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서 론

 Aeromonas spp.는 수서 생태계에 상재하는 균으로서 사람을 비롯하여 파충류, 어류 등에 질병을 유발하는 균으로 알려져 있다(Joseph and Carnahan 1994; Park and Oh 2011). 또한 이들은 계통분류학적으로 매우 복잡하여 그 분류체계가 확립되지 않은 그룹이다 (Janda and Abbott. 2010). 담수어에 있어서 운동성 Aeromonas 감염증은 가장 흔한 질병이면서 조건성인 질병이다. 그 원인균의 일종인 Aeromonas veronii는 인간에게도 간혹 설사를 일으키는 세균으로 알려져 있다 (Gonzalez et al. 2002). 이 균은 어류에 epizootic ulcerative syndrome (EUS)을 일으키는 것을 특징으로 하는 병원균으로서 국내외에서의 그 연구의 예가 그리 흔하지 않다. 미국의 Maryland주의 gizzard shad (Dorosoma cepedianum)이라는 야생의 물고기로부터 1987년에 어류의 병원세균으로 분리된 바 있다(Torazo et al. 1986). 또한 일본의 강에 서식하는 물고기의 장내의 Aeromonas 균의 분포를 조사한 결과, Aeromonas veronii가 가장 높은 비율로 나타났다 (Sugita et al. 1995). 국내에서는 가물치에서 최초로 분리되어 질병의 원인균에 대한 병리조직학적 및 분자생물학적으로 검토된 바 있으며 (Lee 1992; Lee et al. 1993; Kang and Lee 2000), 국내의 이스라엘잉어에서는 처음으로 epizootic ulcerative syndrome (EUS)이 감염, 발생되어 연구보고된 사례와 그 계동분류학적 분석 및 항생제 내성에 대한 보고가 있다(Yu et al. 2010; Yi et al. 2012). 국외의 보고로서는 방글라데시에서 양식되는 수 종의 어류로부터 분리되어 유행성 궤양증을 일으키는 원인균으로서 보고되었으며(Rahman et al. 2002), 양식 메기에 감염된 Tetracyclin에 내성을 지닌 Aeromonas veronii의 생화학적 및 분자생물학적 특성에 대해 보고한 바 있다(Nawaz et al. 2010). 미국에서 양식되고 있던 무지개송어에서 분리되어 그 병원성을 확인한 바 있다 (Orozova et al. 2009). 최근에는 감염성 복수증을 나타내는 oscar라는 관상어의 복수로부터 병원성 세균으로 분리하여 그 특성을 보고하였다(Sreedharan et al. 2011). 최근 국내에서 양식중인 메기에 표피가 벗겨지면서 심한 근육의 괴사현상이 일어나는 새로운 질병이 발생하여 그 원인이 되는 세균을 분리하여 Aeromonas veronii biotype sobria로 동정하고 그 균을 건강한 메기에 주사하여 병원성을 재현하였기에 그 결과를 보고하고자 한다.

재료 및 방법

 2011년 8월에 전북 지역의 한 양어장에서 사육중이던 체표에 심한 피부염을 수반한 근육 괴사를 일으키며 죽어가는 메기를 원인균의 분리에 사용하였다. 양식장은 지수식으로서 200~300 g의 메기가 각 호지당 평균 10톤 정도 사육되고 있었다. 질병에 의한 폐사는 일일 5~10 마리로서 누적폐사량이 전체 사육량의 10%가 넘었다. 근육 괴사 등의 증상을 나타내는 어류를 10마리(평균 전장 26.5 cm)를 채집하여 산소 포장하여 살아있는 상태로 국립수산과학원 연구실로 이송하여 병성감정을 실시하였다. 병어는 대부분 외관상 심한 피부염을 일으키고 있었으며 근육이 노출된 개체도 있었다. 아가미는 빈혈현상이 있었으며, 해부하여 보면 간의 퇴색, 신장의 비대 등이 주로 관찰되었다. 병어는 광학현미경에 의한 기생충검사 및 RT-PCR에 의한 어류 병원성 바이러스 검사를 실시하였다.

 병원성 세균을 분리하기 위하여 병어의 환부 및 조혈조직으로부터 검체를 취하여 TSA 평판배지에 도말하여 25℃, 24시간 배양한 후, 우점종의 독립된 콜로니를 다른 평판배지에 배양하여 순수 분리하였다. 이를 API 20E 및 20NE 및 VITEK 2 System (bioMerieux 사)를 사용하여 동정하였다. 참조균주로서는 ATCC 35624 (Aeromonas veronii biogroup veronii) 및 ATCC 9071 (Aeromonas veronii biogroup sobria)을 사용하였다. 항생제 감수성 검사는 Müller-Hinton Agar 배지상에서 디스크 확산법을 적용하였다. 디스크의 종류 및 농도(μg disc^-1)는 Oxytetracycline (30), Oxolinic acid (2), Flumequine (30), Florfenicol (30), Ampicillin (10), Erythromycin (15), Gentamycin (10), Amoxicillin (20), Trimethoprim (1.25), Nalidixic acid (30), Clindamycin (2), Doxycycline (30), Sulfisoxazole (25)이었다. 디스크 확산법에 의해 25℃, 24시간 배양한 후, 우점종의 독립된 콜로니를 다른 평판배지에 배양하여 순수 분리하였다. 이를 API 20E 및 20NE 및 VITEK 2 System (bioMerieux 사)를 사용하여 동정하였다. 참조균주로서는 ATCC 35624 (Aeromonas veronii biogroup veronii) 및 ATCC 9071 (Aeromonas veronii biogroup sobria)을 사용하였다. 항생제 감수성 검사는 Müller-Hinton Agar 배지상에서 디스크 확산법을 적용하였다. 디스크의 종류 및 농도(μg disc-1)는 Oxytetracycline (30), Oxolinic acid (2), Flumequine (30), Florfenicol (30), Ampicillin (10), Erythromycin (15), Gentamycin (10), Amoxicillin (20), Trimethoprim (1.25), Nalidixic acid (30), Clindamycin (2), Doxycycline (30), Sulfisoxazole (25)이었다. 디스크 확산법에 의해 25℃, 24시간 배양한 후에 나타난 저지대의 직경을 측정하였다.

 병리조직학적 검사를 위해, 부검 중에 절취한 조직을 중성포르말린에 고정한 다음, 12~24시간 내에 세절하여 동 고정액으로 12시간 2차 고정한다. 이 후 충분한 수세를 거친 후, 단계별 알콜(100~70%)에서 탈수, xylene에서 투명화 과정을 거쳐 파라핀에 포매하여 파라핀 조직블럭을 제작하고, 마이크로톰 (Leica, Germany)을 이용하여 4 μm 두께로 박절하여 슬라이드글라스에 부착시킨다. 수분을 제거하고 50℃ 오븐에서 건조시켜 자동 염색 시스템 (Leica, Germaby)으로 H&E (hematoxylin and Eosin) 염색, 봉입을 실시하여 제작된 조직표본을 광학현미경으로 관찰하였다(Zaiss, Germany).

 인위적 감염을 위해 사용된 메기는 질병이 발생된 적이 없는 개인양어장으로부터 건강한 개체 100마리(평균전장 20.2 cm)를 구입하여 원형의 유수식 FRP수조(유효수량 1.5톤)에 수용하였다. 이들을 일주일간 매일 사료를 공급하면서 순치시켰다. 순치 후에는 개별 순환식 아크릴 수조(50×40×40 cm) 6개에 각각 10마리씩 수용하여 인위감염시험을 실시하였다. 시험구는 온도별 20℃와 28℃구, 농도별 4.1×10⁷, 4.1×10⁶ cfu mL^-1로 설정하였다. 각 시험구별 어류의 근육내에 균액을 0.5mL씩 주사한 후, 7일간 증상의 발현 및 폐사를 관찰하였다.

결과 및 고찰

 병어의 환부로부터 순수 분리된 균을 사용하여 국립수산과학원에서 운용중인 VITEK 2 System (bioMerieux 사)로 동정한 결과, 99% 확률의 Aeromonas sobria로 동정되었다. 그러나 이러한 상용의 기계에 의한 동정은 간혹 오류가 있을 수 있다고 자주 지적되고 있다 (Lamy et al. 2010). 따라서 API 20E, 20NE 등의 추가시험에 의해서 동정된 결과는 Table 1과 같다. Joseph and Carnahan (1994)는 Aeromonas 속 세균 중 7가지 주요 운동성 임상세균(Aeromonas Shubertii, A. trota, A. jandaei, A. veronii biovar sobria, A. caviae, A. hydrophila, A. veronii biovar veronii)을 구분하는 Key가 되는 생화학적 반응을 간단하게 도식화하였는데 이에 의하면 이번에 메기로부터 분리된 균은 Esculin hydrolysis 반응이 음성, Indole production에 있어서 양성을 나타내어 Aeromonas veronii biovar sobria로 간이동정되었다 (Janda and Abott 2010). 또한 Ornithine decarboxylase반응에서 음성을 나타내고 Arginine decarboxylase에서는 양성을 나타내어 ATCC 9071 (A. veronii biovar sobria)와 일치하였다(Carnahan et al. 1991; Abbott et al. 2003). 그러나 반복된 추가확인시험에도 불구하고 L-Arabinose 반응은 음성으로 ATCC 35624 (A. veronii biovar veronii)와 같은 반응을 나타냈으며, Trisodium citrate 흡수반응에 있어서는 양성을 나타내어 2개의 참조균주와 상이한 반응을 나타내었다. 또한 간혹 잘못 동정되어 질 수 있는 Vibrio cholelae와는 String test에서 음성을 나타내어 확실히 구분되었다. 37℃에 배양하였을 시에는 담수 어류에서 자주 분리되는 병원성 세균인 Aeromonas hydrophila에 비해 증식속도는 느렸으나 배양은 가능하였다. 이로써 이번에 메기에 표피박리 및 근육괴사를 일으키는 원인균은 Aeromonas veronii로 동정할 수 있었다. Aeromonas veronii는 다시 DNA group 8과 DNA group 10으로 나누어지는데 이들은 각각 biogroup sobria 및 biogroup veronii에 해당된다. 최근 담수어류에 감염되는 균이 주로 biogroup sobria이라고 보고되고있으며, 이번 시험에서는 아직 biogroup 단계까지의 정확한 분류는 하지못하였지만 아마도 본 균을 계통발생학적 분석을 실시한다면 biogroup sobria에 해당될 것으로 생각된다(미발표).

Table 1. Biochemical characteristics of isolate from catfish, Silurus asotus in the farm

 분리된 균의 각종 항생제에 대한 감수성시험의 결과는 Table 2와 같다. 표에서 보는 바와 같이 Oxytetracycline, Oxolinic acid, Flumequine, Florfenicol, Erythromycin, Gentamycin, Trimethoprim, Nalidixic acid, Doxycycline, Sulfisoxazole 등의 비교적 많은 약제에 감수성이 있었으나, Ampicillin, Amoxicillin, Clindamycin의 3종의 약제에 대해서는 발육 저지대가 없는 강한 내성을 나타내었다. 이는 국내의 이스라엘잉어에서 분리한 균이 Ampicillin에 대한 내성을 가진데 일치하였으며, 또한 가물치에서 분리한 균과도 같은 결과를 나타내었다 (Lee 1992; Yu et al. 2010; Yi et al. 2012).

Fig. 1. Naturally (A) and artificially (B) infected fish. The fishes showing severe epidermal desquamation and muscular necrosis.

Table 2. Antibiotic susceptibility of the isolated strain from the catfish, Silurus asotus

 자연감염어의 조직표본에 대한 병리조직학적 관찰결과는 Fig. 2의 A~D와 같다. 간, 비장 및 신장조직에서의 울혈이 심하였으며 간에서는 핵응축 및 핵융해로 관찰되는 간세포의 변성변화가 관찰되었다(Fig. 2-A). 비장과 신장에서도 울혈과 혈구세포의 변성이 관찰되었으며 비장에서는 협조직 (ellipsoids) 및 혈관주위의 섬유화현상이 관찰되었다 (Fig. 2-B). 신장의 사구체 및 세뇨관 주위에서도 초자변성, 섬유화변성이 관찰되었다. 심장은 심근 전반에 염증성세포가 산재하여 심근괴사가 나타났으며, 특히 심외막층에서의 세균집락으로 보이는 호염성의 응집체가 관찰되었다(Fig. 2-C). 소화관에서의 울혈과 점막고 유층 결합조직의 변성으로 섬유화현상이 관찰된다 (Fig. 2-D). 육안적으로 피부염이 관찰되었던 피부조직에서는 피하층의 근섬유 및 근섬유 주위로 심한 괴사변성, 근육내 출혈을 관찰할 수 있었다.

Fig. 2. A~D: naturally infected fish, A: Liver (congestion in sinus, degenerated hepatocytes showing pyknosis or karyolysis (arrows)), B: Spleen (fibrosis around ellipsoids (e), hyalic degeneration in stroma), C: Heart (necrosis of myocardium, inflammatory cells infiltration and bacterial cells clustars (arrows)), D: Intestine (congestion and fibrosis in lamina propria (circles)), E~H: artificially infected fish, E: Liver (pyknosis, karyorrhexis and karyolysis of hepatocytes), F: Spleen (hyalic degeneration around ellipsoids (e)), G: Skin (necrosis of muscle fiber, inflammatory cells infiltration (circles) between muscle layers), H: Intestine (normal feature).

 인위감염에 의해 병적증상을 나타낸 실험어의 병리조직학적 관찰결과, 자연감염어의 소견과 유사하게 관찰되었다. 간에서는 핵응축, 핵파열, 핵융해로 나타나는 간세포 변성이 자연감염어에 비해 약하게 나타나며(Fig. 2-E), 비장, 신장에서의 약한 울혈증상 및 세포변성이 확인되고, 비장의 협조직 주위로 자연감염어에 비해 약한 섬유화 현상이 관찰되었다(Fig. 2-F). 특히 피부는 주사부위에서 강한 염증성변성인 근섬유 괴사와 염증세포의 침윤이 관찰되었다(Fig. 2-G). 이에 반해 소화관에서는 자연감염어에서 나타나는 섬유화현상이나 염증성세포의 침윤은 관찰되지 않았다(Fig. 2-H).

 인위적 감염시험은 온도별 20℃와 28℃구, 농도별 4.1×10⁷, 4.1×10⁶ cfu mL^-1로 4개 시험구를 설정하여 건강한 시험어의 근육내에 농도별로 개체당 0.5 mL씩, 다른 온도별 대조구에는 멸균된 0.85%식염수를 주사한 후, 일주일간 증상의 발현 및 폐사미수를 관찰하였다 (Table 3). 그 결과, 균 농도 4.1×10⁷ cfu mL^-1의 주사구에서는 24시간 이내에 쉽게 증상을 발현하여 그 후 심한 근육의 괴사로 빨리 진행되면서 폐사의 속도도 빨랐다. 자연 감염에서의 낮은 폐사율과 상반되는 높은 폐사율로 나타났으며, 이는 실험적으로 높은 농도의 균을 근육내 직접적으로 주사하는 방법은 감염경로와 감염진행이 자연환경에서의 것과 차이가 있음을 보여주는 것이라 생각된다. 수온조건에 있어서는 20℃의 저수온에서 동일한 증상의 진행과 폐사가 빨리 진행되었다. 또한 주사 일주일 후에는 2개의 대조구를 제외한 모든 시험어가 폐사되었다. 그러나 생리적 식염수만을 주사한 대조구에서는 한 마리도 폐사하지 않았다. 모든 어류에 있어서 질병은 수온, pH, 암모니아, 수용밀도 등의 환경조건이 스트레스가 되어 발생한다고 알려져 있으며 (Janda and Abbott 2010), 특히 원인균의 병원성은 수온에 따라 많이 달라질수 있다(Kim et al. 2006). 인위감염의 결과에서와 같이 Aeromonas veronii는 Aeromonas hydrophila에 비해 출혈성 근육괴사로의 진행이 빠르고 이때에 우점종으로 나타나며 (Lee 1992), González 등 (2002)은 Aeromonas 속 세균의 독력이 온도의 영향을 많이 받는데 저수온에서 독력을 잘 나타낸다고 하였는데 이는 Aeromonas veronii가 20℃의 저수온에서 우점종으로 검출되지만 균의 독력이 저수온에서 더 활성이 있었던 것으로 생각된다. 최근 Aeromonas 균의 세포용해독소의 정제와 특성에 관한 보고가 되고 있는데, 이번의 분리된 균의 독소의 특성에 대해서도 좀 더 연구되어야 할 필요가 있을 것으로 생각된다(Krzyminska et al. 2006).

Table 3. Results of experimental infections of catfish, Silurus asotus with isolate.

사 사

 본 연구는 국립수산과학원 연구비 지원(RP-2013-AQ-204)으로 수행되었습니다.