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서 론

지역 환경의 생태계 보호 및 환경오염에 의한 지역 생태계 복구 등의 목적을 위한 생태위해성평가의 필요성이 대두되고 있으며, 해당 지역의 생태계를 구성하는 생물 종 파악과 민감한 생물 종에 대한 영향평가 수행이 요구된다. 또한 국내 생태계에 보다 적합한 위해성평가를 수행하기 위해서는 국내에 서식하는 고유생물종을 이용한 독성평가 자료가 필요하다. 요컨대 어류는 일반 연구목적의 생태독성시험과 새로운 산업용 화학물질의 유해성평가를 위한 자료제공 목적으로 수행하는 독성시험 등에 광범위하게 이용되어지고 있다 (Sandbacka et al. 2000). 그리고 물벼룩(Daphnia magna)과 송사리(Oryzias latipes)는 오랜 기간 동안 표준수생태 독성시험종으로 이용되고 있다. 특히 물벼룩을 이용한 급성과 만성시험은 수생생물에 대한 독성학적 연구에 주로 수행되어지고 있다(OECD 2004; Martins et al. 2007). 하지만 새우류를 이용한 표준독성시험법은 알려진 것이 없다. 다만 미국 EPA의 OPPTS (the Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances)는 Mysidopsis bahia를 이용한 급성독성시험법(OPPTS 850.1035)을 제시하고 있다. 하지만 이 시험법에서 이용되고 있는 Mysidopsis bahia는 해양생물로 국내 담수환경을 위한 생태영향 평가에 사용할 독성 시험종으로 적용하는 데는 한계가 있다. 따라서 국가차원에서 생태독성시험에 사용할 수 있는 적절한 고유생물종을 발굴하고 이들 생물종에 적합한 생태독성평가방법을 제시할 필요성이 있다(이 등 2010). 

국내 담수 새우인 새뱅이 (Neocaridina denticulata)는 생태독성시험종으로 적절하게 이용할 수 있는 가능성을 발견하였으며, 특히 중금속에 대한 급성독성시험에 유용한 시험 종이 될 수 있을 것이라는 결론을 얻은 바 있다(류 등 2007). 또한 새뱅이 성체를 이용한 급성독성시험방법을 도출하고 표준화하기 위한 기본 요소로서, 적절한 시험환경조건의 범위를 제시하였으며, 유해화학물질에 대한 반복독성시험 결과 값이 일관성 있게 산출되는 것을 확인하였다(국립환경과학원 2009; 이 등 2010). 한편 일반적으로 갑각류의 유생 단계는 성체보다 더 민감하다. Paragrapsus sp.의 경우, 카드뮴은 9배, 아연에서 60배 더 민감한 결과를 보고하였으며 (Ahsanullah and Arnott 1978), Penaeus kerathurus의 유생 성장단계가 증가할수록 민감도는 낮아지는 것을 확인하였다(Rodriguez and Establier 1983). 

새뱅이는 새뱅이과 (Atyidae)에 속하는 새우로 새뱅이과 새우는 열대와 온대지역의 호소와 하천에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 국내에 넓게 분포되어 서식하는 것으로 보고되어 있다(문교부 1977; 국립환경과학원 2011). 이들은 어류의 영양학적 측면과 더불어, 수서식물의 상층부와 나뭇잎에 붙어있는 유기물과 미세조류의 찌꺼기 처리를 위해 먹이사슬에서 상당히 중요한 역할을 한다. 하천환경에서 대소비자로서의 역할을 수행하여 하천 생태계의 원동력에 영향을 주며, 나뭇잎쓰레기를 분해하는데 도움을 주기도 한다 (Webster and Benfield 1986; Boulton and Bon 1991; Parkyn et al. 1997; Schofield et al. 2001; Oh et al. 2003; Lai and Shy 2009). 아울러 새뱅이는 생태계 먹이사슬 내에서 상위 포식자들의 먹이가 되며, 하위 피식자를 섭이하는 중간 연결단계의 생태적 지위를 차지하고 있다는 점에서 생태적 중요성을 지니고 있다(Englund and Cai 1999; Huang et al. 2004). 

Potassium dichromate는 염색, 표면처리제, 목제 보호제 등 다양한 산업분야에서 사용되고 있으며, 많은 연구를 통해 이미 수서생물에 대한 독성자료가 많이 축적되어 수서생물에 대한 표준독성시험물질로 제안되어 사용되고있다 (Kranz and Gercken 1987; Svobodova and Vykusova 1991; Krejci and Palikova 2006; 이 등 2010). 따라서 potassium dichromate는 시험법의 적합성을 검토하는데 유용하게 사용될 수 있다(OECD 2004). 

본 연구에서는 표준독성시험물질로 이용되고 있는 potassium dichromate에 대한 새뱅이 유생의 독성민감도를 OECD 시험지침에서 표준시험생물종으로 추천되고 있는 물벼룩 및 송사리와 비교하였으며, 추후 새뱅이 유생을 이용한 생태독성시험방법의 도출과 표준화에 필요한 기초자료를 제공하고자 하였다. 

재료 및 방법

1. 시험생물

본 연구에 이용된 새뱅이는 전남 강진군 옴천면에서 채집하여, 국립환경과학원 환경독성연구동 내 사육실에서 2주 동안의 순화과정을 거친 후 시험에 이용하였다. 시험은 외관상 이상이 없는 건강한 성체에서 부화하여 성장한 4주차 새뱅이 유생(전장 6±1mm)을 이용하였다(Fig. 1). 순화과정 동안 사육실 내 환경은 수온 24±1 pH 7~8, 용존산소 (DO) 7~8 mg L^-1 , 광주기 16시간/8시간(명/암)으로 유지하였다. 사육기간 동안 먹이는 새우용인공사료 (Shrimp ball food, Shirakura, Japan)를 공급하였으며, 시험 개시 2일전에 절식하였다.

Fig. 1. A Korean freshwater shrimp larva, Neocaridina denticulata.

 독성시험에 사용한 물벼룩은 수온 20±1℃, 조도 800 lux, DO 3 mg L^-1  이상, 광주기 16/8시간(명/암)의 조건으로, OECD 시험지침에서 제시한 M4 배지 조제 방법에 따라 배양하였다. 사육기간 동안의 먹이로는 녹조류인 Chlorella를 1일 1회 충분히 공급하였다. 시험에 사용한 물벼룩은 3회 이상 어린 개체를 생산한 어미로부터 얻은 24시간 미만의 어린 개체만을 선별하여 시험에 이용하였다. 급성독성 시험기간 동안 먹이는 공급하지 않았다.

송사리는 환경독성연구동 내 사육실에서 수온 25±1 ℃, pH 7~8, 조도 700~800 lux, DO 7~8 mg L^-1 , 광주기 16시간/8시간 (명/암)의 조건으로 계대배양 하였다. 치어의 급성독성시험은 부화 후 약 1개월 치어(전장 1.0±0.2cm)를 이용하였다. 사육기간 동안 먹이는 알테미아를 공급하였으며, 급성시험 개시 2일전에 절식하였다. 

2. 시험물질

새뱅이 유생, 물벼룩, 송사리 치어의 급성독성시험을 위해 potassium dichromate (Sigma-Aldrich Inc., USA)를 증류수에 용해시켜 시험원액 1,000 mg L^-1 를 조제하였다. 그리고 새뱅이 유생과 송사리 치어에 대한 시험용액은 각 시험생물의 시험농도에 맞도록 재희석 하였다. 희석수는 수생생물 사육용 정수처리시스템(Hanssem Watertech. Co., Korea)으로 처리된 수돗물을 이용하였다. 

3. 시험방법

1) 새뱅이 유생

반수치사농도 확인시험에 이용된 시험개체는 시험농도당 12개체씩 이용하였다. 시험노출 농도는 예비시험을 바탕으로 대조군, 0.128, 0.32, 0.8, 2.0, 5.0 mg L^-1 로 설정하였으며, 노출농도별로 6 well plate의 각 well에 시험수 10mL을 채운 후 개별적으로 유생들을 관찰하였다. 시험물질은 48시간마다 전수 교환하는 반지수식 방법으로 시험하였으며, 96시간 동안 24시간마다 치사개체를 확인하였다. 시험기간 동안 치사개체는 즉시 제거하였으며, 치사는 움직임이 없이 옆으로 누워있는 상태와 제1촉각과 제2촉각을 건드려 반응이 없는 상태를 기준으로 하였다. 시험환경조건으로는 수온 24±1℃, pH 7~8, 광주기 16시간/8시간 (명/암)을 유지하였으며, 먹이는 공급하지 않았다. 

2) 물벼룩

물벼룩의 반수영향농도 시험은 OECD 시험지침 202번에 준하여 시험하였다(OECD 2004). 각 농도별로 준비된 시험용액을 유리비커에 50 mL 첨가한 후, 각 비커마다 물벼룩 5마리씩 노출하였으며, 각 농도별로 4개의 반복구를 두어 시험농도당 20마리의 물벼룩을 노출하였다. 시험물질의 농도는 예비시험을 바탕으로 대조군, 0.60, 1.35, 2.03, 3.04 mg L^-1 로 공비를 1.5로 설정하였다. 시험조건(수온, 조도, 광주기)은 물벼룩 배양과 동일한 조건으로 실시하였으며, 지수식 방법으로서 시험용액의 교환과 폭기는 하지 않았으며, 먹이는 공급하지 않았다. 관찰항목으로는 물벼룩을 노출 후 24시간 및 48시간에 유영저해를 관찰하여 EC₅₀ 을 산출하였다. 유영저해는 비커를 가볍게 저어준 후 물의 흐름을 벗어나지 못하는 개체를 유영저해로 판단하였다. 

3) 송사리

송사리 치어와 성어의 반수치사농도 확인시험은 OECD 시험지침 203번에 준하여 급성독성시험을 수행하였다(OECD 1992). 시험물질의 농도는 예비시험을 바탕으로 치어의 경우 대조군, 15.63, 31.25, 62.5, 125, 250 mg L^-1 로 설정하였으며, 성어는 대조군, 16, 32, 64, 128, 256 mg L^-1 로 각각 설정하였다. 각 시험 농도별로 2L 사각유리수조에 각각 7마리씩 노출하였으며, 시험물질은 48시간마다 전수 교환하는 반지수식 방법을 사용하였다. 시험기간 중 먹이는 공급하지 않았다. 관찰항목으로는 이상반응 개체 및 치사개체를 초기 3시간째와 6시간째에 확인하였으며, 매 24시간마다 관찰하여 96시간 동안 실시하였다. 

4. 통계처리

새뱅이 유생의 반수치사농도 (LC₅₀ ) 통계처리는 미국 EPA에서 제공한 TSK 프로그램(Trimmed Spearman-Karber Program)을 이용하였다. 물벼룩의 반수영향농도(EC₅₀ )와 송사리 치어의 반수치사농도(LC₅₀ ) 산출은 미국 EPA에서 제공하는 Probit 통계프로그램(EPA analysis program probit, Version. 1.5)을 이용하였다. 

결과 및 고찰

국내 고유생물종인 새뱅이 유생을 potassium dichromate 물질로 급성독성시험을 실시한 후 물벼룩, 송사리 치어와 독성 민감도 차이를 비교하였다. Potassium dichromate에 대한 새뱅이 유생의 급성독성시험 결과를 물벼룩과 송사리 치어의 독성값과 비교한 결과, 새뱅이 유생의 급성독성값(96 h-LC₅₀)은 0.62 mg L^-1 이었으며, 물벼룩의 독성값(48 h-EC₅₀)은 1.27 mg L^-1 , 송사리 치어의 독성값(96 h-LC₅₀ )은 168.44 mg L^-1 로 나타났다. 물벼룩 급성 독성값 (48 h-EC₅₀)에 대한 새뱅이 유생과 어류 치어의 48시간째 급성독성값을 비교해 보고자 하였으나, 48시간에 도출된 독성영향자료를 이용해서는 통계처리가 되지 않았다. 다만 물벼룩 급성독성시험에서 시험물질 최저농도인 0.6 mg L^-1 에서 48시간째에 유영저해 개체가 나타나지 않았지만, 새뱅이 유생의 급성독성시험에서 48시간째에 시험물질 농도 0.32 mg L^-1  노출군에서 누적 사망률은 30%로 물벼룩보다 높게 나타났다. 따라서 새뱅이 유생은 물질에 따라 물벼룩보다 독성민감도가 더 높을 수 있을 것으로 추정된다(Fig. 2). 

Fig. 2. Accumulative mortality rate of Neocaridina denticulate exposed to potassium dichromate for 96 hours

Potassium dichromate에 대한 새뱅이 유생의 급성독성시험 결과 값을 다른 새우류나 OECD 시험지침에서 권고하고 있는 물벼룩 및 어류시험 종의 급성독성값과 비교하여 보았다. 미국 EPA에서 제공하고 있는 ECOTOX database를 통해 조사한 자료 범위 내에서 potassium dichromate에 대한 각 생물종의 급성독성값의 범위는 0.85~60.0 mg L^-1 로 조사되었다(Table 1). 

Table 1. Comparison of toxicity values of potassium dichromate on Neocaridina denticulata with other species

각 생물종 치어의 독성민감도를 살펴보면 1~2일차 송사리 치어의 독성값 (96 h-LC₅₀)은 24.7 mg L^-1 로 새뱅이 유생보다 독성민감도가 낮았으며, 제브라피쉬(Danio rerio)와 무지개송어 (Oncorhynchus mykiss)의 경우도 새뱅이 유생의 독성민감도가 더 높았다(Table 1). 미성숙 Fathead minnow (Pimephales promelas)의 독성값 (96 h-LC₅₀)도 36.2 mg L^-1 로 조사되어 (Pickering 1980), 새뱅이 유생의 독성민감도가 더 높게 나타나는 것을 알 수 있다. 

그리고 부화 후 6~24시간 물벼룩 독성값 (24 h-EC₅₀)보다 민감도가 더 높게 나타났다 (Persoone et al. 1989; Klein 2000). 

반수치사농도인 LC₅₀에 대해서 물벼룩을 제외하고 다른 새우류나 어류의 독성값보다 새뱅이 유생의 독성값이 낮아, 새뱅이는 potassium dichromate에 대해 다른 생물종에 비해 상대적으로 민감도가 높은 시험생물종이 될 것으로 판단된다. 

결 론

본 연구의 목적은 독성민감도를 기반으로 우리나라 고유생물종인 새뱅이를 이용한 독성시험의 가능성과, 독성시험 생물종으로서의 유용성을 파악하고자 급성독성시험을 실시하였다. Potassium dichromate에 대한 새뱅이 유생의 급성독성시험 결과를 물벼룩과 송사리 치어의 독성 값과 비교할 때, 독성시험에 유용하게 사용될 수 있는 적절한 민감도를 가지고 있는 것으로 판단된다.