서 론

능소화 (Campsis grandiflora K. Schum)는 능소화과 (Bignoniaceae) 에 속하는 낙엽활엽덩굴식물로 예로부터 담장에 주로 식재하였으며, 현대 도시환경에 효율적인 녹지공급 대 안인 벽면녹화에 이용되는 대표적인 식물이다 (Lee 2003; Ro et al. 2003). 줄기는 회갈색으로 5~10 m까지 자라며, 잎은 대생으로 5~13개의 소엽으로 된 우상복엽이다. 꽃은 가지 끝에 원추화서로 5~15개의 황홍색 꽃이 달린다 (Fig. 1A-C). 또한 전통적으로 꽃을 능소화 (凌霄花) 또는 자위화 (紫葳花), 잎과 줄기를 자위경엽 (紫葳莖葉), 뿌리는 자위근 (紫葳根)이 라 하며, 약용으로 순환계, 피부 및 부인과 질환에 주로 사용 되어 왔다 (Ahn 2003; Kang 2008). 능소화의 화학성분으로 는 terpenoids, steroids 등에 속하는 성분들이 확인되었으며, 생리활성연구로는 항산화, 항염증, 항혈전 등의 효과가 보고 되었다 (Jin et al. 2004; Kim et al. 2004; Cui et al. 2006).

그러나 최근 능소화 화분 표면의 갈고리 형태 돌기 및 꽃 에 함유된 독성 물질로 인하여 인체에 유해하다는 논란이 있는 실정이다. 특히, 화분이 안구에 들어가거나 생체로 섭취 할 경우 실명을 초래한다는 내용이 있어 이로 인한 유해성 논란이 부각되고 있다 (Park 2009; Jeong et al. 2010; Hwang 2014; Kim 2014; Woo 2014).

이에 본 연구는 능소화의 화분형태 관찰과 꽃, 잎, 줄기 부 위별 MeOH 추출물 및 밀선에서 채취한 화밀에 대한 RAW 264.7 대식세포에서의 세포독성을 조사하여 유해성 여부를 파악하고자 한다.

재료 및 방 법

1.실험재료

본 실험에 사용한 재료는 2014년 7월 경기도 남양주시 진 접읍에서 채집한 개체를 이용하여 수행하였으며, 증거표본 은 국립수목원 산림생물표본관 (KH)에 보관하였다.

2.화분 형태 관찰

능소화 화분은 완전히 개화한 통상화에서 약을 절취하여 Erdtman (1971)과 Radford et al. (1974)이 제안한 전형적인 초산분해 과정 (standard acetolysis method)을 다소 변형시킨 방법으로 처리하였다. 해부현미경하에서 약 (anther)을 절취 하여 1.5 mL conical tube에 넣은 후 acetolysis mixture (acetic anhydride : sulfuric acid=9 : 1)를 넣고 80°C에서 약 10분간 물에 중탕한 다음 1,500~1,600 rpm으로 10분간 원심분리시 키고 상등액을 제거한 후 glacial acetic acid로 2회, 증류수, 30%, 50%, 70% alcohol로 각 1회씩 세척 후 70% alcohol에 보관하였다.

주사전사현미경 (SEM) 관찰을 위하여 보관된 시료를 시료 대 (stub)에 소량 떨어뜨린 후 실온에서 완전히 건조시키고, 이온증착기 (ion sputter)를 이용하여 백금으로 이온 증착시킨 후 주사전사현미경으로 모양과 크기 (극축길이, 적도직경, 화 분 표벽)를 측정하고 사진촬영하였다. 화분형태의 기재에 사 용된 용어는 Erdtman (1971), Punt et al. (1993), 그리고 우리 말 용어는 Lee (1978)를 따랐다.

3.세포독성

1)추출 및 농축

식물체는 부위별로 세척 및 절단과정을 거친 뒤 음건하여 건조시료를 확보하였다. 확보된 시료를 70% MeOH를 이용 하여 24시간씩 3회 반복 상온침지추출 한 후, 추출액을 농축 및 동결건조하였다. 화밀은 밀선부위에서 채취하여 동결건 조 과정을 거친 후 실험에 사용하였다.

2)세포배양

세포배양은 RAW264.7 세포를 10% fetal bovine serum (FBS, Lonza), 100 U mL^-1 penicillin (Lonza), 100 mg mL^-1 streptomycin (Lonza)을 함유한 dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Lonza, Walkersville, MD, USA) 배지를 사용하여 5% CO₂가 공급되는 incubator에서 37°C로 배양하 였다.

3)MTT assay

세포독성은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, SIGMA, St, Louis, MO, USA)를 이용하여 측정하였다. RAW264.7 대식세포를 1.0×10⁵ cells welL^-1이 되도록 96 well plate에 분주하고 24시간 배양한 후, 농도 및 처리시간에 따른 세포독성을 파악하기 위하여 10, 20, 50, 100 μg mL^-1 농도로 처리하여 24, 48시간 배양하였다. 배양 후 MTT (5 mg mL^-1) 시약을 각 well에 20 μL 첨가하 여 4시간 동안 37°C incubator에서 반응시킨 후, MTT 시약 이 함유된 배지를 제거하였다. 각 well에 100 μL DMSO로 결정을 녹인 다음 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. Cell viability는 대조군에 대한 퍼센트로 표시하였다.

4)통계

모든 실험은 3회 반복 측정하였고, 그 결과는 평균 (mean) ±표준편차 (standard deviation: SD)로 나타냈으며 유의성 (P<0.05) 검증은 Student’s t-test 분석법을 이용하여 결정하 였다.

결 과

1.화분형태 특성

주사전자현미경을 이용하여 능소화의 화분을 관찰한 결과 화분립의 세포단위 (cell unit)는 단립 (monad)으로 나타났으 며, 극면 입상 (polar view)은 원형 (rounded) 또는 둥근삼각 형 (rounded triangular)이며, 적도면 입상 (equatorial view)은 아장구형 (subprolate)부터 과장구형 (perprolate)까지 다양하 게 관찰되었다.

극축면의 길이 (Polar axis length)는 25.6~47.8 μm로 그 범위가 넓었으며, 평균은 39.8 μm이고, 적도면의 직경 (Equatorial diameter)은 18.2~28.2 μm, 평균은 21.8 μm로 Erdtman (1951)의 구분에 의한 화분립의 크기는 중립에 해당하는 것 으로 나타났다. 화분립의 적도면 입상은 P/E의 비가 1.2~2.1 로서 아장구형부터 과장구형이지만 평균적으로는 1.8로 나 타나 주로 장구형 (prolate)인 것으로 관찰되었다 (Table 1, Fig. 1D, E). 화분립의 극성은 이극성으로 발아구는 삼구형 (3-colpate)이고, 화분립 표벽 (exine)의 무늬는 망상 (reticulate) 이며, 망강은 뚜렷한 편으로 망벽은 비교적 발달하였고, 외표피에 돌기의 형태는 나타나지 않았다 (Fig. 1D, E).

2.Cell viability

대식세포 (macrophage)는 동물 체내 모든 조직에 분포하며 인체 내 선천적인 면역반응을 담당하는 면역세포로서, 외부 로부터 침입하는 이물질이나 세균, 바이러스, 노화세포 등을 소화하는 식균작용 기능과 함께 다양한 염증매개물질들을 분비하여 초기 염증반응에서 핵심적인 역할을 한다 (Guo et al. 2008).

본 연구에서는 면역반응에 중요한 역할을 하는 대식세포 에 대해 능소화 부위별 (꽃, 잎, 줄기) 70% MeOH 추출물 및 밀선에서 채취한 화밀의 세포독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 능소화 추출물 및 화밀을 24, 48시간 동 안 농도별 (10, 20, 50, 100 μg mL^-1)로 RAW264.7 대식세포 에 처리한 후 MTT assay로 측정한 결과, 24시간 처리한 경 우 대조군의 세포생존율은 100.0±0.6%였고, 10, 20, 50, 100 μg mL^-1농도별 처리군의 세포생존율은 꽃 99.5±0.5, 100.5 ±0.7, 100.1±0.4, 100.4±0.7%, 잎 100.3±0.9, 100.6±0.7, 100.5±0.5, 99.9±0.4%, 줄기 100.1±0.5, 100.7±0.7, 100.5 ±0.6, 100.8±0.8%, 화밀 99.0±1.4, 99.9±0.9, 99.3±1.0, 99.8±0.5%로 각각 나타났다 (Fig. 2). 따라서 능소화 추출 물 및 화밀을 농도별로 24시간 처리하였을 때 모든 농도 에서 99.0% 이상의 세포생존율을 보여 세포독성은 나타나 지 않았다. 또한 48시간 처리한 경우 대조군의 세포생존율 은 100.0±0.6%였고, 10, 20, 50, 100 μg mL^-1 농도별 처리군 의 세포생존율은 꽃 98.6±0.4, 98.8±0.3, 99.0±0.4, 74.4± 7.4%, 잎 98.7±0.8, 99.5±0.9, 99.0±0.6, 70.4±7.9%, 줄기 98.8±1.3, 98.8±0.6, 99.3±1.3, 58.9±4.3%, 화밀 51.1±4.3, 34.2±5.1, 26.1±2.1, 26.5±1.3%로 각각 나타났다 (Fig. 3). 능소화 추출물 및 화밀을 농도별로 48시간 처리하였을 때 꽃, 잎, 줄기 추출물 100 μg mL^-1 농도에서 세포독성이 나타 났으며, 화밀의 경우 저농도인 10 μg mL^-1부터 농도의존적으 로 세포독성이 높아지는 것을 확인하였다.

고 찰

최근 능소화의 유해성에 대한 논란으로 대중들로부터 매 우 높은 관심을 받고 있다. 실제로 Jeong et al. (2010)의 도감 에서는 꽃가루에 갈고리와 같은 것이 있어 눈에 들어가지 않 도록 주의해야 한다는 내용이 기재되어 있다. 또한 최근 온라 인을 통해 능소화의 화분이 실명을 초래한다는 일부 논란이 있으나 본 연구에서 주사전자현미경을 이용한 화분 형태를 확인해 본 결과, 화분립 형태는 장구형이고 발아구의 형태는 3공구형이며 화분 표벽 (extine)은 망상의 형태이고 외부로 돌출된 돌기는 관찰되지 않았다. 그리고 Park et al. (2000)의 연구를 통해서도 능소화 화분의 표벽무늬는 망상이며 망강 과 망벽이 뚜렷하고 잘 발달되어있다고 언급하고 있으며, 표 벽을 자세히 관찰해 보면 외벽의 기저층 (foot layer) 부위에 작은 돌기가 분포하고 있을 뿐이다. 또한 능소화의 화분은 바람에 의해 멀리 퍼지기 어려운 형태를 가지며 실제로 능소 화속 식물의 수분매개는 주로 벌새 및 꿀벌, 뒤영벌류에 의 해 수분이 이루어지는 조매화 또는 충매화 (Bertin 1982)로 알려져 있다. 따라서 화분이 바람에 잘 날릴 가능성은 매우 낮으며, 화분립의 외표벽에 가시 혹은 갈고리 모양의 구조가 각막을 손상시킬 수 있다는 내용은 사실과 다르다.

또한 능소화 부위별 추출물 및 화밀을 24, 48시간 동안 농 도별 (10, 20, 50, 100 μg mL^-1)로 RAW264.7 대식세포에 처 리한 후 MTT assay로 세포독성을 측정하였다. 그 결과, 능소 화의 부위별 (꽃, 잎, 줄기) 70% MeOH 추출물을 각각 24시간 처리한 10, 20, 50, 100 μg mL^-1 및 48시간 처리한 10, 20, 50 μg mL^-1 구간에서는 98.6% 이상 세포생존율을 보여 추출물 로 인한 세포독성은 현저히 낮음을 확인하였다. 이는 감초 (Glycyrrhiza uralensis), 고삼 (Sophora flavescens), 백선피 (Dictamnus dasycarpus) 추출물보다 세포생존율이 높게 나 타났으며, 익모초 (Leonurus japonicus), 헛개나무 (Hovenia dulcis)와 유사한 결과를 보였다 (Kim et al. 2013; Han et al. 2014). 또한 Koo et al. (2010)은 중약대사전 등 31권의 본초 학 및 약초의 독성에 관한 기록이 있는 서적을 이용하여 능 소화를 포함한 29종류 활혈거어약의 독성에 관한 문헌적 고 찰을 수행한 결과, 능소화는 천궁 (Cnidium officinale), 현호 색 (Corydalis remota) 등 18종류의 유독약물에 포함되지 않 았다. 따라서 RAW264.7 대식세포에 대한 세포독성 실험 및 문헌조사에 근거한 능소화의 꽃, 잎, 줄기에 유해하거나 유 독한 요인은 나타나지 않았다. 단, 밀선에서 분비되는 화밀은 24시간 처리한 경우 세포독성은 나타나지 않았으나, 48시간 처리한 경우는 저농도 처리구인 10 μg mL^-1부터 농도의존적 으로 세포독성이 높아지는 것을 확인하였다. 이는 능소화 화 밀에 포함된 물질이 시간의 경과에 따라 세포사멸을 유발시 킨 것으로 판단된다. Adler (2000)은 능소화과 식물 중 Crescentia alata, Tabebuia rosea, Catalpa speciosa, Tabebuia rosea는 화밀에 phenolics, iridoid glycosides 등의 독성성분 이 존재한다고 보고하였다. 따라서 RAW264.7 대식세포에 대한 세포독성 및 근연속 식물 화밀에 독성물질이 존재하는 것으로 보아 능소화의 화밀에도 독성을 일으키는 성분이 함 유되었을 가능성이 있을 것으로 추정된다. 향후 능소화 화 밀을 이용한 추가적인 in vitro, in vivo 독성실험 및 독성물질 규명 등에 관한 연구가 필요하다고 판단된다.

적 요

본 연구는 능소화를 대상으로 화분형태 및 RAW264.7 대 식세포에서의 세포생존에 미치는 영향을 조사하여 유해성 여부를 파악하고자 한다. 주사전자현미경을 이용한 화분 형 태를 확인해 본 결과, 화분립 형태는 장구형이고 발아구의 형태는 3공구형이며 화분 표벽 (extine)은 망상의 형태이고 외부로 돌출된 돌기는 관찰되지 않았다. 능소화 70% MeOH 부위별 (꽃, 잎, 줄기) 추출물 및 화밀을 24, 48시간 동안 농도 별 (10, 20, 50, 100 μg mL^-1)로 RAW264.7 대식세포에 처리 한 후 MTT assay로 측정하였다. 그 결과, 능소화 추출물 및 화밀을 농도별로 24시간 처리하였을 때 모든 농도에서 99.0 % 이상의 세포생존율을 보여 세포독성은 나타나지 않았다. 48시간 처리하였을 때 꽃, 잎, 줄기 추출물은 50 μg mL^-1농도 이하에서 세포독성은 나타나지 않았으나, 화밀의 경우 저농 도인 10 μg mL^-1부터 농도의존적으로 세포독성이 높아지는 것을 확인하였다.