서 론

과불화화합물(perfluorinated compounds, PFCs)은 계면 활성제, 윤활유, 접착제, 난연제 그리고 의학에서 널리 사 용되어지고 있는 잔류성 유기오염물질의 한 종류이다 (Renzi et al. 2013). 과불화화합물은 환경 중에서 쉽게 분 해되지 않으며 생체 내에서는 오랫동안 잔류하기 때문 에 위해성이 우려되는 물질로서 알려져 있다(Inoue et al. 2004). PFOS (perfluorooctane sulfonate)는 복합과불화 화합물이 분해되는 과정에서 나타나는 물질의 일종으로 서 환경과 생물 체내에 널리 분포하는 물질이다(Giesy and Kannan 2001). 또한, PFOS는 표층수에서 저농도로 발견되었으며 (Kannan et al. 2005), 생물 체내에서 높은 축적률을 가지는 특징을 보였고, 여러 환경매체 및 인간 의 혈중에서 상대적으로 고농도로 확인되고 있다(Martin et al. 2002; Stock et al. 2004). 2002년 OECD에서 PFOS 의 유해성에 대해 조사를 수행한 결과 PFOS는 환경 중 으로 노출되면 환경에 잔류하여 생물에 위해성이 나타 날 수 있다고 보고되었으며(OECD 2002), 2009년 5월 스위스 제네바에서 열린 제4차 스톡홀름협약 당사국총 회에서 PFOS는 규제대상물질로서 제한되었다.

PFOS는 환경잔류성으로 국내외의 먼지 (Strynar and Lindstrom 2008), 토양(Higgins et al. 2005), 다양한 해양 환경 (Yamashita et al. 2005; Nakata et al. 2006; Bossi et al. 2008)에서 확인되며, 우리나라 인근에 접해 있는 중 국과 일본에서도 흔재한다(Zareitalabad et al. 2013). 국내 환경부자료에 따르면, 물에서는 0.67~415.67 ng L^-1가, 퇴적물에서는 2000.2 ng^-1이 나타나며 일부 산업지역에서 는 다소 높은 값이 관찰되었는데 이는, 미국, 일본과는 비 슷한 수치로 다소 높은 값이 보고되었다(Korea Ministry of Environment, 2007). 최근 서해연안에서 PFCs 중 PFOS 의 농도가 물에서는 0.35~47 ng L^-1가, 퇴적물에서는 0.2~5.8 ng^-1이 나타남으로써 비교적 적은 수치가 보고 되었다(Naile et al. 2013). PFOS는 환경 중에 잔류함이 확인되어, 직·간접적으로 인간에게까지 영향을 미칠 수 있으므로, PFOS에 대한 생태독성반응 연구의 필요성이 대두되고 있다.

칠게(Macrophthalmus japonicus)는 절지동물문 십각목 달랑게과에 속하며, 우리나라 포항 이북을 제외한 전 조 간대 지역에서 관찰되는 종이다(Hong et al. 2006). 칠게 는 조간대 환경에서 유기물 섭식을 통한 생태계 오염을 방지하며, 조간대 갯벌에 은신처를 만드는 행동습성으로 조간대 갯벌의 산소공급과 탄소순환에 큰 영향을 미친 다(Otani et al. 2010). 또한, M. japonicus는 저서성 무척 추동물로서 서식환경이 제한적이여서 조간대 환경을 가 장 잘 반영할 수 있는 지표생물로서 독성노출실험이 용 이하여 해양 환경모니터링에 중요하게 이용될 수 있다 (Ortiz-Zarragoitia and Cajaraville 2006). 따라서, 조간대에 서식하는 M. japonicus는 PFOS와 같은 환경잔류 화합물 독성을 연구하기에 매우 유용한 지표생물이라고 할 수 있다.

PFOS는 혈액 중의 단백질과 결합하며 (Giesy and Kannan 2001), 노출된 설치류에서는 간독성이 보고되었 다 (Nakayama et al. 2005). 송사리 (Oryzias latipes)에서 PFOS는 성장감소와 같은 초기 성장단계와 기형발생에 영향을 준다(Fang et al. 2013). 또한 여러 동물 실험에서 PFOS는 간과 면역기능에 영향을 미치는 것으로 보고되 었다(Liu et al. 2007; Qazi et al. 2009). 민꽃게(Charybdis japonica)는 카드뮴에 노출 되었을 때, 신진대사 기능에 차이를 보였으며 (Wang et al. 2013), Bisphenol A와 4- Nonylphenol 노출을 통한 각 조직별 HSP70 유전자 발현 에 따른 차이를 확인한 연구가 보고되었다 (Park and Kwak 2013). 연구대상 종인 M. japonicus에 대한 연구는 미미하여 카드뮴노출에 따른 체내 축적량과 칼슘의 상 관성에 대한 연구 (Korea Ocean Research and Development Institute. 1992)가 보고되었으며 지금까지 PFOS와 같은 과불화화합물에 대한 생태독성연구는 국내에서 시 도되지 않은 상태이다.

본 연구에서는 해양저서 생물인 국내산 M. japonicus 를 대상으로 PFOS노출에 따른 생태독성 반응을 살펴보 고자 한다. PFOS노출에 따른 M. japonicus의 생태독성학 적 반응을 파악하여, 생존율, 외부 부속지 탈락, 갑각의 색, 내장 조직 등을 관찰·분석하였다. M. japonicus의 물질노출에 따른 생물학적반응성을 전체적으로 살펴보 고 판정점을 제시하는 것은 해양생태계 모니터링을 위 해 중요한 정보로 활용될 수 있을 것이다.

재료 및 방법

1.실험생물

실험생물 종으로 이용한 칠게(Macrophthalmus japonicus, 갑각강, 십각목, 달랑게과)는 2±0.3 cm 크기로 전라 남도 여수시 여자만에서 수집하였다. 수집한 M. japonicus는 부속지의 탈락이 없는 건강한 게로 노출전 대조 군과 PFOS 노출군 유리수조에 각각 20마리의 칠게를 넣어두었으며, 오차범위를 줄이기 위하여 3반복구를 두 고 시행하였다. 실험개체를 추출하는 과정과 환경변화에 따른 개체의 적응을 고려하여 실험수조로 옮긴 후 24시 간 순치한 후 노출실험을 진행하였다. 순치조건은 실온 22±1°C, 염도 33±1‰, 광주기 17L : 7D, 원활한 산소공 급을 위하여 산소공급기를 설치하였으며 먹이는 Tetramin (Tetra-Werke, Melle, Germany)을 24시간 간격으로 0.95 ±0.5 g을 공급하였다.

2.노출시약 및 실험조건

노출물질인 PFOS (perfluorooctane sulfonate, Sigma- Aldrich St. Louis, MO, USA)는 수 용해도가 낮으므로, 아세톤(acetone, CH₃COCH₃, Kanto Chemical Co., Inc.)에 녹여 1000 mg L^-1 stock solution을 조제하여 사용하였다. 노출조건은 유리수조(315 mm×450 mm)를 이용하여 7 일간 수행하였으며, 노출농도는 0, 1, 10, 30 μg L^-1로 설 정하였다. 순치 24시간 이후 PFOS를 노출하였으며, 노 출 환경은 순치조건과 마찬가지로 실온 22±1°C, 염도 33±1‰, 광주기 17L : 7D로 설정하였으며, 산소공급기를 통하여 산소를 공급하였다.

3.생물학적 판정점 측정

1)생존율

PFOS에 대한 M. japonicus의 생존율을 조사하기 위해 노출 후 7일 동안 매일 같은 시간에 사망한 개체를 확 인하였으며, 노출 후 24시간 간격으로 부속지의 움직임 이 없고 눈자루의 미동이 없을 경우 치사한 것으로 판 단하여 치사 개체를 기록하였다. 노출 7일이 지난 후, 전 체 노출 개체 수에 생존한 개체 수를 백분율로 환산하 여 생존율을 나타내었다 (Y(%)=(B/A)×100, Y=생존율, A=전체개체 수, B=전체개체 수-치사개체 수).

2)부속지 탈락 및 갑각과 내장색 변화

M. japonicus의 부속지 탈락, 갑각과 내장 색의 변화를 관찰하였다. PFOS 노출에 따른 외·내형적 독성 영향을 분석하기 위해 생존율과 마찬가지로 7일 동안 24시간 간격으로 관찰 측정하였다. 부속지 탈락은 노출 전 대조 군과 노출군의 부속지 갯수를 확인 후, M. japonicus로부 터 완전히 탈락되어 수조에 떨어져 있는 부속지 수를 기록하여 탈락빈도를 환산하였다. 갑각색의 변화는 노출 기간 동안 갑각의 백화현상이 나타나는 개체를 관찰하 였다. PFOS 노출에 따른 내부 장기의 변화를 파악하기 위하여 7일 노출 후, 게를 해부하여 내장색의 변화를 관 찰하였다. 내장색의 변화는 핀셋을 이용하여 갑각을 제 거 후, Olympus C-7070 Digital camera로 촬영하여, Image J program으로 내장색의 명도를 측정하였다.

4.통계적 자료분석

PFOS 노출에 대한 칠게의 생물 판정점 결과에 대해 분산분석(ANOVA, 유의수준 α=0.05)을 실시하고, 모든 데이터는 평균±분산 값으로 표시하였다. 또한, 각 실험 구와 대조구 사이의 유의적 차이를 비교하기 위해 SPSS 12.0KO (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 Tukey’s test로 분석하였다. P<0.05를 통계적으로 유의수준으로 검정하였다.

결 과

1.생존율

생존율은 독성 노출실험에서 기본적인 생물 반응을 반영하는데 PFOS에 노출된 M. japonicus는 48시간부터 생존율의 차이가 관찰되었다(Fig. 1). 노출하지 않은 대 조군 개체의 생존율은 144시간(D6)까지 변화가 없으며,마지막 날인 168시간 (D7)에서 98%으로 감소하였다 (Fig. 1). 상대적으로 저농도인 1 μg L^-1 PFOS 노출 시, 생존율은 120시간 (D5)까지는 100%이나, 144시간 (D6) 부터 96%로 감소 후, 168시간(D7)에서 92%로 감소하 였다. PFOS 10 μg L^-1에 노출한 M. japonicus 생존율은 48시간(D2)에 96%, 96시간(D4) 88%, 144시간(D6) 80% 로 노출시간 의존적으로 감소되었다. 상대적 고농도인 30 μg L^-1 PFOS 노출시 48시간 (D2)에 96%, 96시간 (D4)에 92%, 144시간(D6)에 76%로 노출시간 의존적으 로 생존율이 감소되었다. 노출 7일째인 168시간의 M. japonicus의 생존율을 비교해 보면 대조군이 98%인 데 비해 1 μg L^-1가 92%, 10 μg L^-1가 80%이며, 고농도인 30 μg L^-1가 76%로 PFOS 노출농도에 의존적으로 생존율의 감소함을 확인하였다.

2.부속지 탈락 빈도

PFOS에 노출된 M. japonicus의 노출 실험 중 탈락된 부 속지의 개수를 확인하였다(Fig. 2). 대조군에서는 24시간 (D1)때는 부속지 탈락이 0%, 96시간(D4)에 8%, 168시 간(D7)에 15%로 나타났다. 노출 시험군 1 μg L^-1에서는 PFOS 노출 후 24시간(D1)에서 50%, 96시간(D4)에 57%, 168시간(D7)에는 70%로 부속지 탈락빈도가 증가하였다. 10 μg L^-1 PFOS 노출에서 부속지 탈락빈도는 24시간(D1) 에 57%, 96시간(D4)에 90%, 168시간(D7)에 97%로 농 도증가에 따라 증가되었다. 30 μg L^-1 PFOS 노출에서는 24시간(D1)에 77%, 96시간(D4)에 97%, 168시간(D7)에 100%로 나타나 전체적으로 PFOS 노출농도와 노출시간 의존적으로 칠게의 부속지 탈락빈도가 늘어났다.

3.갑각 색의 변화

PFOS 노출에 따른 M. japonicus 갑각의 색 변화를 관 찰한 결과, 노출 후 시간이 경과함에 따라 갑각이 하얀 색으로 변해가는 백화현상(Whitening event)이 나타났다 (Fig. 3). PFOS 노출 7일 후, 농도에 따른 M. japonicus의 갑각색을 조사하였다 (Fig. 4). 대조군의 갑각색은 색이 선명하며 진한 회색빛을 보였다(Fig. 4A). 반면에, 저농 도인 1 μg L^-1 PFOS에 노출된 M. japonicus는 전체적으 로 옅은 회색빛을 나타내며, 부분적으로 하얗게 변해가 는 백화현상을 보였다(Fig. 4B). 10 μg L^-1 PFOS에 노출 된 M. japonicus는 백화현상이 나타나는 면적이 증가하 였다(Fig. 4C). 30 μg L^-1 PFOS에 노출된 M. japonicus의 갑각은 대부분이 백화현상으로 인해 하얗게 변화하였으 며, 극히 일부분이 옅은 회색을 유지하였다(Fig. 4D).

4.내부 장기의 색 변화

PFOS에 노출된 M. japonicus 내부장기의 색 변화를 관찰하였다 (Fig. 5). 대조군 M. japonicus는 전체적으로 선명한 노란색으로 조직의 경계가 명확하였다(Fig. 5A). 저농도인 1 μg L^-1 PFOS에 노출된 M. japonicus는 대조 군과 비슷한 밝은 노란색을 나타내지만 조직간의 경계 가 불명확해짐을 관찰하였다(Fig. 5B ). 10 μg L^-1 PFOS 에 노출된 M. japonicus는 대조군에 비해 내장의 노란색 선명도가 많이 낮아지고, 조직 간 경계도 불명확하게 나 타났다(Fig. 5C). 고농도인 30 μg L^-1 PFOS에 노출된 M. japonicus는 색과 선명도에서 큰 차이를 나타내어 내부 장기의 색은 검은 색에 가깝게 변하였고, 색의 선명도도 대조군에 비해 크게 떨어지며 조직 간의 경계도 불명확 해졌다. 내부장기의 색에 대한 결과를 Image J 프로그램 을 이용하여 수치화하여 분석한 결과, 대조군은 내부장 기 색의 명도가 100%일 때, 1 μg L^-1 PFOS에 노출된 게 의 내부장기 색 명도는 67%, 10 μg L^-1에서는 42%, 고농 도인 30 μg L^-1 PFOS에서는 40%를 나타내었다(Fig. 6).

고 찰

PFOS는 과불화화합물이 분해되는 과정에서 나타나는 잔류성 물질로, 생물에게 잠재적 유해물질로 알려져 있 다(Inoue et al. 2007). PFOS는 인간과 쥐와 같은 포유류 에서는 연구가 활발하게 되었으나 (Martin et al. 2002; Stock et al. 2004; Nakayama et al. 2005), 해양 생물을 대 상으로 한 연구는 드물다. 갑각류는 주요한 식량자원으 로 경제적 가치와 형태적 다양성으로 많은 연구가 되고 있다(Martin and Davis 2001; Liu and Cui 2010; Mao et al. 2012). 특히, M. japonicus는 갯벌 생태계에서 산소와 탄 소 순환에 중요한 영향을 끼치며, 유기물을 섭식하여 갯 벌 생태계 유지를 도와주는 종이기도 하다. M. japonicus 는 국내에서의 분포는 전북 새만금(Choi and Jung 1995) 가 있으며, 고군산 군도의 갯벌(Rho and Kim 2004), 인천 장봉도 갯벌에서(Seo and Hong 2006) 우점종으로 보고되 었다. 또한, M. japonicus와 M. banzai의 형태적 연관성을 유전학적 관점에서 연구하였으며(Horii et al. 2001), M. japonicus의 혈림프를 이용하여 렉틴 분리를 통한 당 결 합 특성 연구가 보고되어 있다(Kim et al. 2006). 환경 유 해물질인 카드뮴 노출에 따른 M. japonicus의 영향에 관 하여 보고되기도 하였다(Korea Ocean Research and Development Institute 1992).

본 연구에서는 PFOS에 노출된 M. japonicus를 대상으 로 생존율, 부속지 탈락, 갑각의 색 변화 및 내부 장기의 색 변화 관찰을 통하여 PFOS 독성의 영향과 지표종으 로서의 잠재적 가치를 알아보고자 하였다. PFOS 노출에 따른 M. japonicus의 생존율은 노출시간 의존적으로 감 소하는 패턴을 보였다(Fig. 1). 이 결과는 Oryzias melastigma에서의 PFOS 노출에 대한 생존율의 감소와 유사 하였다(Fang et al. 2013). 또한, PFOS 노출에 대한 부속 지 탈락은 관찰은 24 h, 96 h와 168 h (7D)노출시간의 증 가에 따라 부속지 탈락 빈도가 증가되는 것으로 나타났 다(Fig. 2). 생존율의 감소패턴과 유사하게 M. japonicus 의 부속지 탈락도 PFOS 노출농도와 노출시간에 따라 빈도가 증가하였다. M. japonicus의 갑각의 색은 PFOS 농도 증가에 따라 백화현상이 두드러지게 관찰되었으 며(Fig. 3). 내부 장기의 색 선명도와 조직 간 경계가 PFOS 노출농도가 증가함에 따라 감소함이 확인되었 다(Fig. 4). PFOS 노출독성에 대한 부속지 탈락 빈도의 증가, 갑각과 내장의 색변화는 노출 농도에 따라 대조군 에 비해 유의적 차이점을 나타내었다. 이러한 결과는, PFOS 독성에 따라 칠게의 생물적 반응성이 영향을 받 는것이 확인되었다. 이는 zebrafish를 대상으로 PFOS 노 출 실험 결과에서 나타난 형태적 기형과 같은 독성 영향 에 따른 생물 반응과 유사한 결과라고 할 수 있다(Cho et al. 2010). 따라서, 유해물질 노출에 따른 형태나 색의 변 화는 환경모니터링을 위한 중요한 생물 판정점이 되기 때문에(Qu et al. 2009), PFOS 노출에 따른 M. japonicus 의 외부 갑각 색과 내부 장기 조직의 색 변화를 생태독 성의 유용한 판정점으로 제시하고자 한다. PFOS 노출시 간과 노출농도에 비례하여 나타나는 생물적 반응(갑각 의 색, 내부 장기의 색 변화)은 해양 생태환경의 모니터 링 및 유해물질 관리에 있어 주요한 정보로 활용될 수 있을 것이다.

PFOS의 환경 잔류성으로 다양한 생물에서 독성영향 에 대한 연구가 이루어지고 있다(Zhao et al. 2012). 해양 갑각류 중 저서성은 수중생활 뿐만 아니라 육상생활을 하는 습성을 나타내, 해양 생태계 환경의 변화를 반영할 수 있다. 따라서 저서성 갑각류는, 환경 잔류성 화합물의 독성영향을 조사하기에 적합한 지표생물이 될 수 있다. 갑각류 곤쟁이목에 속하는 Siriella armata를 대상으로 PFOS와 PFOA 노출실험을 통해 과불화화합물의 생태학 적 위험성이 조사되어졌으며(Mhadhbi et al. 2012), 환경 중 PFOS의 생체 축적량 및 분포를 알아보기 위하여 조 간대 게를 대상으로 체내 축적량이 조사되기도 하였다 (Naile et al. 2013). M. japonicus에서 PFOS 독성에 대한 연구는 보고된 바 없으나, M. japonicus 체내에 카드뮴이 축적됨이 보고되었으며(Korea Ocean Research and Development Institute. 1992), BPA와 NP 노출시 C. japonicus 의 조직별 HSP70 유전자 발현의 차이성 연구가 보고되 어졌다(Park and Kwak 2013). PFOS 노출이 설치류에서 는 간독성을 유발하며(Nakayama et al. 2005), zebrafish 의 초기 난 발생과정에서는 부화율에 영향을 주어 생존 율, 성장율, 간독성 및 유전발현의 차이가 나타남을 보고 하였다(Fang et al. 2013). 본 연구에서는 국내 서식하는 조간대 M. japonicus를 대상으로 생태독성 반응의 판정 점으로 외형적, 내부적인 관점에서 다양하게 조사하였 다. PFOS 노출농도와 시간에 따라 생존율의 감소, 부속 지 탈락빈도의 증가, 갑각의 백화현상 증가와 내부 장기 색의 변화가 나타남을 확인하였다. 이러한 결과는 M. japonicus의 유해물질 노출에 따른 생물학적 반응 연구 뿐 아니라 해양환경의 유해화합물관리와 생태계 모니터 링을 위한 주요한 위해성 진단과 평가방법으로 활용할 수 있을 것이다.

적 요

PFOS (Perfluorooctane sulfonate) 노출에 따른 Macrophthalmus japonicus의 생태독성학적 판정점을 탐색하고 자 생존율, 부속지 탈락 수, 갑각 및 내장 색의 변화를 관찰하였다. 그 결과, PFOS 노출에 따른 생존율의 감소 는 농도 의존적 패턴을 보여 상대적 고농도인 PFOS 30 μg L^-1에서 168시간 노출시 24%의 가장 낮은 생존율을 나타내었다. 부속지 탈락은 대조군에 비해 PFOS 노출군 에서 탈락빈도가 증가하였다. 또한 대조군에서는 갑각색 의 변화가 관찰되지 않았으나, PFOS 노출군에서는 백화 현상이 농도의존적 패턴으로 관찰되었다. 내부 장기의 색 선명도도 PFOS 노출군에서 대조군에 비해 변화가 나타났다. 이러한 결과는 해양 저서환경의 모니터링을 위한 생물적 주요한 정보를 제공해 줄 것이다.