Journal 
서 론
산업화 및 인간생활의 편의를 위해 개발 및 사용되는 다양한 화학물질들이 환경에 노출되어짐에 따라 인간 및 야생동물의 체내 및 내분비계에 직, 간접적으로 많은 영 향을 미친다. Bisphenol A (BPA)는 캔의 코팅재료인 에폭 시 (epoxy), 음식용기 및 포장재로 쓰이는 폴리카보네이 트 (polycarbonate) 등의 플라스틱 제조의 원료로 사용되 며, 화장품의 항균제 및 곰팡이 제거제, 젖병 및 치과치 료용 봉합제로 사용된다 (Brotons 1995; Tyl et al. 2002). BPA는 에스트로겐성 화합물로서 내분비계장애물질(Endocrine Disruptor Chemicals, EDCs)로 분류되며 에스트로 겐 수용체에 대한 친화도가 높아 에스트로겐 수용체와의 결합을 통해 생체 내 에스트로겐과 유사한 생리학적 효 과를 일으켜서 체내 내분기계 기관의 생리 작용을 교란 시킨다는 보고가 있다. 특히 BPA의 노출에 따른 계속된 축적은 수컷 생식기계(reproductive system)의 여성화, 조 기성숙 및 암컷의 조기 사춘기 도래 등을 일으킨다(Herman- Giddens et al. 1997; Paulozzi et al. 1997; Howdeshell et al. 1999). 우리나라 해양환경에서의 BPA 오염에 관한 연구 자료로 해양으로 유입되는 하천에 가까운 지점에서 BPA 농도가 높게 나타났으며 마산만에서 2.7~50.3 ng g-1 dry wt.의 농도가 조사되었으며, 광양만과 여수해만에서 는 0.46~24.59 ng g-1 dry wt.가 조사되었다(Khim et al. 1999; Cho et al. 2004).
Glutathione S-transferase (GST)는 다양한 기능을 가진 단백질로서 모든 생물체에서 발견된다(Smith et al. 2004). GST는 비생체물질 (xenobiotic), 중금속 (heavy metal), 병 원체(pathogen) 및 산화스트레스(oxidative stress) 등을 포 함한 생물 및 비 생물적 스트레스로부터 세포를 보호하 는 기능을 가진다 (Kampranis et al. 2000; Mueller et al. 2000; Agrawal et al. 2002). GST는 해양환경에서의 지표 유전자로서 방향족탄화수소류(polycyclic aromatic hydrocarbos, PAHS), 에스트로겐성 화합물 및 중금속 등의 노 출에 따른 산화스트레스와 GST와의 상관관계에 대한 연 구에 많은 관심을 가지며 진행하고 있다(Koutsogiannaki et al. 2014; Luchmann et al. 2014; Zhang et al. 2014).
시험생물로서의 성게는 다른 시험생물에 비해 실험실 에서 생식세포의 획득 및 인공수정을 통한 배아생성이 가능하고, 배양기에서의 배양이 가능하여 배아의 발달을 쉽게 관찰할 수 있다. 이러한 시험생물로서 성게의 특징 은 발생학 및 환경 독성학 연구의 시험생물로서 장점이 기 때문에 연구에 많이 사용된다 (Kobayashi 1973, 1977, 1981; Greenwood 1983; Monroy 1986; Wui et al. 1992; Davidson et al. 1998; Yu 1998; Hwang et al. 2012).
본 연구는 BPA의 오염이 해양생태계에 미치는 영향 을 말똥성게(Hemicentrotus pulcherrimus)를 이용하여 정 상적인 수정률 및 배아 발생률을 이용하여 평가하며, 또 한 생체지표유전자로서 GST 유전자를 선택하여 GST의 상대적인 발현 양상을 관찰하여 평가하고자 한다.
재료 및 방법
1.시험생물
시험생물 말똥성게 (H. pulcherrimus)는 2014년 3월에 전라북도 부안군에 위치한 격포리 인근 해안에서 채집 하였다. 채집한 시험생물은 저온상태에서 이송하여 본 연구소 해양생물배양실에서 1주간 순치한 후에 평가연 구에 사용하였다. 시험생물을 수용한 수조환경 및 수온 은 자연채광 상태의 유수식 환경이며 9±1°C의 온도를 설정하였다.
2.생식세포 수집
말똥성게 (H. pulcherrimus)의 표면을 멸균해수로 세척 하여 성게표면의 이물질을 제거한 후, 실험에 이용하였 다. 성게는 암컷 및 수컷 각 6개체로 크기는 대략 직경 3.5 cm 이상을 선별하여 사용하였다. 배양액은 자연해수 를 membrane filter (pore size 0.45 μm)로 여과한 후에 멸 균하여 사용하였다. 생식세포의 방란 및 방정 유도는 성 게의 체강 내에 0.5 M KCl 용액 1mL을 주입시킨 후, 배 양액이 담긴 100 mL 용량의 비이커에 성게를 담궜다. 이 때 생식공은 배양액에 충분히 잠기게 하였다. 수집한 생 식세포 중에서 정자는 1회, 난자는 3회 세정한 후에 실 험에 이용하였다.
3.BPA 노출
BPA(Bisphenol A; 4,4′-isopropylidenediphenol)는 Sigma (St. Louis, MO) 제품을 사용하였으며, 멸균해수를 이용하 여 stock solution (1 ppm)을 준비하여 사용하였다. 말똥성 게(H. pulcherrimus)의 정상적인 수정률 및 배아 발생률 을 조사하기 위한 실험 농도는 각각 BPA 농도 (0, 300, 500, 800, 1000, 1500 ppb)로 설정하여 노출시켰다.
4.배양조건
인공수정을 통해 생성시킨 수정란은 배양액 1 mL에 수정란을 대략 1,500개 정도를 넣었으며, 배양액의 pH 는 7.8~8.2, 배양 온도는 16±0.5°C를 설정하였다. 배양 의 상태는 Table 1에 명시하였다.
5.수정 및 배아발생 관찰
각각의 BPA 농도에 30분간 노출시킨 정자와 정상 난 자를 인공수정을 시켰다. 인공수정 10분 경과 후 수정률 을 관찰하였으며, 배아발생은 인공수정 후 pluteus 유생 시기인 64시간째에 관찰하였다 (Pagono et al. 1985a, b) (Fig. 1).
6.Total RNA 추출 및 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR)
대조구 및 각 실험구의 수정 후 64시간째인 pluteus 유 생을 RNAiso Plus (TaKaRa Co.)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출 방법은 제조사의 방법에 따라 시행하 였다. 추출한 total RNA는 spectrophotometer (NanoVue, GE Healthcare)를 이용하여 정량 하였다. cDNA합성을 위 한 역전사 반응(Reverse Transcription, RT)은 1 μg의 total RNA, oligodT18 (0.5 μg)와 AccuPower RT premix (Bioneer Co.)를 이용하여 최종 반응용액 20 μL로 42°C에서 1시간 시행하였다. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 RT를 통해 얻은 cDNA 1 μL와 GST프라이머 forward (5′-TTCGTGGCTGAGGTATTTGC-3′), reverse (5′-TTGATATTTCCTTGCCGCAG-3′) SpZ12-1 프라이머 forward (5′-AAAATGACACAGGCGATGGA-3′), reverse (5′-TAATGTTTCTCGCTCCCCCT-3′) 및 AccuPower HotStart PCR premix (Bioneer Co.)를 이용하여 최종 반응 용액 20 μL로 시행하였다. GST의 PCR 반응조건은 95°C 30초, 60°C 30초, 72°C 30초를 28회 반복하였으며, internal control인 SpZ12-1의 PCR 반응조건은 95°C 30초, 60°C 30초, 72°C 30초를 25회 반복하였다. RT-PCR은 제조사 인 바이오니아의 방법에 따라 시행하였다. RT-PCR 산물 은 2% 아가로즈겔 전기영동을 통해 확인하였으며 band intensity는 Gel Doc™ XR+ System (Bio-Rad)을 이용하여 분석하였다.
7.통계학적 분석
모든 실험은 100개 이상의 배아를 3회 반복 계수하여, 전체배아에서 정상배아 수의 백분율을 산출하였으며, 이 런 실험과정을 3회 반복 실시하였다. 이러한 연구결과를 바탕으로 probit 통계법을 이용하여 반수영향농도 (50% Effective Concentration, EC50) 및 95% 신뢰구간(95% Confidence Limit, 95% Cl)을 분석하였다. 또한, Dunnett’s test 분석법을 이용하여 무영향농도 (No Observed Effective Concentration, NOEC)와 최소영향농도 (Lowest Observed Effective Concentration, LOEC)를 분석하였다. 연구결과 의 유의성 검정은 Student’s t-test로하였으며, p가 0.05 이 하인 것을 유의한 것으로 결정하였다.
결 과
1.BPA 처리와 수정율의 변화
정상 난자와 각각의 BPA (0, 300, 500, 800, 1000, 1500 ppb) 농도에 노출된 정자와의 인공수정 시 수정률은 정 자에 처리한 BPA의 처리 농도에 따른 유의적인 차이가 나타나지 않았다(Fig. 2).
2.BPA 처리와 정상 배아 발생율
정상 난자와 각각의 BPA (0, 300, 500, 800, 1000, 1500 ppb) 농도에 노출된 정자와의 인공수정 시 pluteus 유생 시기에 나타난 정상적인 배아의 발생률은 대조군 및 각 각의 처리 농도군 300, 500, 800, 1000, 1500 ppb에서 각 각 95%, 94%, 92%, 84%, 63% 및 0%를 나타내었으며, BPA 처리농도가 높을수록 정상배아발생율은 유의적으로 낮아지는 경향을 나타냈다. 특히 1500 ppb의 고농도에서 는 모든 배아가 치사하였다 (Fig. 3). BPA를 처리한 후 배아의 발생에서 특이한 점은 고농도의 BPA에 노출된 배아에서의 발생이 대조구나 저농도에 비해 느려지는 현 상이 발견되었다. 800 및 1000 ppb 농도에서는 pluteus 유 생의 전단계인 프리즘 단계의 배아가 존재하였다(Fig. 4).
3.수정 및 배아 발생률을 이용한 독성평가
정상배아 발생률은 BPA 농도 증가에 따라 표준독성반 응으로 잘 알려진 S자형 곡선을 나타냈다 (Fig. 5). 연구 결과를 바탕으로 말똥성게(H. pulcherrimus)의 배아 발생 률에 대한 BPA의 독성값을 살펴보면 EC50는 1056.1 ppb 를 나타냈고, EC50에 대한 95% Cl은 981.8~1163.9 ppb 를 나타냈다. 정상배아 발생률에 대한 NOEC는 500 ppb 로 나타났고, LOEC는 800 ppb로 나타났다(Table 2).
4.GST 유전자 발현
BPA에 노출된 말똥성게(H. pulcherrimus)의 pluteus 유 생에서의 GST 유전자의 발현은 대조구에 비해 농도가 높을수록 GST 유전자의 발현은 유의적으로 높게 발현되 었다. BPA 처리 농도간의 발현 양상은 300 ppb에서 1000 ppb 농도까지는 800 ppb에서 상대적으로 조금 낮은 발현 양상을 보였다. 1500 ppb에서는 300 ppb에서 1000 ppb 처 리 농도에 비해 높은 발현 양상을 보였다(Fig. 6).
고 찰
산업화와 도시화가 가속화 되면서 각종 화합물질이나 산업 및 생활 폐수의 연안유입이 증가하여 해양생태계를 오염시키고 있다. 특히, 폐놀계 화합물질은 해양생물의 내분비계를 교란하여 생물의 번식을 교란시킬 뿐만 아 니라 초기생활사 단계에 독성을 나타내어 생물자원의 감소를 초래하여 연안 생태계 파괴를 가중시킨다 (Kim 1997). BPA는 알킬-폐놀계 독성 화합물로서 발생, 생장 및 생식기관에 영향을 미치며 혈중 vitellogenin의 농도 증가 및 혈중 칼슘 농도의 변화를 유발하여 체내 내분비 기관의 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Yokota et al. 2000; Suzuki et al. 2003; Kim et al. 2005). BPA의 독성영향에 대한 여러 연구자들의 보고에 의하면 조류 (algae), 갑각류 (crustaceans) 및 어류에서는 급성 중간독 성이 나타나고, 박테리아에서는 약한 독성 및 양서류에 있어서는 매우 저독성으로 나타나며 LC50의 범위는 2.5 ~6900 ppm으로 보고되었다 (Groshart et al. 2001; Ozlem and Hatice 2008). 또한 담수 및 해수에 서식하는 녹조류 (Selenastrum copricornutum), 물벼룩 (Daphnia magna) 및 새우 등의 무척추동물과 어류 등에서의 LC50 범위는 1~ 20 ppm 정도로 나타나며 이 중에서 D. magna의 경우 3.9 ~20 ppm, S. copricornutum은 2.5~3.1 ppm으로 나타났다 (Staples et al. 1998; Staples et al. 2002; Ozlem and Hatice 2008).
따라서 BPA 오염이 해양생태계에 미치는 영향 및 서 식 생물에게 미치는 위해 정도의 판단에 관한 연구는 매 우 중요하다고 생각된다. 현재 전 세계적으로 해양생태 계의 위해성을 판단하기 위해 해양생물 종을 이용한 생 물 반응 연구가 최근 광범위하게 활발이 진행되고 있다. 성게는 생태독성학적 연구에 적합한 시험생물로서 많이 이용되고 있다 (Pagano et al. 1986). 본 연구에서는 성게 중에서 우리해역에 많이 서식하는 말똥성게 (H. pulcherrimus) 를 시험종으로 선정하였다.6
본 연구 결과 BPA에 노출시킨 정자와 노출시키지 않 은 난자와의 인공수정 시 수정률은 대조구와 비교하여 유의적인 차이가 나타나지 않았다(Fig. 2). 그러나 정상배 아 발생률은 BPA 농도가 높을수록 정상배아발생은 유의 적으로 낮아지는 결과를 나타냈다 (Fig. 3). 연구 결과 BPA는 성게 배아의 발생과정에 민감하게 반응하여 정 상적인 배아 발생을 저해시키는 것을 알 수 있다. 본 연 구 결과와 유사한 이전의 연구 보고는 성게(Paracentrotus lividus)를 이용한 연구 결과이다 (Ozlem and Hatice 2008). 말똥성게 (H. pulcherrimus)의 배아 발생률에 대한 BPA의 독성값은 EC50의 경우 1056.1 ppb를 나타냈고, EC50에 대한 95% Cl은 981.8~1163.9 ppb를 나타냈다. 배 아 발생률에 대한 NOEC는 ⁄500 ppb로 나타났고, LOEC 는 800 ppb로 나타났다 (Table 2). Ozlem과 Hatice (2008) 가 보고한 성게 (P. lividus)의 배아독성에서 EC50은 710 ppb, 95% Cl은 650~765 ppb를 보여주었다. Ozlem과 Hatice (2008)의 연구와 본 연구에서 BPA는 정상적인 배아 의 발생을 저해하는 동일한 결과를 보였으나 EC50과 같 은 독성치는 다르게 나타났다. 이와 같은 결과는 종의 차 이에서 기인한다고 볼 수 있으며 또한 BPA에 대한 민 감도와 반응이 개체발생시 변경하는 것으로 생각된다. 또 한 고농도의 BPA에 노출된 말똥성게(H. pulcherrimus)는 배아 발생이 지연되는 현상을 보였다. 이러한 현상은 미 성어 무지개송어 (Oncorhynchus mykiss)에서도 보고되었 는데 BPA에 노출된 무지개송어(O. mykiss) 난은 부화를 지연시키고, 성장을 억제시키는데 이와 같은 이유는 성 장자극 축 (somatotropic axis)이 초기 배아발생단계에서 BPA에 영향을 받기 때문으로 알려져 있다 (Aluru et al. 2010). 따라서 말똥성게 (H. pulcherrimus)의 배아도 초기 배아발생단계에서 성장자극 축이 BPA에 영향을 받아 발생이 지연되리라 생각된다. BPA는 수생생물의 항산화 방어와 산화 스트레스를 유도한다고 알려져 있으며 물 벼룩(D. magna)이 BPA에 노출되면 GST의 수준이 높아 지는 결과를 보인다 (Jemec et al. 2012). 본 연구 결과에 서 BPA 농도 300 ppb에서부터 GST 유전자의 유의적인 증가를 볼 수 있다. 따라서 BPA는 말똥성게(H. pulcherrimus) 유생에 산화 스트레스를 유발하고 이에 항산화방 어를 위해 체내 GST의 수준을 증가시키는 것으로 사료 된다. 이전 연구 보고에 의하면 방오도료로 많이 사용했 던 TBT (tributyltin chloride) 등의 내분비계장애물질이 해양생물에 노출되면 생체는 약물대사효소들에 의한 대 사과정을 통해 체외로 제거시키는데 이들 약물대사효소 들은 유해물질의 대사뿐만 아니라 활성산소종 (active oxygen species) 생산과 산화스트레스와도 관련이 있다는 보고가 있다 (Lemaire et al. 1994). 따라서 내분비계장애 물질의 위해성 평가 시에 GST와 약물대사와 관련된 효 소를 함께 평가하는 것이 필요하다고 생각된다.
본 연구결과 BPA가 연안 해역에 유입되어 말똥성게
(H. pulcherrimus)의 유생에게 미치는 최소영향농도 800 ppb를 초과할 경우 연안 생태계 내에 서식하는 다른 해 양생물의 서식 및 자손의 정상적인 생산에 있어서도 악 영향을 미칠 수 있으며, 이러한 환경의 개선이 이루어 지지 않으면 해양생태계내의 종 및 개체수의 감소를 초 래할 수 있다. 또한 해양생태계 위해성 평가의 시험생물 로 말똥성게 (H. pulcherrimus)는 유용하다고 판단되며, GST 유전자는 생체지표유전자로서 내분비계장애물질인 BPA의 오염정도를 판단하는 데 유용하게 이용할 수 있 다고 생각된다.
적 요
본 연구는 시험생물로서 말똥성게 (Hemicentrotus pulcherrimus) 를 이용하여 내분비계장애물질인 bisphenol A (BPA)의 독성 및 시험생물로서의 적합성 등을 조사하였 다. 말똥성게(H. pulcherrimus)의 수정 및 정상 배아발생 에 미치는 BPA의 독성을 보기 위하여 농도(0, 300, 500, 800, 1000, 1500 ppb)에서 조사하였다. BPA 노출 시 수정 률은 시험구간 내의 BPA 처리농도와 관계없이 유의적인 변화가 없었다. 정상 배아발생률은 BPA 농도가 높을수 록 유의적인 감소를 나타냈으며, 800 ppb 농도부터 유의 적인 감소를 보였다. 정상배아발생에 대한 독성값은 반 수영향농도 (EC50) 1056.1 ppb, 95% Cl 981.8~1163.9 ppb 로 나타났다. 또한 무영향농도 (NOEC)와 최소영향농도 (LOEC)는 500 ppb 및 800 ppb로 나타났다. BPA에 노출 된 배아는 농도가 증가함에 따라 발생이 정체되는 현상 이 나타났다. BPA에 노출된 pluteus 유생을 이용한 glutathione- S-transferase (GST) 유전자의 발현을 비교해본 결과 GST 유전자의 발현은 농도가 증가함에 따라 발현 이 증가하였다.
본 연구 결과, 말똥성게 (H. pulcherrimus)의 초기 배아 발생 과정 중 800 ppb 이상에서 독성을 나타냈으며 GST 유전자는 BPA 노출에 따른 위해성 평가에 생체지표유 전자로 유용하게 이용될 수 있다고 생각된다.
