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서 론

분류군 Flavobacteriaceae 과에는 Chryseobacterium을 비롯한 40여 속이 존재하며, 이 분류군 속중에는 2000년대 이후에 새롭게 만들어진 분류군이 많이 존재한다 (Bernardet and Bowman 2006). Flavobacterium 속은 Bacteroidetes 문 중에서 가장 큰 분류군으로 최근에 F. algicola (Miyashita et al. 2010), F. beibuense (Fu et al. 2011), F. ponti (Yoon et al. 2011), F. sinopsychrotolerans (Xu et al. 2011) 등 많은 종이 분류되고 있다.

일반적으로 Flavobacterium 속은 노란색의 colony를 가지고 있으며, flexirubin pigment를 생산하는 것으로 알려져 있다(Bernardet et al. 2002). Flavobacterium 속은 다 양한 민물 환경에서 주로 발견되고 있다(Bernardet et al. 2002; Bernardet and Bowman 2006). 특히 오염된 민물이 아닌 자연하천, 호수에 폭 넓게 분포하며, 심지어는 저온환경에서도 분리되고, 민물 환경내의 다양한 생물 안에 서도 발견되고 있다. 특히 Flavobacterium columnare는 fish에서 lethal columnaris 병과 관련이 있고, Flavobacterium scophthalmum은 Scophthalmus maximus에서 turbot 병과 관련이 있는 것으로 알려져 있다 (Mudarris et al. 1994; Pilarski et al. 2008). 그 외에 여러 Flavobacterium 속에 속하는 여러 종이 수계내에서 어류 병원성 미생물 로 관심을 받고 있다(Tiirola et al. 2002). 또한 Flavobacterium 속은 생태학적으로 호수와 강에서 다양한 효소와 2차 대사 산물을 생산해 다른 미생물 등의 성장에 이바지 하는 것으로 알려져 있다 (Pérez-Pascual et al. 2003). 이 Flavobacterium 속은 강과 호수내에서 가장 기본, 기초가 되는 분류군이지만 기존의 연구는 과단위의 분류 군에 대한 군집조사가 이루어져 왔기때문에 16S rRNA 등을 이용한 유전자 분석법으로 분석한 종과 속단위의 군집을 조사한 최근 자료는 거의 없는 실정이다.

소양호는 국내 최대의 담수호로서 많은 미생물 자원 및 생물 자원이 존재한다. 환경에 유입된 질소, 인산이 성층현상으로 인해 소양호내에서 서서히 순환되는 현상에 대한 연구가 많이 진행되어 왔으며 이러한 소양호의 미생물 군집에 대한 연구는 항상 기본적으로 이루어져왔다. 

본 연구는 우리나라 최대의 담수호인 소양호에서 4월과 6월에 시료채취를 하여 미생물을 분리하였다. 분리한 균주 중에서 특이하게 많이 발견되었던 Flavobacterium을 대상으로 동정하였으며, 이 동정의 결과, 기존 논문에 보고되지 않았던 Flavobacterium 속의 균주를 선별하였다. 그리고 선별한 Flavobacterium 속의 균주들을 대상으로 생리적 특징과 세포내 지질을 조사하여 소양호 내에서의 생태학적 중요성을 살펴보고자 하였다. 

재료 및 방법

1. 시료 채취

시료 채취 장소는 강원도 인제군의 소양호 상류에서 2지점을 선택하여 실시하였다 (Fig. 1). 온도, 전기전도도, pH는 시료 채취 후 즉시 측정하였다. 소양호에 존재하는 양이온과 음이온은 이온측정 장치를 이용하여 측정하였다. 또, 채취한 시료는 냉장보관 상태로 이동하여, nutrient agar (NA: beef extract 3 g, peptone 5 g, NaCl 7 g, agar 15 g L^-1)와 R2A agar (Difco)를 이용하여 10⁰부터 10⁶까지 희석한 시료를 도말하고, 20^oC에서 배양하여 순수 분리하였다. 

Fig. 1. Sampling sites of Lake Soyang.

2. 선별된 균주의 16S rRNA 염기서열 분석

각 배지에서 노란색 colony를 형성한 균주를 대상으로 colony direct PCR을 실시하였다. 순수 분리된 단일 colony를 Lysis Buffer (Trs-Cl pH 8.0 20%) 50 μL에 넣고 끓인 시료를 templet DNA로 사용하였다. 추출된 DNA를 template로 하여 16S rRNA 증폭을 위한 PCR을 수행하였다. PCR반응은 추출한 DNA template에 TaKaRa Ex Taq^TM (5 unit μL^-1), 10× Ex Taq^TMTM buffer, MgCl₂ (25 mM), dNTP mixture (2.5 mM each) 그리고 27F (5′-AGR GTT YGA TYM TGG CTC AG-3′)와 1492R (5′-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) primer를 첨가하여 총량을 50 μL가 되게 하였다. DNA의 증폭을 위해서 denaturation은 94^oC, annealing은 58^oC, elongation은 72^oC에서 30 cycle을 수행하였다. 증폭된 DNA는 solgent사에 의뢰하여 염기서열을 확인하였다. 각 균주의 염기서열은 EzTaxon server 2.1(http://www.eztaxon.org)에 따라 종명을 동정하였다. 동정된 균주들 중에서 Flavobacterium으로 분리된 colony를 선택하였다. 분리된 균주의 계통관계를 파악하기 위하여, EzTaxon server database (Chun et al. 2007)와 GenBank(http://ncbi.nlm.nih.gov)의 database로부터 확인된 염기서열을 MEGA program (Tamura et al. 2007)을 이용하여 neighbour-joining method (Saitou and Nei 1987)를 사용하여 계통도를 작성하였다.

3. 형태 및 생화학적 특성

분리된 균주의 형태학적 특징을 알아보기 위하여 Gram staining과 oxidase와 catalase test를 실시하였다. 또, 분리된 균의 최적 생장 환경을 검토하기 위하여 온도, pH, 염분의 조건을 조절한 R2A broth에 균주 배양액을 1%(v/v)가 되도록 접종하여 균주의 생육 정도를 조사하였다. 균주 배양액은 균주를 각각 R2A broth에 접종하여 20^oC에서 2일간 배양한 후 실험에 사용하였다. R2A broth에 균주 배양액을 1%씩 접종한 후 배양온도를 4, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 42℃로 각각 달리하여 배양하면서 24시간 간격으로 10일간 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 생장을 확인하였다. R2A broth에 NaOH 및 HCl을 이용하여 각각 pH 5, 6, 7, 8, 9로 조절한 후 균주 배양액 1%를 접종하여 20^oC에서 10일간 생장을 확인하였다. R2A broth에 NaCl 농도를 0, 0.5, 1, 1.5%로 조절한 후 균주 배양액 1%를 접종하여 20^oC에서 배양하며 생장을 확인하였다. 균주들의 생화학적 생리 상태를 알아보기 위하여 API 20NE kit (bioMérieux, France)를 사용하였다. 제조회사에서 제시한 실험 방법에 따라 균을 현탁하여 API 20NE strip(bioMérieux, France)에 접종한 다음 20^oC에서 배양하면서 24시간, 48시간 후 미생물 증식에 의한 색의 변화 여부를 관찰하였다.

4. 균체 지방산 조성 분석

분리된 Flavobacterium의 지방 조성을 알아보기 위하여 지방산 추출을 하였다. 지방산 추출은 R2A 배지에서 20^oC, 48시간 배양한 Flavobacterium을 tube에 모은 다음 1mL의 reagent 1 (NaOH 45 g, methyl alcohol 150 mL, DW 150 mL)을 첨가하여 10초간 혼합한 후 100^oC에서 5분간 끓여 주었다. 다시 10초간 혼합한 뒤 100^oC에서 25분간 끓이고 1분간 식혔다. 이 tube에 2mL의 reagent 2 (6N HCl 325 mL, methyl alcohol 275 mL)를 첨가하여 10초간 혼합한 후 80^oC에서 10분간 끓인 뒤 1분간 냉각 한다. Reagent 3 (Hexane 150 mL, Methyl tert-Butyl Ether 150 mL)를 1.25mL 첨가한 후 10분간 혼합한 뒤, pasteur pipette으로 tube 바닥에 가라앉은 용액을 제거하였다. Reagent 4 (NaOH 10.8 g, DW 900 mL)를 3 mL 넣고 5분간 혼합한 다음 분리된 상층을 pasteur pipette을 이용하여 GC vial에 담았다. 분리한 지방산 분석은 GC (model 7890: Hewlett Packard)를 이용하였으며, 분석용 칼럼은 25m×0.2 mm phenyl methyl silicone fused silica Capillary column을 사용했고 분석온도는 Injection part: 250^oC, Oven part: 170~270^oC 그리고 Detection part: 300^oC로 분석을 진행하였다. Sherlock software를 이용하여 GC에서 분석된 chromatogram과 data를 분석하여 이를 library와 대조하여 지방산을 명명하였다. 

결과 및 고찰

소양호는 인공호로서 체류시간이 길고, 깊이마다 다양한 물 환경을 지니고 있으며, 겨울철의 수온 약층의 파괴로 수계환경의 대류 현상이 일어나고 있다(Choi et al. 1993). 이러한 이유로 어려가지 생물상의 변화가 다양하게 존재한다. 소양호는 다양한 민물 생태환경을 갖는 우리나라의 대표적인 담수호로서 그 동안 수많은 미생물의 분포에 대한 연구가 진행되어 왔다(이 등 1988; Ahn et al. 1989; Kim et al. 1989; Kim et al. 1994; Choi et al. 2001). 대부분의 Flavobacterium은 육지내의 호수 또는 강에 널리 분포하여 자라는 대표적인 미생물로 알려져 왔다. Flavobacterium은 환경내에서 영양분의 재순환과 분해에 관여하며, 고영양 상태의 환경이 아니라 저영양상태의 환경에서 매우 중요한 위치를 차지하는 것으로 보고되고 있다. 또, 최근 일부의 Flavobacterium에서 어류에 병원성이 존재하는 것으로 보고되어, 환경 내에서의 존재와 병원성과의 관계를 연구하는 것이 시급하다(Mudarris et al. 1994; Pilarski et al. 2008). 따라서 소양호에 존재하는 Flavobacterium의 분포가 매우 중요하여 분리된 Flavobacterium의 특징을 살펴보고자 하였다.

소양호 상류지역인 강원도 인제군 인제 군축교와 상류 4 km 지역에서 두 곳을 대상으로 2010년 4월과 6월의 2차례에 걸쳐 현탁 도말법을 이용해 분리하여 총 300여종을 분리하였다. 이곳의 물리적 환경은 Table 1과 같다. 4월의 평균 수온은 9.7^oC였으며, 6월에는 22.8^oC로 많은 차이가 존재하였다. pH도 역시 각각 7.3과 8.0으로 각각 다르게 나타났다. 또, 이온 분석 결과는 질소원과 인산은 다소 낮게 나타났지만, 염소, 칼슘, 나트륨의 농도는 다소 높게 나타났다(Table 1). 시료에서 분리한 균주 중 Flavobacterium sp.가 60여 종으로 약 20%로 나타났다(data not shown). 그 중에서 동일한 종류를 제외한 30여 종의균주가 Flavobacterium에 속하는 아변종급의 신종으로 확인이 되었으며, 21종이 서로 다른 97~98%의 16s rRNA의 상동성을 지니고 있는 것으로 분리 확인되었다. 이 중에서 97~98%의 상동성을 지닌 종들은 16S rRNA의 연구를 통하여 새로운 신종의 가능성이 있기 때문에 더욱더 연구가 필요한 종들이다. 이렇게 높은 비율로 분리된 Flavobacterium의 신종을 대상으로 그 특성을 조사하였다.

Table 1. Environmental condition of sampling station in Lake Soyang

먼저 소양호에서 분리된 아변종급 Flavobacterium 균주들의 16S rRNA를 NCBI에 유전자 등록을 하였으며(Table 2), 그 등록한 염기서열을 바탕으로 neighbourjoining method를 이용하여 유연관계를 살펴보았다. 소양호의 Flavobacterium는 크게 4개의 구분되는 node에 위치하고 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 그 중에서 가장 많은 Flavobacterium이 Group I에 HME6007과 HME6008을 비롯한 14종의 균주가 존재하고 있으며, Group IV에는 HME6136과 HME6126가 포함되는 5종, Group II와 Group III에는 1종씩의 Flavobacterium이 존재하였다. 

Table 2. Characteristics that differentiate 21 isolated strains from related members of the genus Flavobacterium. All data were obtained from this study. +, Positive; -, negative

Fig. 2. Neighbour-joining phylogenetic tree based on nearly complete 16S rRNA gene sequences showing the relationships between isolated strains and representative members of the genus Flavobacterium. Bar, 0.01 nucleotide substitution per position.

소양호에서 분리된 Flavobacterium의 대부분은 하나인 Group I에 가장 많은 종이 포함되어 있다. 이러한 특징은 같은 생태계 내에서 동일한 먹이와 자연환경으로 부터 적응된 결과로 유추할 수 있다. 소양호는 매우 다양한 깊이와 위치 등이 존재하지만 상하 대류현상 등에 의해 호수 전체가 섞이는 현상이 발생하여 전체적으로 균일화 되는 환경 적응과 더불어 환경변화가 상충되어 나타나는 현상으로 보여진다. 결국 이번에 분리된 Flavobacterium이 Group I에 대부분이 존재하는 이유도 영양분, 주변 환경 등에 따라 미생물에 미치는 자극에 대한변이의 정도가 변종 또는 아종으로 미생물의 분화에 영향을 미친다고 추측된다. 유사한 환경의 영향으로 인해 Flavobacterium이 하나의 Group에 위치하는 것으로 존재하며, Group I에 소양호에 존재하는 대부분의 Flavobacterium이 위치하는 것으로 나타났다. 그 외에 특이하게 7종이 Group II, III, IV의 node에 각각 존재하는 것으로 확인되었다. 

이처럼 분리된 균주들을 대상으로 각각의 생리, 화학적분석을 통해 각각의 Flavobacterium의 성질을 알아보았다. 분리된 균주의 형태는 모두 Gram negative, rod shape 이고, yellow colony pigment를 지니며, 중온에서 최대성장을 하는 전형적인 Flavobacterium과 유사한 특징을 지니고 있다. 각각의 분리된 균주 중 Group IV의 HME6136, HME6126, HME6108, HME6133, HME6141 균주들의 경우, 염분이 존재하면 생장에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 그러나, HME6126과 HME6141을 제외하고, HME6136, HME6108, HME6133 등은 NaCl이 첨가된 0~0.5%의 범위에서만 생장하는 것으로 나타났다. 각각의 분리된 strain들의 salt range의 차이는 다양하게 존재하는 것으로 나타났다 (Table 2). 특히 HME6108의 경우에는 최적 salt 농도가 1%로 나타났으며, salt가 없으면 생장이 전혀 이루어지지 않는 것으로 나타났다. 14종의 아변종을 포함하고 있는 Group I의 경우에는 salt가 없는 0%에서도 잘 성장하며, HME6138, HME6141, HME6145, HME6118은 1%의 salt 농도에서 가장 잘 자라는 것으로 확인되었다.

분리한 모든 Flavobacterium의 균주는 대부분 중온성 미생물로써 25^oC에서 최대 성장을 하는 공통적인 특징을 나타내었다. 하지만, HME6007, HME6008, HME6011, HME6012, HME6015, HME6017, HME6024 등의 균주는 4^oC에서도 생장을 하는 것을 확인하였다. 이는 소양호가 계절적으로 수온의 변화가 적고, 특정 계절을 제외한 계절에서 10^oC 이하의 평균 온도를 나타내는 환경적 요인과 밀접하다고 추측된다. 

또 pH의 경우에 Group I의 pH 범위는 7~9로 넓게 분포하며, Group II는 pH 7에서 최적 생장을 보였으며, Group III은 pH 7~8에서 최적 생장을 보였고, Group IV는 pH 7~8에서 최적 pH를 지닌다. 각 Group 별로 온도와 pH에 대한 특이점은 나타나지 않았으며, 대부분 약알칼리에서도 최대 생장을 보이는 것이 대부분이었다. 

Group IV는 indole production과 nitrate reduction이 negative인 공통의 특징을 보이고, HME6126과 HME6136, HME6141은 esculin hydrolysis와 PNPG, HME6133은 esculin hydrolysis와 gelatinase, PNPG, HME6108은 urease 와 gelatinase 반응이 positive reaction을 나타내는 등의 차이가 있었다. 

분리된 균주의 Group I은 온도, pH, salt가 매우 다양하게 나타났다. 대부분은 25~30^oC가 최적 온도, 0.5% NaCl 농도가 최적 염분 농도이며 pH 7, 8, 9에서 내에서 가장 성장을 잘하는 것으로 확인되었다. 육수 환경에서 식물성플랑크톤의 양이 증가할 경우 pH의 상승으로 인해 중성에서 약 알카리성을 나타난다. 이러한 환경으로 인해 분리된 균주들은 pH 7~9까지 성장을 하며, 최적 pH는 각 균주별로 다르게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 분리된 균주들의 최적 온도 역시 시료를 채취한 시기와 밀접한 관계가 있는 것으로 추측된다. 특히 nitrate reduction reaction은 HME6007, HME6008, HME6012, HME6024는 positive reaction을 나타내며, 그 외의 Group I은 negative reaction을 나타내었다. 그리고 esculin hydrolysis는 모든 균주가 positive reaction을 arginin dihydrogen, urease는 negative reaction으로 나타났다. 

미생물의 분리 동정에 많이 활용되는 cellular fatty acid composition을 이용하여, 분리된 균주에 대한 세포내의 fatty acid 성분을 분석하여 각각의 fatty acid composition 을 알아보았다. Flavobacterium sp.는 대부분 iso C_15:0와 summed feature 3 등이 주된 fatty acid의 성분으로 이루어져 있다. 이번 소양호에서 분리된 아변종의 Flavobacterium sp.도 역시 주된 성분인 iso C_15:0와 iso C_17:0 3OH 이외 에도 매우 다양한 형태의 fatty acid를 구성성분으로 가지고 있는 것으로 나타났다. Group I에 속하는 Flavobacterium의 주요 fatty acid는 iso C_15:1 G, iso C_15:0, summed feature 3 등으로 구성되어 있는 것으로 나타났다. Group I의 14종 모두 minor fatty acid의 composition은 약간의 차이가 존재한다 (Table 3). 그리고 5종의 균주가 포함된 Group IV는 anteiso C_15:0, iso C_15:0 3OH의 비율이 높게 존재하는 것으로 나타났다. 따라서 소양호에서 분리된 균주는 각기 다른 Flavobacterium으로 판단할 수 있어 매우 다양한 종이 존재함을 재확인 할 수 있었다.

Table 3. Cellular fatty acid composition (%) of 21 isolated strains. All data were obtained from in this study under the same experimental conditions. Only fatty acids amounting to at least 1.0% of the total cellular fatty acids of at least one of the strains are shown. tr, trace (<1.0%); nd, not detected

이와 같이 소양호에서 분리한 아변종 21종을 대상으로 생리 화학적 분석을 수행하였다. 각각의 Flavobacterium strain은 서로 다른 유전적 유연관계를 지니며, 이 같은 유연관계와 생리적 특성이 밀접한 연관 관계가 있는 것으로 나타났다. 이들 분리된 균주의 경우 환경에 따라 밀접하여, 소양호내의 많은 미생물 중 Flavobacterium sp.가 매우 다양하게 존재하여 보고되지 않은 많은 여러 미기록 신종이 존재하는 것으로 확인되었다. 하지만 호수내에 존재하는 Flavobacterium sp.에 대한 국내 연구는 거의 연구된 바가 없다. 또, 소양호에서 보고되지 않은 고유종의 Flavobacterium sp.가 많이 존재한다는 점으로 부터 생태학적으로 이들 밝혀지지 않은 Flavobacterium sp.들과 생물과의 관계 및 환경에 미치는 영향을 다각적으로 살펴볼 이유가 존재한다. 

적 요

우리나라 최대 담수호인 소양호에 존재하는 미생물 중 Flavobacterium을 분리하여 그 특징을 조사하였다. 그 중에서 97%와 98% 사이의 상동성을 지니는 Flavobacterium을 대상으로 21종을 선택하였으며, 그 균주들의 생리학적, 생태학적 위치를 살펴보았다. 그 결과, 소양호에 존재하는 21종의 분리된 Flavobacterium은 4개의 주된 node에 위치하였으며, 그 중에서 대부분이 하나의 group에 속하여 있었다. 각 Flavoacterium 21종의 생리적인 특징은 기존의 보고된 Flavoacterium들과는 서로 다른 특징을 지니지만, total fatty acid의 분석결과 iso C_15:0과 summed feature 3 (comprised C_16:1 ω7c and/or C_16:1 ω6c)가 주요 성분으로 전형적인 Flavobacterium의 특징을 지닌 것으로 나타났다. 따라서 소양호내에는 유전적 유연관계가 있는 아변종의 Flavobacterium이 존재하며, 기존에 알려진 종들과는 다른 형질을 가지고 있는 것으로 보아 소양호 생태계의 생물 종 다양성이 유지되고 있는 것으로 판단된다.

사 사

이 연구는 환경부 산하 국립생물자원관의 자생생물발굴사업 연구비로 진행되었습니다.