02-말똥성게(mj)(컬러).165324.pdf350.2KB

서 론

 해양 오염물질의 약 80% 이상은 하천을 통하여 연안해역으로 유입됨으로서 인간 활동에 의하여 발생되는 오염물질의 대부분은 해양오염의 원인 물질이라고 할 수 있다. 이런 원인물질 중에서 해양으로 유입된 중금속은 퇴적물과의 결합에 의해 축적률이 높아 다른 오염물질보다도 상대적으로 긴 반감기를 가질 뿐만 아니라 미량일지라도 농축 및 축적이 가능하여 해양생물의 생리적 장애를 유발하며 (DeForest et al. 2007; Atici et al. 2008), 먹이연쇄 과정을 통해 최상위 포식자인 인체에까지 영향을 미칠 수 있어 인류의 보건과도 직결되는 심각한 문제라고 할 수 있다(Martin and Whitfield 1983; Phillips and Segar 1986; Yap et al. 2004; Reiley 2007).

 중금속 중에서 비소 (Arsenic, As)는 인체 대사에 불필요한 유해금속물질 (toxic and non-essential metal)로 잘 알려져 있다. 화산활동 등과 같은 자연활동에 의해 지표면에서 흔히 발견되고 광업 및 제련과정에서 광석에 들어있던 비소의 노출 및 비소 성분이 포함된 제초제, 살충제 등의 사용으로 인해 많은 양의 비소가 환경내로 유입되고 있다(Irving et al. 2008). 환경내로 유입된 As는 흡입이나 피부 흡수를 통한 노출도 가능하지만 그 양은 미비한 것으로 알려져 있으며 (Bae et al. 2006), 대부분 물과 식품을 통하여 인체에 흡입되는 것으로 알려져 있다 (Gebel 1999). As는 아시아 (Bhattacharyya et al. 2003; Xia and Liu 2004) 및 유럽 일부지역 (Lewis et al. 1999; Lamm et al. 2004; Caceres et al. 2005)에서 이용되는 음용수에서 검출되어 전 세계적인 문제로 대두되었다. 크롬(Chromium, Cr)은 화학적 안전성과 내열성, 내부식성, 전기저항성이 강하기 때문에 각종 금속의 도금 및 합금에 널리 사용되며 중독되면 구토와 복통 등이 생기고 심하면 무뇨증과 요독증으로 사망하게 된다 (Suh et al. 1999). Cr은 자연 상태에서 3가 및 6가 상태로 존재하며, 일반적으로 6가 Cr이 3가 Cr보다 독성이 강하며 발암물질로 알려져 있다(Sivakumar and Subbhuraam 2005).

우리나라의 경우 중금속이 해양생물에 미치는 영향에 관한 연구는 부착성 이매패류 (Lee and Lee 1984; Choi et al. 1992)를 중심으로 이루어져 왔으나, 대부분은 이화학적 연구가 중심이 되어 생물에 미치는 독성 영향에 대한 연구보다는 생물 체내에 존재하는 중금속 함량을 파악하는 연구가 수행되어져 왔다. 하지만, 최근에는 자연생태계에 존재하는 단독 또는 혼합 이물질에 대한 생물영향을 밝혀서 해양생태계의 위해성을 판단하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다(Han et al. 2008; Hwang et al. 2009, 2011, 2012). 이러한 연구는 USEPA (U. S. Environmental Protection Agency) 및 ASTM (American Society for Testing and Materials) 등에서도 표준 지침서를 제시하였으며, 오염물질에 대해 민감하게 반응하는 초기생활사를 이용한 시험법이 널리 활용되고 있다 (Martin et al. 1981; Beiras and Albentosa 2004; Geffard et al. 2004).

 해양오염물질이 생물체에 미치는 영향은 오래전부터 무척추동물을 대상으로 진행되어 왔으며 (Okubo and Okubo 1962; Kobayashi 1971; Lonning and Hagstrom 1975), 무척추동물 중에서 성게는 유용 수산 생물로서 배아 단계와 같은 초기 생활사를 활용하기 때문에 민감성이 뛰어날 뿐만 아니라 짧은 시간에 평가할 수 있다는 장점으로 인해 독성평가 생물로 오래전부터 널리 사용되어 왔다 (Kobayashi 1977, 1981; Greenwood 1983; Dinnel et al. 1989).

 이런 장점으로 인해 본 연구에서는 유용 수산생물로서 조간대 암반 지역에 서식하는 말똥성게 (Hemicentrotus pulcherrimus)의 초기생활사를 이용하여, As와 Cr의 독성 영향을 평가함과 동시에 시험방법으로 유용하게 활용할 수 있는지에 대한 타당성을 평가하고자 하였다. 또한, 본 연구결과를 바탕으로 해양 생태계 내에서 이들 중금속의 독성 영향에 대한 H. pulcherrimus의 정상 배아발생률에 대한 반수영향농도 (50% Effective Concentration, EC₅₀), 반수영향농도에 대한 95% 신뢰구간(95% Confidence limit, 95% CI), 무영향농도(No Observed Effective Concentration, NOEC), 최소영향농도 (Lowest Observed Effective Concentration, LOEC)를 제시하고자 하였다.

재료 및 방법

1. 실험동물

 실험에 사용된 H. pulcherrimus는 2012년 3월 전라북도 부안군 변산면 격포리 인근 해역의 조간대 암반지역에서 채집하여 국립수산과학원 서해수산연구소 해양생물배양실에서 1~2주간 순치 후 실험에 이용하였다. 해양생물배양실의 수조환경은 자연채광 상태의 유수식으로 9±1℃의 수온을 유지하였다.

2. 방정 및 방란 유도

 H. pulcherrimus는 암, 수 각각 6개체로 크기는 직경 3.5 cm 이상을 사용하였으며, 표면의 원생동물 및 이물질을 제거하기 위하여 멸균된 해수를 이용하여 표면을 세척한 후, 실험에 이용하였다. 배양액으로 사용된 해수는 membrane filter (pore size 0.45 μm)로 여과된 자연해수를 사용하였다. 0.5 M KCl 용액 1mL을 체강내로 주입시킨 후, 여과 및 멸균한 자연해수가 담긴 100 mL 용량의 비이커에 넣고 생식공이 충분히 잠기게 하였다 (Xu et al. 2012). 30분 동안 방정, 방란을 유도시켜 얻은 배우자를 정자용액은 1회, 난자용액은 3회 세정하여 실험에 사용하였다.

3. 중금속 노출

 실험에 사용한 중금속 As (Arsenic standard solution, CAS No. 7440-38-2), Cr (Chromium standard solution, CAS No. 7440-47-3)은 JUNSEI (Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다. 실험동물의 수정 및 배아 발생률에 미치는 As와 Cr의 영향을 살펴보기 위하여 멸균된 해수를 이용하여 1 ppm 농도로 조성한 stock solution을 준비한 후, 희석하여 사용하였다. As 및 Cr 노출에 의한 H. pulcherrimus의 수정률 및 배아 발생률을 조사하기 위한 실험농도는 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ppb의 7개 농도구로 설정하였다.

4. 배양조건

 실험에 사용된 중금속 농도를 조성한 멸균 해수 배양액의 pH는 7.8~8.2, 배양온도는 16±0.5℃를 유지하였다. 인공수정 (arificial insemination)시 적정한 정자 접종을 위하여 정자는 2,000~2,500배 희석하였으며, 멸균해수 배양액 1 mL에 수정란 1,500~2,000개를 준비해 Table 1의 조건으로 배양하였다(Pagano et al. 1985a, b).

Table 1. Experimental culture conditions using the normal fertilization and embryogenesis rates in the sea urchin, H. pulcherrimus

5. 수정 및 배아 발생 관찰

 방정 유도를 통해서 얻은 정자는 각각의 As 및 Cr 실험 농도에 30분간 노출 시킨 후, 방란 유도를 통해 얻은 정상 난자와 인공수정을 시켰다. 수정 10분 경과 후 수정막의 형성 유∙무로 수정률을 관찰하였다 (Fig. 1). 발생률은 pluteus 유생기인 수정 후 64시간째 정상 및 비정상 발생으로 나누어 관찰하였다 (Pagono et al. 1985a, b) (Fig. 2).

Fig. 1. Diagnostic features of normal (A) and abnormal (B) fertilized eggs in the sea urchin, H. pulcherrimus.

Fig. 2. Diagnostic features of normal (A) and abnormal (B) pluteus larvae in the sea urchin, H. pulcherrimus.

 실험은 농도별로 3회 반복 실시하였으며 100개 이상의 배아를 3회 반복 계수하여 고정된 배아 수에 대한 정상적인 배아 수의 백분율을 산출하였다. 이들 결과를 이용하여 수정 및 배아 발생률에 대한 반수영향농도 (50% Effective Concentration, EC₅₀)와 95% 신뢰구간(95% Confidence Limit, 95% Cl)을 probit 통계법을 이용하여 분석하였다. 또한, 무영향농도 (No Observed Effective Concentration, NOEC), 최소영향농도 (Lowest Observed Effective Concentration, LOEC)는 Dunnett’s를 이용하여 분석하였다.

6. 통계학적 분석

 대조군과 실험군의 유의성 검정은 Student’s t-test로 비교하였으며, p가 0.05 이하인 것만 유의한 것으로 하였다.

결 과

1. As와 Cr 노출에 따른 수정률의 변동

 H. pulcherrimus의 정자를 중금속인 As와 Cr의 동일농도 (0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ppb)에 30분간 노출시킨 후, 난자와 10분간 수정시켜 현미경으로 정상 수정률을 관찰하여 백분율(%)로 나타내었다 (Fig. 3). As를 첨가하지 않은 대조구의 수정률은 94.33±3.05%를 나타냈으며, 실험구 중에 가장 고농도인 100 ppb에서는 89.33±3.21%로 유의적인 차이가 나타나지 않았다. Cr의 경우는 대조구에서 95.66±2.30%로 나타났으며, 가장 고농도인 100 ppb에서는 91.66±3.51%로 이들 금속 첨가로 수정률은 유의적인 차이가 나타나지 않았다(Fig. 3).

Fig. 3. Changes of normal fertilization rates in the sea urchin H. pulcherrimus eggs exposed to As (A) and Cr (B). Vertical bars represent the SE of the mean for three times.

2. As와 Cr 노출에 따른 배아 발생률의 변동

 H. pulcherrimus의 배아 발생률에 미치는 As와 Cr의 영향을 나타냈다 (Fig. 4). 수정 후 64시간 후, pluteus 유생기의 정상 배아 발생률은 As의 경우 대조구에서 93.66±0.57%를 Cr에서는 95.33±2.30%를 나타냈으나, 중금속 농도가 증가할수록 급격히 감소하는 경향을 나타내었다. As를 첨가한 실험구에서 최소 농도인 6.25 ppb에서 67.66±7.63%로 유의적으로 감소하였으며 (P＜0.01), As농도가 증가할수록 정상 배아 발생률은 급격히 감소해 50 ppb에서는 1.33±1.15% (P＜0.01)를 나타냈으며 최고농도인 100 ppb에서는 정상 배아 발생률을 관찰할 수 없었다(Fig. 4). Cr의 경우도 중금속 농도가 증가할수록 정상 배아 발생률이 감소하는 경향을 나타내고 있으나, As보다는 농도의존성이 다소 덜 한 것으로 관찰되었다. Cr을 첨가한 실험군의 경우는 25 ppb 이상의 농도에서 유의적으로 감소하였으며(P＜0.05), 최고 농도인 100 ppb에서 정상 배아 발생률이 23.33±4.16%로 급격히 감소하였다(P＜0.01) (Fig. 4).

Fig. 4. Changes of normal embryogenesis rates in the sea urchin, H. pulcherrimus eggs exposed to As (A) and Cr (B). Vertical bars represent the SE of the mean for three times. *P＜0.05 and **P＜0.01 for control (not including As and Cr).

3. 배아 발생률을 이용한 독성 평가

 정상 배아 발생률은 As와 Cr 농도가 증가할수록 감소하는 농도 의존성을 나타냈으며, 농도반응 관계식은 표준 독성반응으로 잘 알려진 Sigmoid 형태를 나타냈다(Fig. 5).

Fig. 5. Concentrations-response by As and Cr treatment using the normal embryogenesis of sea urchin, H. pulcherrimus.

 H. pulcherrimus의 정상 배아 발생률에 대한 As의 영향을 독성치로 나타냈을 때, EC₅₀은 14.38 ppb를 나타냈고, EC₅₀에 대한 95% CI는 7.82~20.71 ppb를 나타냈다. 정상 배아 발생률에 대한 NOEC와 LOEC는 각각 ＜6.25, 6.25 ppb로 나타났다. 정상 배아 발생률에 대한 Cr의 반수영향농도 EC₅₀은 71.49 ppb를 나타냈고, 95% CI는 47.84~104.15 ppb를 나타냈으며, NOEC와 LOEC는 각각 12.5, 25 ppb를 나타냈다(Table 2).

Table 2. Toxicological estimation using the form of a fertilization membrane and normal pluteus in the sea urchin, H. pulcherrimus exposed to As, Cr

고 찰

해양으로 유입되는 오염물질로부터 해양생태계를 안전하게 감시할 수 있는 평가방법의 중요성이 인식되고 있으나 (Bidwell et al. 1998), 대부분 연안 해역에서 이루어지는 환경조사는 특정 유해물질을 이화학적으로 정량하여 기준치와 비교하는 전통적인 조사방법 위주로 실시되고 있다. 이런 전통적인 조사는 해양에 존재하는 유해물질에 대한 개별 정보를 제공한다는 점에서는 매우 유용하나, 유해물질에 대한 분석 능력이 제한되어 있어 미지의 오염물질에 대한 영향을 판단할 수 없을 뿐만 아니라 유해물질 상호작용에 의해 발생되는 독성의 상승(synergism), 부가 (addition) 및 길항(antagonism) 작용에 대해서는 전혀 알 수 없다는 단점을 지니고 있다 (Ahlf et al. 2002; Chu and Chow 2002). 이러한 이화학적 분석방법의 한계성을 극복하기 위하여 단일 유해물질의 양을 관찰하기 보다는 생물의 생리 및 행동학적 반응을 이용한 통합적인 독성을 평가하는 해양생태독성 연구가 활발하게 진행되고 있다(Beiras et al. 2003; Han et al. 2008; Hwang et al. 2012).

 해양에 유입되는 독성물질에 대한 생물반응을 살펴보기 위해서는 시험생물의 선정 및 독성물질에 대한 노출시기 등과 같은 시험방법의 차이로 인해 생물 체내에 미치는 영향은 다양하게 나타날 수 있는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 시험방법의 표준화 및 유용 시험생물 종을 선정하는 연구는 매우 중요하다. 본 시험에 사용한 시험생물 종인 말똥성게는 채집이 용이할 뿐만 아니라 생식세포인 정자와 난자를 쉽게 얻을 수 있으며 실험실에서 배아발생 과정을 관찰하기 용이한 장점으로 인해 생태독성 연구에 활발하게 이용될 수 있을 것으로 판단되어, 본 연구에서는 우리나라 조간대 암반지역에 서식하며 실험실에서 인공배란 및 수정을 쉽게 유도할 수 있으며 실내배양이 용이한 H. pulcherrimus를 시험종으로 이용하였다.

 본 연구 결과 As (0. 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ppb)와 Cr (0.6.25, 12.5, 25, 50, 100 ppb) 노출에 의한 H. pulcherrimus의 수정률은 대조구와 비교해 유의적인 차이를 나타내지 않았다(Fig. 3). 정상적인 배아 발생률의 경우 As는 대조군에서 93.67±0.57%를 보였으나, 농도가 증가할수록 급격히 감속해 최고농도구인 100 ppb에서는 정상 pluteus유생을 관찰할 수가 없었다(Fig. 4). Cr의 경우도 농도가 증가할수록 배아발생률은 감소하는 경향을 나타내었으며 100 ppb 농도에서는 정상 발생률이 23.33±4.16으로 유의적으로 감소하였다 (Fig. 4). 이상의 결과로 보아 As와 Cr은 성게의 정상적인 배아 발생과정을 저해 시키는 것을 알 수 있다. 중금속 농도가 증가할수록 배아 발생률이 농도 의존적으로 감소하는 것은 다른 중금속 연구결과와 유사하게 나타났다(Gopalakrishnan et al. 2007, 2008; Hwang et al. 2011, 2012). 본 연구결과에서 As와 Cr은 수정률에는 영향을 미치지 않은 것으로 나타났으나, Hwang et al. (2012)의 연구결과에서는 중금속인 Zn의 경우는 31 ppb에서 H. pulcherrimus의 수정률을 유의적으로 감소시켰다고 보고하였다. 또한, Fathallah et al. (2010)이 유럽산 조개류의 일종인 Ruditapes decusatus를 이용한 연구결과에서 본 실험과 동일하게 30분간 정자를 Cu, Hg, Zn에 노출시킨 후 난자와 수정시켰을 경우 Cu는 영향이 없었으나 Hg과 Zn은 256 및 512 ppt에서 유의적으로 감소하는 것으로 보고하였다. 그러나 Warnau et al. (1996) 등의 연구에 의하면 성게의 일종인 Paracentrotus lividus의 정자에 Hg, Cu, Cd 및 Ag을 노출시켰을 때 수정률의 감소를 보고하였다. 해초류인 Phallusia mammillata의 경우 Hg이 수정률에 영향을 미치지 않았다 (Franchet et al. 1997). 이러한 결과들로부터 중금속은 종류에 따라서 수컷 생식 세포인 정자의 활성에 영향을 미쳐 수정률 감소를 유발하는 것으로 사료된다. 그러나 생물종에 따라 중금속이 정자의 수정 능력에 미치는 영향이 다르게 나타나는 결과도 나타나므로 수정률을 이용한 중금속의 생태위해성의 평가는 충분치 못하다고 생각되며 또한 중금속 종류에 따라 다른 적용이 필요하다고 판단된다.

본 연구결과에서 중금속 노출에 의해 배아 발생률이 수정률보다 저해현상이 민감하게 나타나는 것은 배아가 pluteus 유생시기에 도달 시까지 As와 Cr에 더 오랫동안 노출됨으로 인해 발달 저해가 증가되었을 것으로 사료된다(Hwang et al. 2008). 또한, 이들 중금속에 의해 pluteus 유생 이전 시기부터 영향을 받았다 할지라도 형태적으로 분화정도가 진전된 pluteus 유생시기의 배아가 독성에 대해 증폭되어 표현되기 때문에 pluteus 형성 시기가 수정률에 비해 더욱 민감하게 나타나는 것으로 판단된다(Wui et al. 1992). 

 오염물질에 대한 상대적 독성을 평가하기 위하여 사용되는 반수영향농도를 이용하여 중금속이 H. pulcherrimus 배아 발생률에 미치는 영향을 살펴보면 As의 EC₅₀은 14.38 ppb, Cr은 71.49 ppb로 나타났다. 우리나라 남, 서해 주요 12지역(인천, 평택, 목포, 해창만, 광양, 통영, 행암만, 감만, 부산남항, 부산북항, 온산, 장생포)항구의 표면 퇴적물에서의 As 및 Cr의 오염정도를 조사한 결과 As는 3.9~60.1 ppm의 농도로 조사되었으며 조사 지역 중에서 장생포 지역이 가장 높은 농도로 나타났다. Cr의 경우는 11~401 ppm으로 부산남항이 가장 높은 농도로 나타났다(Choi et al. 2012). 이러한 결과로 보아 우리나라 남, 서해 지역의 As 및 Cr의 오염은 매우 높은 것으로 생각되며 본 연구결과에서 제시한 EC₅₀값은 오염정도를 평가하기 위한 중요한 지침으로 활용할 수 있으리라 생각된다. Hwang et al. (2009, 2011, 2012)은 H. pulcherrimus 배아 발생률에 미치는 영향을 이용한 실험에서 Cd의 EC₅₀은 244.04 ppb, Cu는 10.32 ppb, Co는 71.84 ppb, Pb은 45.13 ppb, Zn은 19.82 ppb로 보고하였다. 이들 연구결과를 이용하여 중금속에 대한 H. pulcherrimus 배아 발생률에 미치는 독성 영향은 Cu＞As＞Zn＞Pb＞Cr＞Co＞Cd순으로 나타낼 수 있다. Kobayashi (1994)는 성게(Diadema setosum)의 초기 발생에 미치는 영향에서 중금속 중에서 Hg이 가장 큰 독성 영향을 보였으며 Cu＞Zn＞Ni＞Cd 순으로 영향을 미치는 것으로 보고하였다. 불가사리의 초기 발생에 미치는 중금속 영향을 조사한 Yu(1998)의 결과에서 아므로 불가사리 (Asterias amurensis)는 Hg＞Cu＞Zn＞Cd＞Ni 순으로 영향을 미치며, 별 불가사리 (Asterias pectinifera)는 Cu＞Hg＞Zn＞Cr＞Ni 순으로 독성이 큰 것으로 보고하였다. 넙치 (Paralichthys olivaceus)의 수정란 부화율을 이용한 Hwang et al. (2012)의 연구에서는 Cr＞As＞Pb 독성의 영향이 큰 것으로 보고하였다. 이들 연구결과로 생물종에 따라 중금속 독성에 대한 민감도와 중금속에 대한 상대적 독성 영향은 차이가 있는 것으로 판단되며, 시험 생물종에 따른 노출시기와 같은 시험방법도 고려해야 할 것이다. Cu와 Zn은 생물 체내에 있어 생명 유지를 위한 필수 미량금속원소로 잘 알려져 있어 독성이 낮게 나타날 것으로 판단했으나, 상대적으로 독성이 큰 것으로 나타나, 향후 독성영향 기작에 관해 좀 더 구체적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

본 연구결과를 활용하여 Dunnett’s test를 실시한 통계 분석에 의한 LOEC에 의하면 해양생태계 내에서 As 및 Cr의 농도는 6.25 ppb 및 25 ppb를 초과할 경우, H. pulcherrimus의 정상 배아 발생률은 독성 영향을 받을 것으로 판단된다. 본 연구는 사육 및 관리가 편리한 동, 식물 플랑크톤을 대상으로 이루어지던 생태독성 시험연구에서 유용수산생물자원인 H. pulcherrimus를 이용한 것으로, 향후 해양유입 유해물질에 대한 수산생물 위해성 평가 시에 유용하게 활용될 것으로 판단된다. 

사 사

 본 논문은 2012년도 국립수산과학원 경상과제 연구비지원으로 국립수산과학원 서해수산연구소 해양생태 위해평가센터에서 수행한 연구입니다.