서 론

한약재를 비롯한 천연 생약재는 오래 전부터 질병치료 및 예방과 관련한 생리활성을 위해 연구되어 왔으며 과학적으 로 그 효능이 입증되고 있다. 천연 생약재에 존재하는 항균 성 물질들은 어류 양식 분야에서도 친환경 사료첨가제, 소독 제, 치료제로 활용할 수 있는 방안에 대해 활발히 연구 중이 다. 천연 생약재에 존재한 항균성 물질은 항생제나 합성 화 학 요법제에 비해 식품에 대한 안정성이 높으며 내성균 출 현의 우려가 적은 장점이 있다 (Cho et al. 2003). 최근 건강 관리에 대한 관심이 높아지고 있는 국민적 정서를 고려하면 항생제나 화학적 제제를 대체할 수 있는 천연 약재에 대한 연구와 개발이 요구되고 있다. 천연 생약재의 어류 질병 세 균에 대한 항균력에 관한 연구는 쑥 정유의 항균력에 관한 검색이 처음이며 (Kim et al. 1994), 구기자 분말 투여가 백신 처리에 미치는 효과 (Kwon et al. 1999), 녹차 추출물 (Park et al. 1999), 천연식물 및 망태버섯의 추출물 (Jo and Kim 2002) 등의 천연 생약재의 어류 질병 세균에 대한 항균력에 관한 연구들이 있다. 오배자와 관련된 연구는 오배자를 비롯한 생 약재 48종에 대한 열수 및 알코올 추출물로부터 어류질병 세균 19종에 대한 항균력을 조사하여 그중 오배자가 항균력 이 가장 광범위하고 높다고 보고된 바 있다 (Choi 2003).

오배자는 매미목의 진딧물과의 곤충인 오배자 면충이 야 산에 기생하는 붉나무의 새잎에 기생함으로써 형성된 충영 으로 일본, 중국과 함께 우리나라 각지에 분포하며, 주성분 인 탄닌의 수렴작용에 의하여 지사, 지혈, 해독, 항균, 항 바 이러스 및 항진균 등의 효력을 가지고 있다고 알려져 있으 며 설사, 대장염, 이질, 위장출혈, 혈변, 구내염 등의 치료제로 사용하고 있다 (Kim et al. 2008).

메기는 국내의 내수면 양식어류로서 그 생산량 및 소비가 1990년 이후 꾸준히 증가하여 주요 양식대상품종으로 알려 져 있다. 본 연구는 오배자의 추출물을 양식 메기의 사료에 첨가하여 일정기간 투여한 후 성장 및 비특이적으로 나타나 는 면역 반응을 조사하고, 메기에 표피박리를 일으키는 원인 균인 Aeromonas veronii균의 공격실험을 통해 그 효능을 확 인하고자 하였다.

재료 및 방 법

1.시험어

시험어는 전북에 소재하는 메기 양어장에서 사육 중이던 건강한 어류를 연구소로 이동하여 사용하였다. 이동된 어류 들은 폭 80 cm, 길이 3 m의 유수식 수조 2개에 시험구와 대 조구를 설정하여 한 수조당 100마리씩을 (평균무게 71.66± 10 g) 수용하였다. 수용된 어류들은 1주일간 먹이에 대한 순 치를 실시한 후, 오배자 추출물의 투여를 실시하였다.

2.실험용 사료의 제작 및 투여 방법

실험에 이용한 오배자 추출물은 오배자 1 kg, 감초 15 g, 물 30 L를 넣고 끓인 후 고압가온 (110~140°C)하여 3시간 경과 후 1/5 비율로 만들어 최종 6,000 mL로 만들었다. 이것 을 밀봉파우치로 제작 (100 mL, 60봉지)하여 사료 12 kg당 100 mL (1봉지)씩 혼합하여 사료를 제조하였다. 추출물의 사 료에 대한 첨가 비율은 0.05% 비율로 사전 예비실험의 결과 로 판단하였다.

대조구는 추출물을 첨가하지 않은 사료를 공급하였으며 각각 제조된 사료는 매일 일정한 분량을 1회에 공급하였다. 시험기간 중 어류의 성장에 따라 공급하는 사료의 양을 증 가시켜 주었다.

3.성장 및 혈액성분의 변화

시험구별 어체의 성장을 조사하기 위해 시험개시, 2주, 4주 및 8주차에 시험구와 대조구에서 각각 10마리씩을 무작위로 선택하여 체중 및 길이를 측정하였다. 또한 시험어의 생리적 변화를 조사하기 위하여 어류를 MS-222 (Sigma Co.)로 마취 시킨 후 혈액을 채취하였다. 혈액의 채취는 일회용 주사기로 어체의 꼬리부분의 정맥으로부터 1 mL 전후의 양을 취하였 다. 채취된 혈액 중 100 μL는 항응고제 (10% EDTA)를 처리 한 후, 20시간 이내에 적혈구용적률 (Hematocrit, Hct)과 혈색 소함량 (Hemoglobin, Hb)의 분석에 사용하였다. 나머지의 혈 액은 60분간 실온에 방치한 후 4°C에서 1시간 정도 두어 혈 병을 수축시킨 다음 4°C 원심분리기 (8,000 rpm, 15분)를 이 용하여 혈청을 분리하였다. 혈청을 냉동보관 (-80°C)하였다 가 3일 이내에 혈액화학분석기 (FUJI DRY CHEM3500i)를 사용하여 혈액 생화학적 변화를 측정하였다. Hematocrit의 측정은 micro-hematocrit법으로, Hemoblobin은 Cyanomet haemoglobin법으로 측정하였다. 혈청의 생화학적 성분인 혈당 (GLU, glucose), GOT (glutamate oxaloacetate transaminase), GPT (glutamate pyruvate transaminase), 총콜레스테 롤 (TCHO, total cholesterol), 총단백질 (TP, total protein) 5개 항목을 측정하였다.

4.조직학적 검사

실험어의 조직학적 검사를 위하여 시험구 및 대조구의 시 험어로부터 채혈시기와 맞추어 2, 4 그리고 8주에 각 5마리 씩 채혈 후 해부하여 간, 비장 및 신장 조직을 채취하였다. 각 조직은 10% 중성완충포르말린에 24시간 전고정한 후 세 절하여 후고정 (12~24시간)하였다. 조직표본제작을 위한 파 라핀블럭은 고정된 조직을 수세하여 단계별로 제조된 알콜 계열을 (100~60%) 통과시켜 탈수한 후, Xylene을 사용하여 투명화하였다. 이를 다시 파라핀 침투과정을 거친 다음 포매 를 실시하였다. 파라핀 절편은 Rotary type 마이크로톰을 이 용하여 4 μm 두께로 박절하여 조직절편을 만들었으며 이를 Hematoxyline and Eosin (H&E) 염색을 실시하여 광학현미 경하에서 관찰하였다.

5.Lysozyme 활성

Lysozyme activity 시험은 혈청, 조직, 체표 점액을 사용하 여 Parry et al. (1965)의 turbidimetric method에 준하여 실시 하였다. 실험용 균액은 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 6.2)에 그람 양성 세균인 Micrococcus lysodeikticus (Sigma Co.)을 0.2 mg mL^-1의 농도로 현탁시켜 사용하였다.

어류의 혈청을 10배 희석하여 96 well microplate에 100 μL씩 분주 한 후 곧바로 Micrococcus lysodeikticus (Sigma Co.)의 현탁액 100 μL를 혼합하여 마이크로 플레이트 리더 (microplate reader)기에서 37°C에서 5분 및 30분간 600 nm 에서 측정하여 흡광도의 감소율을 측정하였다.

신장 및 비장의 lysozyme activity는 상기의 방법을 약간 변형하여 분석하였다.

0.1 g의 조직을 10배량의 0.05 mM sodium phosphate buffer (pH 6.2)로 충분히 균질화한 후, 원심분리 (12,000 rpm, 4°C, 10 min)하여 상등액을 얻은 후, 상등액을 흡광도 600 nm에서 O.D 1.0으로 보정하여 상기와 같은 방법으로 측정 하였다.

체표 점액의 경우 실험어를 Kim et al. (1992)의 방법에 따 라 체표점액을 취한 후 채취된 시료에 5배량의 0.05 mM sodium phosphate buffer (pH 6.2)를 첨가하여 균질화한 후 원 심분리 (12,000 rpm, 4°C, 20 min)한 다음, 상층액을 용균 활 성 측정용 시료로 사용하였다. 체표점액의 lysozyme activity 는 Takahashi et al. (1986)의 방법에 따라 상기와 같은 방법 으로 5배로 희석한 점액시료 100 μL에 현탁한 Micrococcus lysodeikticus (Sigma Co.)균액 100 μL를 첨가하여 37°C에서 5분 및 30분간 반응시킨 후 600 nm에서 흡광도의 감소량을 측정하였다.

6.Aeromonas veronii에 대한 저항성

생약재의 투여에 따른 어류병원성 세균에 대한 저항성 을 확인하기 위하여 메기에 주로 발생하는 병원성 세균인 Aeromonas veronii 균주를 사용한 공격실험을 실시하였다.

분리된 균주는 Aeromonas veronii에 감염되어 폐사된 메 기로부터 분리된 균주였으며 TSA 평판배지에서 25°C, 48시 간 배양하였다. 배양된 균을 주사하기 전에 멸균생리식염수 를 이용하여 평판배지 위의 세균을 모아 10 mg mL^-1의 농 도로 원액을 만들어 준 뒤 이를 멸균생리식염수에 희석하여 6.5×10⁷ cfu mL^-1로 부유시킨 균액을 0.1 mL씩 근육에 주사 한 다음, 2주간 생존율을 조사하였다.

결 과

1.성장 및 혈액성분의 변화

8주간 오배자를 투여한 시험구와 일반사료만 먹인 대조구 간의 성장도를 비교한 결과, 4주째까지는 성장에 큰 유의차 가 없었으나, 8주째에 시험구가 대조구에 비해 유의적인 차 이를 나타내었다 ( Fig .1).

또한 시험구 및 대조구의 혈액성분에 있어서의 변화를 분 석한 결과, Hemoglobin (HB)은 시험구와 대조구 간의 큰 유 의적인 차이는 나타내지 않았으나 Hematocrit (Ht) 수치는 시험구가 대조구에 비해 높게 나타났다. 수치의 차이는 오 배자 추출물 투여 8주 후에 높게 나타났다. Total cholesterol (TCHO)와 Triglyceride (TG)는 2주차에는 시험구가 대조구 보다 높게 나타났지만 4주차에는 감소하는 경향을 보였으며 8주차에 다시 높게 나타났다. Glucose (GLU)는 대조구가 2 주차, 4주차에 월등히 높은 값을 나타내었으나 8주차에 대조 구와 시험구가 비슷한 값을 나타내었다. Total Protein (TP)은 시험기간 중 큰 차이 없이 비슷한 값을 나타내었으며 간의 기능과 관련 있는 GOT, GPT의 경우 시험구에서 약간 높은 값을 보이고 있었다 (Table 1).

2.조직학적 검사

시험구 및 대조구의 2, 4 그리고 8주째의 조직표본을 관찰 한 결과, 간, 비장 그리고 신장 조직의 변성이 시험구와 대조 구의 뚜렷한 차이나 변화가 없는 것으로 나타났다. 또한 8주 째 시험구의 간 조직은 대조구보다 세포의 크기가 균일하고 미세혈관과 세포막 구조가 명확히 구분되어 조직이 대조구 에 비해 오히려 구조적으로 안정되어 보였다. 비장의 경우, 시험구의 비장조직 내의 백혈구가 다소 많은 수가 넓게 분 포하는 경향을 나타내었으며, 신장의 조직은 대조구와 비교 하여 별다른 차이를 나타내지 않았다 (Fig. 2).

3.Lysozyme 활성

오배자 추출물을 투여한 후, 2주차, 4주차, 8주차에 어류의 각 신장, 비장, 혈청 및 점액의 lysozyme activity를 측정한 결과, 모든 시료에서 lysozyme activity가 8주차에 대조구보 다 높게 나타나면서 가장 높게 나타나는 경향을 보였다. 먼 저 신장의 경우, 투여후 2주차에 유의한 차이를 보이고 4주 차에는 활성이 낮아지면서 대조구와 차이를 보이지 않았다. 8주차에 다시 증가하여 대조구와 유의차를 보이면서 가장 높게 나타났다 (Fig. 3). 비장의 경우, 2주차에 신장과 비해 대 조구와 유의차가 많게 나타났으며 4주차에는 대조구보다 약 간 높았다. 8주차에는 역시 활성이 급격히 증가하였으며 가 장 높은 수치를 나타내었다 (Fig. 4). 혈청 내에서의 변화는 2 주차 및 4주차에는 시험구가 대조구보다 약간 높게 나타났 으나 큰 유의차가 없었으며, 8주차에는 대조구보다 월등히 높은 수치를 나타내었다 (Fig. 5). 그러나 점액에 있어서는 2 주차에 시험구가 대조구보다 오히려 낮게 나타났으며 4주차 에 급격히 저하하여 대조구와 유의차가 없었으나 8주차에 다시 증가하여 대조구와 유의차를 보였다 (Fig. 6).

4.Aeromonas veronii에 대한 저항성

오배자 추출물을 투여한 양식 메기의 어류병원성 세균에 대한 저항성을 알아보기 위하여 메기에 주로 발생하는 병원 성 세균인 Aeromonas veronii 균주를 사용하여 공격실험을 실시하였다.

오배자 추출물을 투여한 시험구에서는 세균의 복강내 주 사에 의한 공격 후 3일째부터 폐사하기 시작하여 최종 9일 째에 생존율이 33%였으며, 이후 살아남은 개체들은 2주 경 과시까지 계속 생존하였다. 그러나 오배자 추출물을 투여하 지 않은 대조구에서는 시험 종료일인 9일째에 모두 폐사하 여 시험구와 대조구 간의 생존율에 있어 유의한 차이가 있 었다 (Fig. 7).

고 찰

인체 및 가축에 있어서 천연물질의 항균력에 대한 최근 의 연구결과는 시험관내에서 많이 이루어져 왔다 (Kim et al. 1994; Kwon et al. 1999; Park et al. 1999; Jo et al. 2002; Choi 2003; Lee et al. 2010). 그러나 여러 병원체에 대한 항 균 및 항산화 효과가 있다는 사실이 한가지씩 입증되면서 생체내에서의 임상적 적용에 관한 연구도 진행되고 있다.

그중 넙치에 유자첨가사료를 투여하여 질병에 대한 성장 및 저항성에 대한 조사에서 혈액학적으로는 혈중 GOT 및 총콜레스테롤을 감소시키는 효과가 있었으며, 혈청내의 항 세균 활성이 높은 것으로 나타났다 (Jung et al. 2010). 황금 뿌리의 열수추출물을 넙치에 12주간 투여한 시험에서도 넙 치의 면역능 향상과 질병의 저항성 증가에 효과가 있다고 하였다 (Jee et al. 2012).

최근 뱀장어 양식에 있어서는 질병 치료로 인한 항생제 내성균의 출현으로 항생제 대체를 위한 천연물질 개발에 관 한 연구가 많이 진행되고 있다.

이러한 연구로는 뱀장어 사료에 β-glucan을 첨가하여 어 류의 면역기능에 관여하는 라이소자임의 혈청내 활성이 높 아지는 것을 확인한 예가 있으며 (Kim et al. 2008), 매실의 가공물인 오매의 열수추출물을 연속 투여 했을 시에도 혈청 내 라이소자임의 활성이 증가되고 병원성 세균에 의한 공격 시험에 있어서도 투여구가 대조구에 비하여 생존율이 높았 다고 하였다 (Kim et al. 2009).

Cho et al. (2005)은 겨우살이의 일종인 mistletoe를 뱀장어 사료에 첨가하여 2주간 투여했을 시에도 lysozyme 활성에 있어서 유사한 결과를 나타내었다.

오배자는 한약재 추출물 중에서 가축에 질병을 유발하는 세균인 대장균 등에 가장 항균력이 높다고 알려져 있다 (Cho et al. 2003; Choi 2003; Kim et al. 2008; Cho et al. 2014; Kim et al. 2014).

Choi et al. (1999)은 흰 쥐에 고지방식이와 함께 오배자 추출물을 투여하여 오배자 추출물이 혈청내 tryglyceride 및 cholesterol을 하락시키고 간기능 및 항산화능을 향상시킨다 고 하였다. 가금 및 가축분야에 있어서는 면역력이 약한 어 린 닭에 오배자의 추출물을 1주간 먹인 후, 닭에 Coccidium 증을 일으키는 Eimeria tenella를 인위 감염시켰을 때 오 배자 추출물이 항 콕시듐 효과가 있다고 밝혔다 (Lee et al. 2012). 또한 이유 후의 어린 돼지에게 오배자 추출물을 28일 간 먹인 다음 성장과 설사 발생에 관한 연구에서도 성장에 있어서는 큰 유의차가 없었으나 설사 발생 빈도에 있어서는 항생제를 첨가한 사료를 먹인 시험구와 큰 유의차가 없다는 결과를 얻었다 (Cha et al. 2013).

오배자의 추출물은 넙치 및 뱀장어에 8주간 투여했을 시, 두 어종 모두에 있어서 성장에는 영향을 미치지 않으나 뱀 장어 혈청 내 라이소자임 활성은 높아졌다고 하였다 (Choi. 2003).

본 시험은 전혀 다른 어종인 메기에 대하여 조사한 결과 로서 오배자의 열수추출물을 사료에 섞어 8주간 투여하여 일반사료를 먹인 대조구와 비교하여 성장에 있어서는 큰 유 의차가 나타나지 않았다. 혈액학적인 요소에 있어서도 Ht 및 TCHO를 제외하고는 특별한 변화가 없었으며, 오배자 추출 물의 투여에 따른 시험구의 간, 비장 및 신장조직의 병리조 직학적인 소견도 오배자에 의한 조직변성은 관찰되지 않았 으며 대조구와 큰 차이를 나타내지 않았다. 오히려 간조직에 는 구조적인 안정과 비장의 경우, 백혈구의 활성이 관찰되었 다. 신장 및 비장내의 라이소자임 활성에 있어서는 최종적 으로 오배자 투여구가 대조구보다의 활성이 높게 나타났으 며 혈청내의 활성에 있어서는 오배자 투여 8주후에 투여구 가 월등히 높게 나타났다. 점액내의 라이소자임 활성의 효과 는 서서히 나타났다. 메기에 감염되어 표피가 박리되는 병의 원인균으로 알려진 세균인 Aeromonas veronii 균에 의한 감 염시험에서도 최종 생존율이 33%나 되어 항균력이 있는 것 으로 나타났으므로 오배자 추출물의 지속적인 투여가 있었 다면 생존율이 더 높게 나타났을 것으로 예상된다. 메기는 실내의 가온식 사육에 의해서 기르는 뱀장어와는 달리 주로 야외의 노지에서 양식이 되고 있어 각종 병원체에 쉽게 노 출이 될 수 있다. 그러므로 오배자 추출물은 야외의 노지에 사육되고 있는 메기의 사료에 첨가하여 투여한다면 세균성 질병의 예방에 효과가 있을 것이라고 예상되며, 환경오염의 문제가 되는 내성균 출현도 방지할 수 있을 것으로 생각된 다. 또한 앞으로 메기에 질병을 일으키는 다른 병원체에 대 한 연구나 다른 어종에 대한 효과시험이 이루어진다면 좋은 결과가 도출될 것으로 생각된다.