서 론

암모니아 독성은 수서동물, 특히 어류에게 보편적인 문제로 되어오고 있다. 암모니아는 어류가 주로 아가미 를 통해 배출하는 주요 질소화합물로 암모니아의 생성 은 단백질 섭취량, 대사효율과 같은 요인에 크게 좌우되 며, 이러한 요인조차 종 특이적이며, 염분, 수온, pH, 외부 의 암모니아 농도에 의해 영향을 받는다 (Randall and Tsui 2002). 집약적 어류양식 시스템에서 고밀도 사육, 먹이공급, 환수량 부족은 암모니아 농도를 높이며, 이로 인해 넙치 (Paralichthys olivaceus) (Kim et al. 1997), 조피 볼락 (Sebastes schlegeli) (Chin et al. 1998), gilthead seabream (Sparus aurata) (Wajsbrot et al. 1993), 터봇 (Scoph- thalmus maximus) (Foss et al. 2009), 유럽농어 (Dicentrarchus labrax) (Dosdat et al. 2003), 붕어 (Carassius auratus) (Sinha et al. 2012)와 같은 양식어류 성장에 악영향을 미 친다. 또한 수중의 고농도 (high environmental ammonia, HEA) 암모니아는 어류의 혈장 암모니아 농도 (Wilson and Taylor 1992)와 어체 암모니아 함량을 증가시킨다 (Paley et al. 1993). HEA는 어류의 스트레스 요인으로 작 용하여 1차적 반응으로 혈장 코티졸 상승을 유발하며 (Knoph and Olssen 1994), 이는 2차적으로 글리코겐합성, 당신생합성 (Wendelaar Bonga 1997) 뿐만 아니라 단백질 이화작용 (Mommsen et al. 1999)과 암모니아 생성 (Randall and Tsui 2002)을 촉진시킨다. 이 외에도 아가미 상 피의 과증식 (Benli et al. 2008), 삼투압조절 혼란 (Person- Le Ruyet et al. 2003), 호르몬 조절 변화(Dosdat et al. 2003) 등 여러 측면에서 부정적인 영향을 미치며, 과민반응, 코 마상태, 경련 및 폐사에 이르게 한다(Ip et al. 2001).

어류 체내의 암모니아는 아가미를 통해 외부로 배출되 지만, HEA 조건에서는 아가미를 통한 암모니아 배출이 감소하며, 반대로 내부로의 암모니아 유입이 일어난다. 경 골어류 및 다른 수서동물의 아가미는 암모늄 이온 수송 에 의한 암모니아 항상성 유지와 관련된 여러 이온 수송 체와 메커니즘을 가지고 있다(Evans et al. 1999, 2005). 아 가미의 Na⁺/K⁺-ATPase (일명 Na⁺ pump로도 불리움)는 삼 투압조절과 직접적으로 관여하며, 또한 K⁺와 NH₄⁺는 수화반경 (hydrated radius)이 동일하기 때문에 Na⁺/K⁺- ATPase는 K⁺ 대신 NH₄⁺를 혈액에서 아가미 상피로 펌 핑하는 중요한 역할을 한다(Randall et al. 1999; Alam and Frankel 2006). Na⁺/K⁺-ATPase에 의해 아가미 상피로 들 어온 NH₄⁺는 Na⁺/NH₄⁺-교환체를 통해 Na⁺와 교환된다 (Evans et al. 2005). 따라서 Na⁺/K⁺-ATPase는 체내의 NH₄⁺와 외부 환경의 Na⁺를 교환하는 추진력을 제공하 므로, 암모니아 오염에 대한 중요한 지표로 활용할 수 있다.

본 연구에서는 우리나라에서 주요 양식대상종인 조피 볼락을 대상으로 HEA에 급성 노출시켰을 때, 그 생리학 적 반응으로 아가미 Na⁺/K⁺-ATPase 활성, 호르몬적 변 화 등을 조사하고자 하였다.

재료 및 방법

1.실험어 및 암모니아 노출

국립수산과학원(부산시 기장군) 15톤 콘크리트 사각수 조에서 사육중인 조피볼락 (평균 전장 26.9±0.3 cm, 체 중 301.1±8.0 g) 중 40마리를 무작위로 잡아 5개의 유수 식 FRP 수조(수용적 300 L)에 각각 8마리씩을 수용하여 7일간 적응시켰다. 이 기간 동안 수온은 15±0.3°C, 염분 은 33.5‰였으며, 하루에 2회 상업용 배합사료를 공급하 였으나, 암모니아 노출 24시간 전부터는 절식시켰다.

암모니아에 대한 생리학적 반응을 조사하기 위하여, 실험어가 수용된 각 수조를 지수상태로 전환시킨 다음, NH4Cl (Junsei, Japan)을 첨가하여 총 질소의 양이 각각 0, 5, 20, 50, 100 mg L^-1이 되도록 하였다. 이 후 각 수조 의 pH 및 NH₄⁺를 측정하여 이온화 되지 않은 상태인 NH₃를 아래 식으로 계산하였으며, 계산된 NH₃ 농도를 바탕으로 총 5개의 실험구(대조구, 1, 2, 4, 8 mg L^-1구)를 설정하였다(Table 1).

NH₃(mg L^-1)=[NH₄⁺(10^pH) (17/14)]/[(K_b/K_w)+10^pH], 여 기서 Kb: 암모니아 평형방정식의 이온화상수, Kw: 물의 이온화 상수

실험어의 암모니아 노출은 3시간으로 하였으며, DO는 6 mg L^-1 이상이 유지되도록 에어레이션을 해 주었다. 실 험기간 동안 모든 실험어는 생존하였다.

2.혈액 및 조직 샘플링

암모니아 노출에 따른 혈액 및 조직 샘플링은 각 실 험구의 모든 실험어를 대상으로 실시하였다. 실험어를 150 ppm의 tricaine methanesulphanate (MS-222, Sigma, USA)로 마취한 다음, heparin sodium 처리된 주사기 (3 mL)로 실험어의 미부혈관으로부터 혈액을 채취하여 일 부는 Ht 측정에 사용하였으며, 나머지는 원심분리 (4°C, 10000 rpm, 15분)후 혈장을 분리하여 분석전까지 -80°C 의 초저온 냉동고에 보관하였다. 아가미 Na⁺/K⁺-ATPase (NKA) 활성을 조사하기 위하여, 실험어 아가미의 새변 (왼쪽, 2번째)을 절취하여 액체질소 (-196°C)에서 급속 냉동시킨 다음 -80°C에 보관하였다. 또한 아가미의 조 직학적 변화를 관찰하기 위하여 새변의 일부를 10% 중 성포르말린에 고정하였다.

3.혈액 분석

1)Hematocrit (Ht)

Ht는 혈액을 모세유리관 (Hirschmann, Germany)에 넣 어 원심분리 (10,000 rpm, 10분) 하여 Ht 측정판(MICROHAEMATOCRIT READER, Hawksley, Co, UK)으로 측 정하였다.

2)혈장 코티졸

혈장 코티졸은 cortisol EIA kit (Oxford, USA)를 사용 하여 효소면역분석 (enzyme immunoassay, EIA)로 측정 하였으며, 간략히 설명하자면 다음과 같다: ethyl ether를 사용하여 혈장 100 μL로부터 cortisol을 추출한 후, 유기 상(organic phase)을 분리 하여 이를 N2 가스로 증발시켰 다. 잔여물을 100 μL의 추출 buffer에 녹인 뒤, 이중 10 μL를 다시 990 μL의 추출 buffer에 더하여 100배로 희 석시켜 이를 샘플로 사용하였다. 샘플 또는 표준용액 50 μL를 microplate에 2반복으로 넣은 후, 동량의 Cortisol- HRP Conjugate를 첨가하여 1시간 동안 상온에서 두었 다. Microplate를 세척한 후, 150 μL TMB 기질을 각 well 에 넣은 후 30분 동안 반응시켜, microplate reader (ThermoScientific MultiskanSpectrum, Thermo, Finlan)로 650 nm에서 값을 측정하였다. 코티졸의 분석시 Inter-assay coefficients of variation (CV) 및 Intra-assay CV는 각각 12.1% 및 7.2%이었다.

3)혈장 암모니아, 글루코스, 이온 및 삼투질농도

혈장의 암모니아, 글루코스, Na⁺, Cl^-은 생화학자동분석 기 (Dry-chem 4000i, Fujifilm, Japan)로, 삼투질농도는 삼 투압측정기(Vapro 5520, WESCOR, USA)로 측정하였다.

4.Na+/K+-ATPase (NKA) 활성 분석

아가미 NKA 활성은 Hwang et al. (1989)의 방법을 변 형하여 측정하였다. 냉동된 새변 절편 (약 20~25 mg)을 SEI 용액(200 mM Sucrose, 5 mM Na₂ EDTA, 100 mM Imidazole- Hcl buffer, pH 7.6)으로 녹여 washing한 후, SEID 용액 (SEI+0.1% sodium deoxycholate) 1 mL에 조직을 넣 어 호모겐아이저 (Pro 200, Pro Scientific Co., USA)로 균 질화하였다. 원심분리 (4°C, 6000 rpm, 5분)하여 얻은 상 층액의 10 μL를 각각 Reaction mixture A (125 mM NaCl, 75 mM KCl, 7.5 mM MgCl₂, 5 mM Na₂ATP, 100 mM Imidazole- Hcl buffer, pH 7.6)와 Reaction mixture B (mixture A+10 mM ouabain)의 200 μL와 혼합하여 37°C에서 30분 간 반응시킨 후, 30% trichloroacetic acid 50 μL를 넣어 반 응을 중지시켰다. NKA 측정을 위한 모든 시약은 Sigma (USA) 제품을 사용하였다. Ouabain 유무에 따른 무기인 함량은 Phosphate Colorimetric Assay Kit (BioVision, USA) 를 사용하여 650 nm에서 측정하였으며, 조직내 단백질 함량은 Pierce BCA Protein kit (Thermo, USA)로 측정하 였다. 최종 NKA 활성은 μmol Pi mg^-1 protein h-1로 나타 내었다.

5.아가미의 조직학적 관찰

10% 중성포르말린에 고정된 아가미 조직은 상법에 따 라 파라핀으로 포매하여 5 μm 두께로 절편한 후, haematoxylin- eosin으로 염색하여 광학현미경 (Axioskop 2 plus: Carl Zeiss, Jena, Germany)과 화상분석시스템(AxioVision Rel., ver 4.6, Germany)으로 관찰하였다.

6.통계 분석

실험결과의 자료값은 평균±표준오차로 나타내었으 며, SPSS 통계프로그램 (ver. 17.0)을 사용하여 one way- ANOVA 및 Duncan’s multiple range test로 유의성을 검 정하였다(P<0.05).

결 과

1.혈장 암모니아 농도

조피볼락의 혈장 암모니아 농도는 외부의 암모니아가 증가함에 따라 높아지는 것으로 나타났으나, 4 mg L^-1구 와 8 mg L^-1구에서는 유의한 차이가 없었다(Fig. 1).

2.아가미 NKA 활성

조피볼락 NKA 활성은 모든 실험구가 대조구보다 유 의하게 높았으며, 실험구의 암노니아 농도가 높아질수록 아가미 NKA 활성 또한 증가하는 경향을 보였다. 특히 4 및 8 mg L^-1구의 NKA 활성은 대조구보다 약 50% 높았 다(Fig. 2).

3.혈장 Na+, K+, Cl- 및 삼투질농도

조피볼락의 혈장 Na⁺ 및 K⁺은 1 및 2 mg L^-1구에서는 대조구와 차이를 보이지 않았으나, 4 및 8 mg L^-1구는 다 른 실험구에 비하여 유의하게 높았다. 그러나 Cl^-는 모든 실험구에서 차이를 보이지 않았다. 삼투질의 농도의 경 우, Na⁺ 및 K⁺와 동일한 변화를 보였다(Table 2).

4.혈장 코티졸 및 글루코스 농도

암모니아 노출에 따른 조피볼락의 혈장 코티졸 및 글 루코스는 Fig. 3에 나타내었다. 코티졸의 경우, 1 mg L^-1 구는 대조구에 비해 3배, 2 mg L^-1구는 4배, 4 mg L^-1구 는 5.2배, 8 mg L^-1구는 6.6배 높은 것으로 나타났다. 혈 장 글루코스 또한 실험구 암모니아 농도에 대하여 그 변 화가 코티졸과 유사한 것으로 나타났다.

5.Ht

조피볼락의 Ht는 대조구 및 1, 2 mg L^-1구에서는 32.8 ±28~34.8±1.3%로 서로간 유의한 차이가 없었으나, 4, 8 mg L^-1구에서는 각각 42.3±1.2%, 43.0±1.0%로 나머 지 실험구보다 유의하게 높았다(Fig. 4).

6.아가미의 조직학적 변화

암모니아에 따른 조피볼락 아가미의 조직학적 변화는 Fig. 5 및 Table 3에 나타내었다. 1 mg L^-1구에서는 대조 구(Fig. 5A)와 마찬가지로 정상적인 아가미의 형태가 유 지되고 있었으나, 새변에서는 상피세포의 과증식(epithelial hyperplasia)이 관찰되었다(Fig. 5B). 2 mg L^-1구에서는 상피세포 과증식과 더불어, 2차새변의 끝이 비대해지는 곤봉화 (club-shaped lamella) 현상이 나타났다 (Fig. 5C). 4 및 8 mg L^-1구에서는 대부분 2차새변의 상피가 분리되 어 부종이 형성되었으며, 또한 괴사된 상피세포가 상당 수 관찰되었다(Fig. 5D).

고 찰

일반적으로 담수어와 해수어의 암모니아 배출 메커니 즘은 구분된다. 담수어에서는 첫째 체내의 NH₃는 아가미 상피에서 수동확산에 의해 직접수중으로 빠져나가며, 둘 째 아가미에서 나온 NH₃와 H⁺가 아가미와 접한 물(gill water)에서 NH₄⁺가 되어 수수중(Bulk water)으로 배출된 다. 조피볼락과 같은 해수어는 어체의 NH₃를 아가미 상 피세포와 상피세포사이의 밀착연접을 통해 수동확산으 로 배출하며, 또한 NH₄⁺는 상피세포 밀착연접을 통한 확 산뿐만 아니라 상피에서 2가지의 능동수송에 의해 배출 된다. 첫째 혈액내 NH₄⁺는 Na⁺/K⁺-ATPase (NKA)에 의 해 K⁺ 대신 상피로 이동하게 되며, 둘째 상피로 들어온 NH₄⁺는 Na⁺/NH₄⁺-교환체에 수중으로 배출된다 (Wilkie 2002). 어류는 이러한 메커니즘을 통해 체내의 암모니아 를 배출하는데, 외부 환경의 암모니아 농도가 어체보다 높을 경우, 수중의 암모니아가 확산으로 인해 체내로 유 입되어 체내의 암모니아 배출은 능동적인 수송에 의존 할 수밖에 없는 상태가 된다. 본 연구에서는 외부의 암 모니아 농도가 높아질수록 실험어의 혈중 암모니아는 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 4 및 8 mg L^-1구의 혈 중 암모니아 농도가 각각 1950 μg dL^-1, 2140 μg dL^-1로 큰 차이가 없었는데, 이는 혈액내 암모니아가 수용될 수 있는 양 (대략 2000 μg dL^-1)이 정해져 있음을 알 수 있 다. 혈중 암모니아의 증가는 외부에서 유입되는 암모니 아 양이 능동 수송으로 배출하는 양보다 많기 때문인 것 으로 보인다. 본 연구에서 암모니아의 능동 배출은 NKA 활성을 통해 알 수 있는데, NKA 활성 증가는 체내의 암 모니아 농도가 대조구의 수준을 넘어서는 시점부터 나타 난 것으로 보여 지며, 체내의 암모니아 농도가 높아질수 록 NKA 활성의 증가가 높아지는 것은 체내의 암모니아 농도를 감소시키기 위한 생리적 반응으로 보인다. 이처 럼 외부의 암모니아가 높을수록 NKA 활성의 증가는 여 러 경골어류에서 보고되고 있다 (Alam and Frankel 2006; Chew et al. 2014).

본 연구에서 암모니아 노출에 따른 혈장 이온 및 삼투 질농도를 조사한 결과, Na⁺의 경우 4 및 8 mg L^-1구에서 는 대조구 및 1, 2 mg L^-1구 보다 상승하였는데, 이러한 이유는 다음과 같이 추정된다. 첫째 체내의 암모니아가 높아질수록 능동 배출이 많아지는데, 이때 Na⁺/NH₄⁺-교 환체를 통해 Na⁺의 유입이 많아졌기 때문일 수 있으며, 둘째 실제로 4 및 8 mg L^-1구에서 아가미의 상피 분리 및 괴사가 되는 등 손상이 나타나 Na⁺의 배출에 장애가 발생하였기 때문으로도 볼 수 있다. 본 연구와는 반대로 터봇을 고농도 암모니아에 노출하였을 때 혈장 Na⁺가 오히려 감소하는 결과가 나타났으며, 이에 대하여 저자 들은 외부에 고농도의 NH₄⁺가 존재할 때 Na⁺/NH₄⁺-교 환체가 Na⁺를 유입하지 못하고 다시 NH₄⁺ 유입되기 때 문이라고 설명하고 있다 (Person-Le Ruyet 2003). 이러한 가능성들을 고려해 보면, 본 연구에서는 모든 실험구에 서 암모니아 노출 3시간 이전에 이미 Na⁺의 감소가 나 타났으며, 이후에 고농도일수록 아가미 손상이 빠르게 진행되어 삼투압 장애가 일어났을 가능성도 배제할 수 는 없다. 혈장 K⁺의 경우 4 및 8 mg L^-1구가 1 및 2mg L^-1구보다 농도가 높은 이유는 체내의 NH₄⁺를 배출하 기 위하여 4 및 8 mg L^-1구에서 아가미 NKA의 활성이 더 높아져 이로 인해 혈액의 K⁺ 대신 NH₄⁺를 상피세포 로 유입시켜 혈액내 K⁺가 상대적으로 많아졌기 때문인 것으로 해석해 볼 수 있다.

코티졸은 시상하부-뇌하수체-간신선 축에서 생성되는 호르몬으로 스트레스 반응 뿐만 아니라 삼투압조절 및 에너지 대사에 있어 중추적인 역할을 한다 (Wendelaar Bonga 1997; McCormick 2001). 본 연구에서는 모든 실험 구에서 코티졸 농도가 증가하였는데, 이처럼 고농도 암모 니아 노출에 따른 코티졸 증가는 연어과 어류를 비롯한 여러 어종에서도 보고되고 있다 (Ortega et al. 2005; Tsui et al. 2009; Wood and Nawata 2011). Ortega et al. (2005) 는 고농도 암모니아에 노출된 무지개송어(Oncorhynchus mykiss)에서 혈장 코티졸과 암모니아 농도는 선형관계에 있다고 하였는데, 본 연구에서도 혈장 암모니아가 높아 질수록 혈장 코티졸이 상승하는 선형의 관계를 확인할 수 있었다(Fig. 6).

스트레스 반응에 의한 코티졸은 당신생합성(gluconeogenesis) 을 중재하는 역할을 하며, 이로 인한 혈중 글루 코스의 상승은 스트레스로 인해 상승된 에너지 요구량 을 보충하는 것으로 알려져 있다(Vijayan et al. 1997). 여 러 스트레스 요인에 대한 혈장 코티졸 및 글루코스의 동반상승은 이미 많은 어종에서 보고된 바 있으며 (Barton and Schreck 1987; Robertson et al. 1988; Olsen et al. 1995), 본 연구에서도 암모니아 노출시 이들의 동반상승 이 뚜렷하게 나타났다.

일반적으로 혈액학적 parameters (Ht, Hb 및 백혈구수 등)의 변화는 스트레스의 2차적 반응으로 나타난다(Barton and Iwama 1991). Ht는 혈중의 적혈구 용적을 나타 내며 어종에 따라 매우 다르게 나타난다. 본 연구에서는 암모니아 노출시 혈장 코티졸 및 글루코스의 상승을 고 려해볼 때, Ht의 상승 또한 예상해 볼 수 있었으나, 4 및 8 mg L^-1구에서만 상승이 나타났다. 대서양 연어에서도 암모니아 노출시 Ht의 상승이 나타나고 있지만 (Fivelstad et al. 1993), darkbarbel catfish (Pelteobagrus vachelli) 에서는 암모니아 노출에 따른 Ht 변화는 없었으며 (Li et al. 2014), 또한 대서양 연어에서는 오히려 고농도에서 Ht이 감소한다고 나타나고 보고된 바 있다 (Knoph and Thorud 1996). 따라서 암모니아 노출에 따른 Ht 변화는 어종에 따라 다르게 나타나며, 심지어 같은 어종이라도 크기, 수온, 염분 등에 따라 달라질 수 있으므로, 아직까 지 암모니아에 대한 스트레스 지표로 Ht를 사용하기에 는 다소 어려움이 있는 것으로 보인다.

이상의 결과를 종합해 보면, 수중의 고농도 암모니아 는 확산에 의해 단시간내에 어체로 유입되며, 체내의 암 모니아 농도가 높아질수록 어체는 아가미 NKA 활성을 높여 암모니아를 수중으로 배출하는 것으로 나타났다. 그러나 외부의 고농도 암모니아가 지속될 경우, 유입되 는 암모니아 양이 배출되는 암모니아 보다 많아지게 되 어 최종적으로 체내의 암모니아 축적이 발생되며, 이는 어체의 스트레스를 유발하는 요인으로 추정된다.

적 요

본 연구에서는 암모니아 노출에 따른 조피볼락의 생리 학적 반응을 조사하고자 아가미 Na⁺/K⁺-ATPase (NKA) 활성을 비롯한 혈장 parameters를 분석하였다. 실험구의 암모니아 농도는 대조구(자연해수), 1, 2, 4, 8 mg L^-1였으 며, 조피볼락을 각각의 실험구에 3시간동안 노출한 다음 혈액 및 아가미 조직을 샘플링하였다. 실험구의 암모니 아 농도가 높아질수록 혈장 암모니아 농도가 증가하였 으며, 아가미 NKA 활성 또한 증가하는 경향을 보였다.

혈장 Cl^-를 제외한 외부의 암모니아 영향을 받지 않았 으나, 4, 8 mg L^-1구의 Na⁺, K⁺ 및 삼투질농도는 대조구 및 1, 2 mg L^-1구보다 유의하게 높았다. 암모니아 노출에 따른 조피볼락의 혈장 코티졸은 암모니아 농도와 선형 관계를 보였으며, 혈장 글루코스 또한 코티졸과 동반상 승하는 것으로 나타났다. 1, 2 mg L^-1구의 hematocrit는 대조구와 차이를 보이지 않았으나, 4, 8 mg L^-1구는 나머 지 실험구보다 유의하게 높았다. 암모니아 농도가 높을 수록 아가미 조직 손상은 심하였으며, 특히 4, 8 mg L^-1 구에서는 상피세포의 과증식, 분리, 괴사 및 2차새변의 곤봉화(club-shaped lamella) 현상이 관찰되었다.