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서 론

 국내 하천이나 호소수에서 부영양화 발생시에 빈번하게 출현하는 남조류는 Microcystis, Anabaena, Planktothrix(Oscillatoria) 등이 대표적으로 알려져 있으며, Microcystis 속의 종들이 가장 빈번히 우점하고 있다(Kim et al. 1999; Lee et al. 2003). 특히, 여름철마다 남조류의 대량증식에 의한 수화현상(algal bloom)은 악취는 물론 일부 종들에 의해 생산되는 독소로 인해 심각한 수질 문제를 야기시킨다. 남조류가 생산하는 독소 중에서 간독소인 microcystin(MC)이 가장 대표적인 독소로 알려져 있다. Microcystin은 총 7개의 아미노산으로 구성된 환상 펩타이드 구조를 지니고 있으며, 열에 대해 높은 안정성을 갖고, 극성이 낮은 물질로서 두 개의 치환 아미노산에 따라 LR, LA, YR, RR 등을 포함하여 80종 이상의 다양한 종류가 있다. 이 중 가장 독성이 높은 물질은 microcystin-LR로 알려져 있다(Sivonen and Jones 1999). 음용수의 안전성을 확보하기 위하여 WHO(1998)는 대표적인 microcystin-LR의 최대 허용농도를 1 μg L^-1로 지정하였지만, 우리나라는 아직 남조류 독소에 대한 공식적인 먹는 물 가이드라인이 없는 상황이다. 그렇지만 남조류 독소에 의한 먹는 물 위해성 방지를 위해 상수원수를 대상으로 실시되고 있는 조류경보제에서 microcystin-LR 1 μg L^-1에 해당하는 유해 남조류 세포수 약 5,000 cells mL^-1를 조류경보의 기준으로 하고 있다(NIER 2008).

 Microbacterium은 토양과 폐수, 병원의 공기나 가습기 등 환경에 널리 분포하며, 사람에게서는 드물게 질병과 관련된 것으로 알려진 그람 양성균으로서 호기성이며, 노란색 색소를 생성하는 coryneform 세균이다. 지금까지 60여 종 이상이 알려져 있으며, 최근에도 지속적으로 새로운 종이 보고되고 있다 또한 Microbacterium속의 미생물로 xylan 분해균, chitosanase 생산균, α-glucosidase 생산균, cellulase 생산균, mannan 분해균 등이 분리된 바 있다(Yoon 2011). 그러나 이들 박테리아에 의한 microcystin 분해에 대한 연구는 보고된 바 없다.

 따라서 본 연구에서는 Microcystis가 우점하는 국내호소에서 microcystin를 분해하는 Microbacterium 1종을 분리하여 이들의 microcystin 분해능을 조사하였다.

재료 및 방법

1. 균주 분리 및 배양

 부영양화 시기(2010년 8월)에 대청호에서 채취한 시료를 단계별로 희석한 후 Microcystis와 공존하는 다양한 박테리아를 분리하였다. 미생물 분리, 배양에 사용한 배지는 R2A 영양배지를 사용하였고, 배양조건은 30℃에서 18시간 동안 진탕 호기 배양하였다. Microcystin 분해능을 나타내는 균주를 분리하기 위해 R2A 배지에 50 μg L^-1 microcystin-LR을 첨가하여 동일 조건으로 배양한 후, protein phosphatase inhibition assay (PPIA)를 통해 분해능을 나타내는 균주를 선별하였다. 최종 선별된 균주의 microcystin 분해 실험은 R2A 배지에 18시간 전배양한 배양액을 새로운 R2A 배지에 optical density (OD_600nm)가 0.3이 되도록 분주한 후, microcystin-LR을 최종 농도 50 μg L^-1가 되도록 첨가하여 분해실험을 수행하였다.

2. Microcystin 추출 및 정량분석

1) HPLC

 Microcystin-LR의 표준시료 (Alexis, Switzerland)를 100% 메탄올 1mL에 녹인 후 농도별로 희석하여 사용하였다. Microcystin 분석법은 크게 HPLC/UV법, LC/MS법, GC/MS법 등을 이용한 기기분석법과 ELISA를 이용한 분자생물학적 방법 그리고 효소를 이용한 PPIA법이 있다. 효소를 이용한 PPIA법과 ELISA는 감도가 매우 뛰어나지만 microcystin의 변종에 대한 개별 분석이 어렵다는 단점이 있고, HPLC법은 분석 값의 오차와 검출한계를 낮추는 데 한계가 있으므로(Kim et al. 2009), 두 가지 방법을 병행하여 단점을 보완하고자 하였다.

 배양액에 포함된 microcystin의 농도를 측정하기 위해서, 시료 1mL을 동결 건조한 후, 동량의 50% 메탄올을 첨가하여 강한 vortexing과 sonication을 통해 microcystin를 추출하였다(Manage et al. 2009). 추출액은 10분 동안 4,000 rpm으로 원심 분리하였다. 분리된 상등액을 0.45 μm Nylon syringe filter로 여과하여 최종 50 μL로 용출한 것을 HPLC (CLASS-LC10, Shimadzu) 기기를 이용하여 분석하였다. Column은 역상의 Nucleosil C18 (5 μm, 150-by 4.6 mm inside diameter)을 사용하였고, injection volume은 20 μL로 정하였다. 이동상은 methanol과 0.05% TFA (trifluoroacetic acid)가 포함된 water를 52 : 48 (v/v)로 혼합하여 사용하였다. Flow rate는 1 mL min^-1으로 하여 238nm에서 peak를 측정하였다. 순수한 microcystin-LR을 외부표준물질로 사용하여, microcystin의 peak를 판별하고 정량하였다(Oh et al. 2001). 검출한계는 0.1 mg L^-1이었다(Zhou et al. 2010).

2) PPIA (Protein Phosphatase Inhibition Assay)

 효소용액인 protein phosphatase 1 (Sigma Co., USA)을 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM Na₂EDTA, 2 mM MnCl₂, 0.1% β-mercaptoethanol (v/v), 0.5 mg L^-1 BSA를 함유하고 있는 protein phosphatase 희석 buffer에 녹여 준비하였다. 기질용액은 para-nitrophenyl phosphate (Sigma Co., USA)를 50 mM Tris-HCl (pH 8.1), 0.2 mM MnCl₂, 20mM MgCl₂를 함유하는 buffer에 녹여 준비하였다. 효소용액 10 μL를 tube에 넣고, 표준 용액 및 시료 25 μL를 넣고 37℃에서 1분간 전 배양하여 효소와 독소가 반응하도록 하였다. 그 용액에 기질용액 100 μL를 넣고 37℃에서 22분간 반응시킨다. 반응 후, 흡광도 405 nm에서 시료 값을 측정하였다(An and Carmichael 1994).

3. PCR 증폭 및 염기서열 분석

배양된 시료를 원심분리(6,300×g, 10 min)를 이용하여 농축하였고, 회수한 세포로부터 DNeasy plant mini kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. PCR 반응에 사용된 primer는 universal primer인 27F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′), 1492R (5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)를 사용하였다(Lane 1991). PCR 반응 조건은 94℃에서 5분간 초기 열처리를 한 후, 94℃에서 1분간 변성시키고, 결합 온도는 56℃에서 30 cycle을 수행하여 1분간 반응시키고 신장을 위하여 72℃에서 1분간 반응시킨 후 최종적으로 72℃에서 10분간 처리하고 반응을 중단시켰다. PCR 증폭산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다. 

PCR로 증폭된 DNA는 Gel extraction kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 automatic DNA sequencer (model 377, Applied Biosystems, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank DB를 이용하여 BLAST search program을 통해 분석하였다. 

 분리한 박테리아의 계통분류학적 분석을 위해 Clustal-X 프로그램과 MEGA version 3.1의 neighbor-joining method를 이용하여 phylogenetic tree를 완성하였다. Kim et al. (2006)의 방법에 따라, bootstrap 분석은 1,000회의 resampling을 통하여 조사하였고, 염기서열 간 distances계산은 Kimura’s two parameter model을 이용하여 분석하였다.

결과 및 고찰

1. 분리 균주의 Microcystin 분해

 Microcystin-LR 분해능을 나타내는 분리 균주를 이용하여 배양 시간에 따른 세포 생장과 microcystin-LR 분해를 조사하였다. 50 μg L^-1 microcystin을 처리하여 배양한 결과, 9시간 후 분리균주는 0.8로 최고 OD를 나타냈고, 이는 초기 접종량(OD 0.3)에 비해 2.6배 증가된 수치였다(Fig. 1). 배양 시간에 따른 microcystin 분해율은 PPIA를 통해 확인하였다. 대조구의 독소 농도는 거의 변화가 없는 반면, 분리균주 Microbacterium sp. MA21을 접종한 처리구의 경우 배양 3시간 후부터 지속적으로 microcystin-LR의 농도가 감소하였다. 또한 12시간 배양 후, 초기 접종 농도와 비교하여 microcystin-LR이 80%이상 분해되는 것을 확인하였다(Fig. 1). Microcystin-LR이 가장 많이 분해된 12시간 배양액을 대상으로 HPLC를 이용하여 microcystin 분해율을 재확인하였다. 그 결과, microcystin-LR을 나타내는 peak (retention time 31분)의 area 값이 18% 감소하였고, microcystin의 분해산물로 추정되는 peak A와 B가 나타나는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2). 그러나 HPLC을 이용한 microcystin 정량분석은 HPLC의 검출한계로 인하여 정확한 microcystin의 분해율을 검증하는 데에는 한계가 있다(Hummert et al. 2001). 본 연구에서는 낮은 농도(50 μg L^-1)의 microcystin을 대상으로 분해실험을 수행하였고, PPIA와 비교하여 HPLC의 경우 분해율이 상대적으로 낮은 비율로 감소된 것으로 조사되었다.

Fig. 1. Microcystin-LR degradation during the growth of Microbacterium sp. MA21 in R2A medium containing microcystin-LR (final concentration 50 μg L^-1). Remaining microcystin(%) without Microbacterium sp. MA21 (□), with Microbacterium sp. MA21 (■), and OD_600nm of the culture (gray bar).

Fig. 2. HPLC profiles of the biodegradation of microcystin-LR by Microbacterium sp. MA21 at time zero (a), 12 h (b) and standard microcystin-LR(c). Peaks A and B indicate biodegradation products of microcystin-LR.

 최근 들어 microcystin 분해 미생물의 분리 및 동정에 관한 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, Sphingomonas sp.의 경우 microcystin-LR또는 RR을 분해하는 균주로 알려져 있고 이미 다양한 종이 분리, 연구되고 있다(Bourne et al. 1996; Okano et al. 2009; Wang et al. 2010). Microcystin 분해과정에서 microcystin 분해 유전자라고 추정되는 유전자들 또한 Sphingomonas sp.에서 동정되었다. Bourne et al. (2001)의 경우, microcystin 분해 균주로 Sphingomonas sp. strain MJ-PV를 분리하였고, 이들의 gene library screening을 통해 microcystin 분해에 관련된 유전자 mlrA, mlrB, mlrC, mlrD를 분리, 확인하였다. 또한 microcystin-RR을 분해한다고 알려진 USB-05균주의 경우 16S rRNA 염기서열 분석결과 Sphingomonas sp.로 동정되었으며 microcystin-RR분해에 최소 3개 이상의 유전자가 관여한다는 연구가 보고된 바 있다(Wang et al. 2010).

Bourne et al. (1996)에 의하면 microcystin-LR의 경우, 첫 번째 분해 단계로 microcystinase에 의해 환상형에서 직선형태의 구조로 선형화된 후, 다른 효소에 의해 짧은 형태의 peptide로 분해된다고 보고된 바 있다. 또한 Microcystinase에 의한 첫 번째 분해 과정을 HPLC와 LC/MS로 분석한 결과, 두 개의 산물이 관찰되었다. 분해 산물 중 하나는 선형의 microcystin-LR (NH₂-Adda-Glu(iso)-methyldehydroalanine-Ala-Leu-β-methylaspartate-Arg-OH)로 m/z 1,013.5의 분자량을 가지며, 또 다른 산물은 tetrapeptide인 NH₂-Adda-Glu(iso)-methyldehydroalanine-Ala-OH로 m/z 615의 분자량을 갖는 것으로 확인하였다. 본 연구에서도 분리 균주인 Microbacterium sp.에 의해 microcystin-LR이 분해되어 HPLC 상 두 개의 산물이 새로이 관찰되었다. 

2. 분리 균주 동정 및 계통 분류

 본 연구에서 분리한 균주를 16S rDNA 염기서열로 동정한 결과 Microbacterium sp.로 동정되었고 (GenBank accession number AM403159, 98.7% similarity), 이 균주를 Microbacterium sp. MA21이라 명명하였다.

 이전에 보고된 microcystin 분해 미생물은 대부분이 Sphingomonas sp.에 해당하는 균주로, 최초 보고된 균주는 호주에서 분리된 Sphingomonas sp. ACM-3962로 microcystin-LR과 RR을 분해한다 (Jones and Orr 1994; Bourne et al. 1996, 2001). 또한 Suwa호에서 분리한 Sphingomonas sp. Y2 (Park et al. 2001; Maruyama et al. 2003), Sphingomonas sp. 7CY (Ishii et al. 2004)는 microcystin-LR을 비롯하여 RR, YR까지도 분해한다고 보고되었다. 특이적으로, microcystin-RR만을 분해하는 Sphingomonas sp. CBA4 (Valeria et al. 2006)와 Sphingopyxis sp. (Wang et al. 2010)도 보고된 바 있다. 그러나 대부분 microcystin을 분해한다고 보고된 균주들은 Sphingomonas sp.로 alphaproteobacteria 강에 속하는 균주들이었다. Manage et al. (2009)에 의해 Sphingomonas 속에 속하지 않는 microcystin 분해 균주가 보고되었다. 이 균주들은 모두 환경에서 분리된 균으로 배양 3일 후 microcystin-LR을 96% 이상 분해 효율을 보였고, 16S rRNA 염기서열을 이용한 계통분류 분석 결과, Actinobacteria에 속하는 Arthrobacter sp. Brevibacterium sp. 그리고 Rhodococcus sp.로 확인되었다. 이외에도 microcystin을 분해하는 균주로 Ralstonia solanacearum (Yan et al. 2004), Paucibacter toxinivorans (Rapala et al. 2005), Burkholderia sp. (Lemes et al. 2008), Methylobacillus sp. (Hu et al. 2009) 가 보고된 바 있다.

 Microbacterium sp. MA21로 명명된 분리균주를 이용하여 계통분류 분석한 결과 microcystin 분해 균주로 알려진 기존의 균주들과 다른 새로운 종으로 확인되었다(Fig. 3). 기존에 알려진 microcystin 분해 유전자들(mlrA, B, C, D)은 소수의 Sphingomonas sp.에 국한되었다(Bourne et al. 2001). 또한 이를 제외한 몇몇의 다른 그람 음성균에서도 microcystin 분해 유전자 유전자가 검출되었다는 보고는 있으나, 그람 양성균에서는 분해 유전자에 관한 결과는 보고된 적이 없었다(Shimizu et al. 2011). 그러나 이번 연구에서 분리한 균주인 Microbacterium sp. MA21의 경우, 그람 양성균임에도 Sphingomonas 유래 mlr 유전자를 증폭할 수 있는 degenerated PCR primer (Ho et al. 2007)를 사용하여 PCR 수행 결과, 59%로 유사도는 낮지만 mlrA 유전자로 추정되는 증폭산물이 확인되었다(data not shown).

Fig. 3. Neighbor-joining phylogenetic position of isolated bacteria to other members of the Actinobacteria group and to microcystindegrading Alphaproteobacteria. Bootstrap analysis was based on 1,000 replicates. Scale indicates 2% sequence divergence.

 본 연구에서는 환경에서 microcystin-LR 분해능을 나타내는 균주를 분리, 동정하였다. 분리한 균주를 최종농도 50 μg L^-1의 microcystin-LR을 포함한 R2A 배지에서 30℃에서 12시간 동안 배양하여 80% 이상의 분해효율을 나타내는 것을 PPIA를 통하여 확인하였다. 또한, HPLC를 통하여 12시간이 지난 후 microcystin-LR의 peak가 감소하며, 분해 산물로 추정되는 두 개의 peak를 확인하였다. 16S rRNA염기서열 분석 결과 Microbacterium에 속하는 종으로 동정되었고, 계통분류분석 결과 기존에 알려진 microcystin 분해 균주와 다른 속으로 확인되었다. 분리 균주 Microbacterium sp. MA21의 microcystin 분해 특성을 보다 정확히 이해하기 위해서는 microcystin 분해 관련 유전자 동정은 물론 분해 기작에 관한 연구가 추가되어야 할 것이다.

사 사

 본 연구는 환경부 Eco-STAR project (수생태복원사업단)의 지원으로 수행되었으며, 이에 감사드립니다.