미세조류인 Tetradesmus obliquus로부터 바이오매스 및 지방산 생산성 향상을 위해 배양 조건에 대한 최적화 실험을 수행하였다. 미세조류 생장에 중요한 온도와 광도 조건을 탐색하여 적정 조건을 확보할 수 있었다. 생장 증대를 위한 맞춤형 배지를 제작하기 위해, Box-Behnken design을 이용한 배지 조성의 통계적 최적화를 수행하였다. 그 결과 질소, 인, 마그네슘 함량을 균형적으로 조정하여, 표준 BG-11 배지보다 바이오매스 농도와 생산성은 각각 37%와 83% 향상시킬 수 있었다. 지방산의 프로파일을 분석한 결과 탄소가 16 개에서 18개의 지방산이 주를 이루고 있었으며, 함량에는 큰 차이가 없는 것으로 확인되었다. 최종적으로 세포 내지 방산 함량 증가를 위해 질소 혹은 인이 결핍된 배지에서 배양한 결과 질소가 결핍된 배지에서 인이 결핍된 것보다 지방산 함량 증가가 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 본 연구의 결과는 신규 발굴된 미세조류의 배양 조건을 최적화하고 지방산을 효과적으로 증대하는 데 유용하게 활용될 수 있을 것이라 기대된다.

    적 요

    미세조류는 광합성 능력에 기인하여 바이오 연료, 가축 사료, 생리활성 물질 등으로 활용이 가능한 효율적인 지방산 생산자이다. 본 연구에서는 미세조류의 바이오매스와 지방산 함량을 증대하기 위해 토착 담수 미세조류인 Tetradesmus obliquus의 배지 조성, 온도, 광도의 배양 조건을 최적화하고자 하였다. 먼저, 고처리 광생물반응기를 이용하여 최적 배양 온도와 광도를 각각 25°C와 300 μmol m-1 s-1로 결정하였다. 그 후 T. obliquus의 바이오매스 생장 향상을 위해 BG-11의 구성 성분 (N, P, Mg)에 대한 통계적 최적화를 수행하였다. 최적 배지는 표준 배지 (BG- 11)에 비해 바이오매스 생산량이 37% 증가하는 것으로 확인되었다. 최종적으로 최적 배지를 질소 또는 인의 단일 결핍과 복합결핍 배지로 교체하여 세포 내 지방산 함량을 증가시킬 수 있는 적절한 비생물적 스트레스 인자를 탐색하였다. 실험집단 중 N 결핍 배지 (N-P+, N-P-)에서 배양된 미세조류의 지방산 함량은 7일째에 8.5% (대조군) 에 비해 최대 14.6%까지 증가한 것으로 나타났다. 그 결과, 바이오매스 생산성이 83% 향상되었을 뿐만 아니라 지방산 함량 또한 76% 이상 증가하였다. 본 연구 결과는 신규 분리된 미세조류로부터 바이오매스 및 지방산 생산을 위한 근본적인 배양 조건 최적화 기법으로 활용될 수 있을 것 이다.

    사 사

    이 연구는 환경부의 재원으로 국립낙동강생물자원관에서 지원을 받아 수행된 연구입니다 (NNIBR20253102).

    CRediT authorship contribution statement

    SY Yun: Investigation, Methodology, Visualization, Writing-Original draft. SJ Hong: Investigation, Methodology, Writing-Original draft. MJ Jeong: Investigation, Methodology, Visualization, Writing-Original draft. HJ Ji: Investigation, Methodology, Visualization, Writing- Original draft. SW Hong: Investigation, Methodology, Visualization. CG Lee: Conceptualization, Writing- Review & editing. CS Lee: Conceptualization, Writing- Review & editing. SH Lee: Conceptualization, Formal analysis. H Jang: Conceptualization, Visualization. HJ Jang: Methodology, Visualization. ZH Kim: Conceptualization, Investigation, Methodology, Visualization, Writing-Original draft, Writing-Review & editing. SM Yun: Conceptualization, Investigation, Methodology, Visualization, Resources, Writing-Review & editing.

    Declaration of Competing Interest

    The authors declare no conflicts of interest.

    Figure

    KJEB-43-1-91_F1.gif

    Growth profiles of Tetradesmus obliquus KGP-10 under various light intensity (a) and temperature (b).

    KJEB-43-1-91_F2.gif

    Growth profiles of Tetradesmus obliquus KGP-10 under different N, P, and Mg concentrations of BG-11 media prepared as shown in Table 1.

    KJEB-43-1-91_F3.gif

    Three-dimensional response plot showing effects of (a) NaNO3 and K2HPO4, (b) NaNO3 and MgSO4·7H2O, and (c) NaNO3 and MgSO4·7H2O.

    KJEB-43-1-91_F4.gif

    Time profile of Tetradesmus obliquus growth (a) and a comparison of biomass productivity cultivated in BG-11 and modified BG-11.

    KJEB-43-1-91_F5.gif

    Growth (a) and fatty acid (b) profiles of Tetradesmus obliquus cultivated in N and/or P deficient modified BG-11.

    Table

    Coded levels and real values of three variables

    Three variables and corresponding response values using Box-Behnken design model

    Statistical analysis of coefficients for biomass (g L-1)

    Experimental conditions of nitrogen and phosphorus in modified BG-11 used in this study

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    Vol. 40 No. 4 (2022.12)

    Journal Abbreviation 'Korean J. Environ. Biol.'
    Frequency quarterly
    Doi Prefix 10.11626/KJEB.
    Year of Launching 1983
    Publisher Korean Society of Environmental Biology
    Indexed/Tracked/Covered By

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