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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean J. Environ. Biol. Vol.34 No.2 pp.107-115
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2016.34.2.107

The Effects of Cesium, Strontium and Cobalt on Cell Toxicity in the 2D and 3D Cell Culture Platforms

Gi Yong Kim
1,2, Sung-Min Kang1,2, Sung-Chan Jang1,3, Yun Suk Huh3*, Changhyun Roh
1,4*
1Biotechnology Research Division, Advanced Radiation Technology Institute (ARTI), Korea Atomic Energy Research Institute (KAERI), Jeongeup-si, Jeollabuk-do 56212, Korea
2Department of Chemical Engineering, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea
3Department of Biological Engineering, Biohybrid Systems Research Center (BSRC), Inha University, Incheon 22212, Korea
4Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science & Technology (UST), Daejeon 34113, Korea

† This authors contributed equally to this work.

Corresponding author: Yun Suk Huh, 032-860-9177, 032-872-4046, yunsuk.huh@inha.ac.kr; Changhyun Roh, 063-570-3133, 063-570-3139, chroh@kaeri.re.kr
May 13, 2016 June 21, 2016 June 22, 2016

Abstract

Currently, there are 442 operating nuclear power plants in the world, and 62 more are under construction. According to this reasoning, the treatment of radioactive waste is important to prevent the environmental ecosystem including humans, animals, and plants. Especially, a leakage of radioactive waste causes not only regional problem but also serious global one. In this study, we demonstrate the effect of radioisotopes (e.g., cesium, strontium, and cobalt) on a 3D culture cell. To develop the 3D cell culture system, we used a 96-well-culture plate with biocompatible agarose hydrogel. Using this method, we can perform the 3D cell culture system with three different cell lines such as HeLa, HepG2, and COS-7. In addition, we conducted a cell viability test in the presence of radioisotopes. Interestingly, the 3D morphological cells showed 42% higher cell viability than those on the 2D against cesium. This result indicates that the 3D platform provides cells morphological and physiological characteristic similar to in vivo grown tissues. Moreover, it overcomes the limitation of conventional cell culture system that can’t reflect in vivo systems. Finally, we believe that the proposed approach can be applied a new strategy for simple highthroughput screening and accurate evaluation of metal toxicity assay.

radioisotopes , agarose , cell viability , 3D cell culture

단층 및 입체 세포배양환경에서 세슘, 스트론튬 및 코발트가 세포 독성에 미치는 영향 분석

김 지용
1,2, 강 성민1,2, 장 성찬1,3, 허 윤석3*, 노 창현
1,4*
1한국원자력연구원 첨단방사선연구소 생명공학연구부
2충남대학교 공과대학 화 학공학과,
3인하대학교 생명공학과
4과학기술연합대학원대학교 방사선동위원소 응 용 및 생 명공학과

초록

    Ministry of Science, ICT and Future Planning
    NRF-2015M2A2A6A02045263(2)

    서 론

    전 세계적으로 원자력 발전소 (nuclear power plant)는 442 기가 가동 중이며, 62기가 충원될 예정이다. 그 중에서 한국 은 원자력 발전량 기준, 세계 6위이며 발전소 개수는 세계 5 위이다. 이를 통해, 원자력 발전소에서 생산하는 에너지 비 율은 전체 에너지 생산의 13.5%이며, 2015년 기준으로 한 국은 총 에너지 생산량 중에서 원자력 발전 비율이 31.3% 를 차지하고 있다. 그러므로, 앞으로의 원자력 발전을 통한 에너지 생산 비율은 점진적으로 증가할 것이며 이러한 영향 력을 기반으로 원자력 에너지 의존도는 더욱 심화될 것으로 예측된다 (Lee 2016). 추가적으로 원자력 발전의 의존도에 비례하여 이에 대한 경제성 및 신뢰도, 그리고 안정성이 부 가적으로 향상되어야 한다.

    하지만, 예상하지 못한 천재지변 및 방사성 폐기물에 의 한 원자력 발전소의 위험성은 범국제적 문제로 화제가 되 고 있는 상황이며 이에 대한 대책이 시급한 실정이다. 대 표적인 예를 들면 1979년 미국의 스리마일 섬 원전사고, 1986년 우크라이나 체르노빌 원전사고, 그리고 최근 2011 년 일본의 후쿠시마 원전사고를 통해 대량의 방사성 물질 (radioactive material)이 유출되는 재난이 발생되었다 (Hirose 2012). 이중에서 핵분열 생성물인 세슘-137(137Cs), 스트론 튬-90(90Sr), 코발트-60(60Co)의 대량유출이 심각한 문제로 집중되고 있으며, 주로 대기 및 토양, 그리고 해수 등에 치 명적인 환경 오염 및 파괴를 야기시킨다 (Mosquera et al. 2006). 이와 더불어 방사성 핵종 원소의 긴 반감기 (half-life) 는 인간을 장시간 피폭시켜 심각한 질병의 원인이 된다 (Zhu and Smolders 2000; Chakraborty et al. 2007). 방사성 핵종 의 대표원소인 세슘-137(137Cs)의 반감기는 30.2년, 스트론 튬-90(90Sr)은 28.7년, 그리고 코발트-60(60Co)은 5.27년의 긴 반감기를 갖는다. 세슘-137와 스트론튬-90는 생체 필수 원 소인 칼륨 (K+)과 칼슘 (Ca2+)의 화학적 성질 및 거동이 유 사하기 때문에 인간을 포함한 생태계를 구성하고 있는 유 기체 (organism) 내부로 쉽게 흡수된다. 이를 통해 세슘-137 의 피폭은 과잉 자극 감수성 (hyperirritability)과 발작 및 사 망에 이르게 되며, 스트론튬-90은 골수 암 (acute myeloid leukemia)과 백혈병 (leukemia), 그리고 과잉 축적으로 인 한 유전적 돌연변이 등을 유발할 수 있다 (Chen 1997). 그리 고 코발트-60에 의한 장기간 노출은 속 쓰림 및 어지러움 증, 심하면 국부적 피부괴사 (necrosis)를 유발한다 (Seymour 1997). 이러한 방사성 핵종 원소의 생물학적 영향력 및 이 를 통해 유발되는 문제에 대한 해결방법 개선을 위해 다양 한 세포 및 배양방법을 이용하여 방사성 핵종 원소들에 대 한 세포 생존능력을 분석하는 연구에 관심이 집중되고 있다 (Avery 1995; Mothersill and Seymour 1997).

    기존의 세포 배양방법은 단층 세포배양이 일반적이며 적 은 비용, 높은 신뢰도와 민감도, 그리고 단시간 내에 다수의 물질 분석을 수행하는 고속 대량 스크리닝 (high throughput screening)의 실용화를 가능하게 하였다 (Persidis 1998; Jeong et al. 2012; Song et al. 2014). 하지만, 단층 세포배 양 방법은 공간적 제약으로 인해 세포와 세포간의 상호작 용 (cell-cell interaction)이 감소되어 약물에 대한 생체 내 부로의 적용 및 응용에 적합하지 않다는 한계점을 지니 고 있다. 이를 해결 하기 위해 최근 고분자 기반 하이드로 겔 (hydrogel) 지지체 (Smith et al. 2011; Shen et al. 2012; Ehsan et al. 2014), 또는 미세유체장치 (microfluidic device) 를 이용한 삼차원 입체 세포배양방법 (Three-dimensional cell culture)이 소개된 바 있다 (Torisawa et al. 2009; Lee et al. 2015). 일반적으로 지지체의 재료로써 하이드로겔은 피 브로넥틴 (Fibronectin) (Kurth et al. 2009), 폴리에틸렌글리 콜 (Polyethylene glycol, PEG) (Loessner et al. 2013), 키토산 (Chitosan) (Seo et al. 2006; Zhang et al. 2012; Daneshmandi et al. 2016), 콜라겐 (Collagen) (Marelli et al. 2014; Kim et al. 2016), 펙틴 (Pectin) (Munarin et al. 2011), 아가로오스 (Agarose) (Haessler et al. 2009; Mercey et al. 2010; Luo et al. 2012) 등 다양한 물질을 사용하여 연구가 진행되고 있다.

    특히, 하이드로겔 지지체 기반 삼차원 세포배양 기술은 하 이드로겔에 의해 세포 간의 뭉침 현상이 일어나 삼차원 입 체 세포배양이 용이하다는 특징을 갖고 있으며, 이는 세포 증식 및 생존에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있다 (Loessner et al. 2013). 그러므로 기존의 연구와 비교 하였을 때 외부물질에 대한 영향을 더욱 정확하게 진단 및 확인을 할 수 있다는 장점이 있다.

    따라서, 본 연구는 아가로오스 지지체 기반 삼차원 입체 세포배양 기술을 이용하여 암세포와 정상세포로 구성되어 있는 삼차원 체내 환경 모사 구조체를 구현하였다. 또한, 기 존의 세포 배양방법인 단층 세포배양과 본 실험에서 제작된 입체 배양구조체에 세슘, 스트론튬, 코발트를 노출시킴으로 써 방사성 핵종 원소의 영향력을 정량적으로 평가하였다.

    재료 및 방 법

    1.재료

    암세포인 자궁경부암세포 (adenocarcinoma, HeLa), 간 암세포 (hepatocellular carcinoma, HepG2), 정상 세포인 원 숭이 신장표피세포 (monkey kidney fibroblast, COS-7)는 ATCC (VA, USA)에서 구매하였다. 입체 배양구조체를 만들 기 위한 배양 접시 (96-well-culture plate)는 SPL (Gyeonggido, Korea)에서 구매하였고, 지지체로 쓰이는 아가로오스 는 BMA (ME, USA)에서 구매하였다. 세포들을 배양하기 위 한 배지는 Gibco (NY, USA)에서 구매한 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium), FBS (Fetal bovine serum), PS (penicillin-streptomycin) 를 사용하였다. 또한 각 세포에 방 사성 핵종 원소 농도에 따른 세포 생존능력을 알아보기 위 해 세슘 (Cs+), 스트론튬 (Sr2+), 코발트 (Co2+)는 KANTO Chemical (Tokyo, Japan)에서 구매한 기준용액 (standard solution, 1000 mg L-1)을 배지로 희석시켜 다양한 농도의 용액을 제조하였으며, 이에 대한 확인을 위해 CCK-8 (Cell Counting Kit-8) 시약과 형광시약 LIVE/DEAD Viability/ Cytotoxicity kits를 Dojindo (Tokyo, Japan), Invitrogen (Eugene, UK)에서 각각 구매하여 분석에 이용하였다.

    2.실험방법

    1)세포 배양

    세포 배양에 사용된 배지는 500 mL DMEM에 10% FBS, 1% PS로 구성되어 있으며 HeLa, HepG2, COS-7 세포들을 60×15 mm 원형 배양접시 Corning (NY, USA)에서 72시간 동안 이산화탄소 배양기 (CO2 incubator)를 통해 배양하였다.

    2)입체 배양구조체 제작 및 세포배양

    입체 배양구조체는 멸균된 96-well-culture plate를 이용하 여 제작하였다. 2% 아가로오스를 각 well에 100 μl씩 분주 후 상온에서 30분간 경화시켜 제작을 완료하였다. 실험에 사 용될 세포를 배양접시에 0.25% trypsin-EDTA 용액을 처리 하여 부유화를 유도한 후 원심분리기 (1000 rpm min-1)로 1 분간 침전시켜 선택적으로 세포를 추출하였다. 추출된 세포 들은 1×105 mL-1의 농도로 입체 배양구조체 내부에 100 μl 씩 분주 후 48시간 동안 이산화탄소 배양기에서 삼차원 세 포배양을 실시하였다. 다양한 농도의 방사성 핵종 원소는 세 슘 (Cs+; 1000 mg L-1, 7.52 mM), 스트론튬 (Sr2+; 1000 mg L-1, 11.5 mM), 코발트 (Co2+; 1000 mg L-1, 17.0 mM) 기준용 액을 배지에 희석하여 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 mg L-1의 농도를 만들었다. 이를 이용하여 입체 배양구조체 내부에 1시간, 24 시간 10 μl씩 처리함으로써 실험을 수행하였다. 그 후 CCK- 8 시약을 이용하여 세포 생존능력을 분석하였다 (Fig. 1). 각 세포들은 24시간 후에 제작된 입체 배양구조체에서 3차원 구조를 갖는 구 형태로 배양되는 것을 광학 현미경 (Leica DFC500 R2 Digital Camera & SW Kit, Germany) 이미지 분 석을 통해 확인하였다.

    3)삼차원 입체배양 확인 및 세포 생존능력 평가

    입체 배양 구조체 내부에서 세포들의 삼차원 입체배 양은 광학 현미경을 이용하여 확인하였다. 세슘, 스트론 튬, 코발트에 대한 세포 생존능력을 확인하기 위해 CCK- 8 시약을 이용하여 세포 염색을 수행하였고, micro plate reader (Infinite®, Tecan Co, Switzerland)를 사용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 분석 원리는 CCK-8 (테트라졸리움염, tetrazolium salt) 물질이 세포 내 탈수소 효소 (dehydrogenase)에 의한 환원 (reduction)을 통해 주 황색 포르마잔 (formazan)을 형성하여 흡광도 분석을 통 해 세포 생존능력 확인이 가능하다. 추가적으로 형광이미 지 분석은 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kits (live: Calcein acetoxymethyl ester, Calcein-AM, dead: Ethidium homodimer-1, Ethd-1) 시약 처리 후 공초점 현미경 (CLSM; Cal Zeiss, LSM 800, Germany)을 이용하여 관찰하였다. 분석 원리는 세포 내의 에스테라아제 (esterase) 효소가 Calcein-AM의 AM (acetoxymethyl ester) 작용기를 분해시 켜 활성된 Calcein 화합물이 세포 내부의 칼슘 (Ca2+) 이온과 결합을 통해 형광 (λem=517)을 발하게 되며, Ethd-1은 세포 사멸에 의한 세포막 파괴를 통해 핵의 DNA와 결합함으로 써 형광 (λem=617 nm)을 발하게 된다. 또한, 동일한 96-wellculture plate의 2차원과 3차원 세포 배양에서 세슘, 스트론 튬, 코발트에 따른 세포 독성평가를 일원배치 분산분석법 (one-way ANOVA test)을 통해 분석하였으며, p<0.05의 수 준에서 유의성을 검정하였다.

    결과 및 고 찰

    1.입체 배양구조체 세포 부착 능력 평가

    본 실험에서 사용한 입체 배양구조체는 다음과 같다 (Fig. 2A). 이를 통해 Fig. 2B와 같이 하나의 세포배양 시스템 내 에서 2차원과 3차원 세포배양을 동시에 수행할 수 있는 다 중 배양시스템을 구축하였다. 일반적으로 이차원 세포 배양 은 Fig. 2C와 같이 단층 형태로 세포가 배양됨을 확인하였으 며, 입체 배양구조체 내부에서는 1×105 mL-1의 농도를 갖는 HeLa 암세포가 아가로오스에 의한 세포 응집 (aggregation) 을 통해 삼차원 배양됨을 관찰하였다 (Fig. 2D). 삼차원 세포 응집의 원인은 96-well-culture plate 내부의 벽면과 아가로오 스 간의 모세관 현상 (capillary phenomenon)에 의한 오목한 형태를 갖는 표면 (surface)을 통해 이루어진다. 그 후 아가로 오스 포면 위로 피브로넥틴 (fibronectin), 셀렉틴 (selection), 그리고 콜라겐 (collagen)과 같은 세포막 표면 단백질의 부착 이 이루어지기 때문에 세포간의 인위적 응집이 이루어진다. 그러므로 본 시스템은 실시간으로 서로 다른 배양 환경에서 의 비교 및 분석이 수월하며, 이를 통해 보다 정확한 분석이 가능하다는 장점을 갖는다.

    2.세슘, 스트론튬, 코발트 농도에 따른 세포 생존능력 분석

    Fig. 3과 같이 세슘, 스트론튬, 코발트와 같은 다양한 외부 환경 방해인자로 작용하는 방사성 핵종 원소를 처리함으로 써 세포 생존능력을 분석하였다. 이는 곧, 우리가 살고 있는 자연계에서 충분히 일어날 수 있는 방사성 핵종 오염으로 해석될 수 있으며, 실험은 세슘, 스트론튬, 코발트를 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 mg L-1의 농도를 갖도록 배지에 희석해 48시간 이상 배양시킨 세포로 단시간 (1시간) 동안 노출함으로써 수 행되었다. 생존능력이 우수할수록 주황색 포르마잔을 더욱 더 많이 형성하므로, 이를 통해 Fig. 3A-C와 같이 실시간 비 교/분석을 수행할 수 있었다. 직선회귀법 (linear regression analysis)을 통한 단층 배양세포의 25% 치사량 (lethal dose, LD25)을 분석의 척도로 사용하였으며, 실험 결과 다양한 세 슘 농도에 따른 서로 다른 세포의 25% 치사량 농도는 HeLa: 8 mg L-1, HepG2: 10 mg L-1, COS-7: 1.5 mg L-1, 스트론 튬 농도에 따른 세포 25% 치사량 농도는 HeLa: 0.7 mg L-1, HepG2: 4 mg L-1, COS-7: 0.5 mg L-1, 그리고 코발트의 25% 치사량 농도는 HeLa: 0.6 mg L-1, HepG2: 5 mg L-1, COS- 7: 1.2 mg L-1으로 확인되었다. 이와 대조적으로 입체 배양 된 세포의 25% 치사량은 코발트 처리를 통한 COS-7: 50 mg L-1에서 나타남을 확인하였으며, 입체 배양세포는 단층 배양 된 세포보다 최대 42%의 높은 생존능력을 보여주었다 (Fig. 3C). 이를 통해 입체 배양세포가 우수한 생존률을 보이는 이 유는 세포 응집을 통한 세포-세포간의 상호작용 거리가 단 축됨으로써 면역을 담당하는 인터류킨 (interleukin), 생식을 담당하는 케모카인 (chemokine)과 같은 생물활성 단백질이 활발하게 분비됨으로써 인위적 외부환경 자극으로부터 방어 가 가능하기 때문이다 (Luca Mariotti et al. 2010). 이를 통해 삼차원 현상을 갖는 세포 군집은 세슘, 스트론튬, 코발트와 같은 외부환경 방해인자로부터 우수한 세포 생존능력을 보 여줌을 확인하였다.

    3.시간에 따른 세슘, 스트론튬, 코발트 처리에 대한 세포 생존능력 평가

    세슘, 스트론튬, 코발트 처리시간 증가에 따른 세포 생존 능력을 확인하고자 Fig. 4와 같이 단층 배양세포와 입체 배 양구조체에 세슘, 스트론튬, 코발트를 24시간 동안 처리하 였다. 세슘, 스트론튬, 코발트를 24시간 처리 하였을때 25% 치사량 농도는 단층 배양세포에서 세슘 처리를 하였을 때 HeLa: 15 mg L-1, HepG2: 1.3 mg L-1, COS-7: 20 mg L-1으 로 나타났고, 스트론튬에 대한 25% 치사량 농도는 HeLa: 16 mg L-1, HepG2: 8 mg L-1, COS-7: 5 mg L-1, 코발트의 25% 치사량 농도는 HeLa: 8 mg L-1, HepG2: 4 mg L-1, COS-7: 4 mg L-1으로 확인하였다 (Fig. 4A-C). 앞서 실험한 1시간 처 리 결과와 비교하였을 때 24시간 처리한 25% 치사량 농도 값은 최대 15배 이상 향상됨을 확인하였다. 이는 곧 세슘, 스 트론튬, 코발트와 같은 외부환경 방해인자에 장시간 동안 노 출되어도 세포사멸 (apoptosis)이 유도되지 않음을 의미하며 역으로 세포 생존능력이 증가함을 보였다. Fig. 4C를 통해 정상세포인 COS-7에서 생존능력이 두드러지게 증가됨을 확 인할 수 있으며, 이는 세포 배가시간 (doubling time)에 의한 세포성장이 주요 원인으로 작용됨을 추측할 수 있다. 위 추 측에 대한 근거로써 본 그룹에서 조사결과 각각의 세포 배 가시간은 HeLa: 24시간, HepG2: 20시간, COS-7: 18시간 임 을 확인하였다. 따라서, 세포 배가시간이 짧은 COS-7 세포의 세포 분열이 다른 세포들보다 월등하게 일어나 상대적으로 세포 생존능력이 향상된 것으로 보인다. 또한, 일원배치 분 산분석법 (one-way ANOVA test)을 사용하여 통계 분석한 결 과 세슘, 스트론튬, 코발트에 대한 처리 농도가 높아질수록 유의함을 확인하였다 (p<0.05).

    4.세슘 처리시간에 따른 세포회복능력 분석

    세포 생존능력을 확인함에 있어 세포 배가시간이 주요 변 수로 작용함을 증명하기 위해 50 mg L-1 농도의 세슘을 단층 배양세포와 입체 배양세포에 노출시킴으로써 시간에 따른 각각의 세포 생존능력을 확인하였다 (Fig. 5). 세슘 처리 후 1 시간 동안 HeLa 암세포는 입체 배양세포에서 32%, 단층 배 양세포에서 48%가 사멸하는 경향성을 보이며 (Fig. 5A), 정 상세포인 COS-7는 입체 배양세포에서 73% 단층 배양세포 에서 80%의 세포사멸이 유도됨을 확인하였다 (Fig. 5B). 본 결과를 통해 세슘에 대한 저항성 (resistance)은 HeLa 암세포 가 COS-7 정상세포보다 우수하며, 장시간 관찰결과 모든 세 포에서 세포 생존능력이 향상됨을 확인할 수 있다. 그리고 단층 배양을 통한 세포들이 입체 배양세포보다 생존능력이 기하 급수적으로 향상되었다. 본 실험을 통해 세포의 배가시 간이 세포 생존능력에 영향을 끼치며, 정상세포보다 암세포 가 외부환경 방해인자에 저항성이 우수함을 확인할 수 있었 다.

    5.세포 형광 염색을 통한 세포 생존능력 평가

    Fig. 6과 같이 입체 배양구조체에서 세슘 농도에 따른 세 포 생존능력을 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kits (live: Calcein acetoxymethyl ester, Calcein-AM, dead: Ethidium homodimer-1, Ethd-1)을 사용하여 형광 분석을 수행하였다. 입체 배양구조체에서 48시간 동안 배양된 세포를 50 mg L-1 세슘 환경에 6시간 동안 노출했으며, 세포 사멸이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 6A, B). 또한, 세포의 농도를 증 가시킨 입체 배양세포의 세포 군집 (1×107 cells mL-1)은 상 대적으로 적은 세포 농도를 갖는 군집 (1×105 cells mL-1)보 다 사멸이 증가하는 것을 확인할 수 있다 (Fig. 6C). 이를 통 해 한정된 공간에서 세포 농도의 증가는 세포와 세포간의 뭉침 현상이 물리적 스트레스로 작용하여 세포 사멸이 단시 간 내에 유도됨을 의미하며, 본 이미지 분석을 바탕으로 구 조체를 구성하는 세포 개체농도는 세포 생존능력에 영향력 이 있음을 확인할 수 있다.

    결 론

    본 연구에서는 아가로오스 하이드로겔을 이용하여 입체 배양구조체를 제작하였으며, 동일한 배양접시에 입체 배양 구조체와 기존의 단층 세포 배양방법을 구현함으로써 세슘, 스트론튬, 코발트에 대한 세포의 생존능력을 관찰할 수 있는 실시간 다중분석 시스템을 개발하였다. 입체 배양구조체를 통해 3차원 입체 배양이 가능하며 3차원 배양 세포에 외부 환경 방해인자 (세슘, 스트론튬, 코발트)를 처리하였을 때 모 든 투여군에서 단층 배양 세포보다 외부환경 방해인자에 대 하여 생존능력이 우수한 것을 흡광도 분석 및 세포 형광염 색을 통해 정성, 정량적으로 보여주었다. 본 기술은 체외 (in vitro)에서 간접적으로 체내 (in vivo)를 모사 할 수 있기 때문 에 방사성 핵종 원소 영향 평가 뿐만 아니라, 약물 독성 능력 평가 및 신약개발을 위한 플랫폼 기술로 활용될 수 있을 것 으로 보인다.

    적 요

    전 세계적으로 원자력 발전소는 442기가 가동 중이며, 62 기가 충원될 예정이다. 원자력 발전소의 증가에 따라 방사성 폐기물 유출에 대한 위험성도 증가하였다. 이러한 이유 때문 에, 방사성 폐기물의 처리는 인간, 동물, 식물을 포함하는 자 연 생태계를 보전하는 관점에서 중요하다. 또한, 방사성 폐 기물 유출은 그 지역뿐만 아니라 전 세계적으로 심각한 문 제를 야기한다. 본 연구는 입체 배양세포에 방사성 핵종원 소 (세슘, 스트론튬, 코발트)를 처리하였고 이에 대한 영향력 을 확인하였다. 입체 배양 구조체는 아가로오스 하이드로겔 을 이용하여 제작했으며 암세포 및 정상세포 (HeLa, HepG2, COS-7)를 사용하여 입체 배양을 실시 하였다. 입체 형태로 세포를 배양한 후 세슘, 스트론튬, 코발트 농도 변화에 따라 세포 생존능력을 분석하였다. 이때 입체 배양세포에서 생존 능력이 단층 배양세포 보다 최대 42% 우수한 것을 확인하였 다. 입체 배양구조체는 세포가 형태 및 생리학적으로 in vivo 환경인 조직과 비슷하게 배양을 가능하게 하였다. 따라서, 입체 배양구조체는 기존의 단층 배양 한계점인 in vivo 환경 에 적용시킬 수 없다는 한계를 극복하였다. 본 입체 배양 기 술이 중금속 독성평가 및 단시간 내에 다수의 물질 분석을 수행하는 고속 대량 스크리닝 기술에 활용될 것으로 기대한 다.

    사 사

    이 논문은 미래창조과학부의 재원으로 방사선기술개발 사업의 방사선융합기술 (공동응용)의 일환으로 지원을 받 아 수행된 연구로 이에 감사드립니다 (NRF-2015M2A2A6 A02045263(2)).

    Figure

    KJEB-34-2-107_F1.gif

    Schematic diagram of three dimensional platform and cell viability analysis.

    KJEB-34-2-107_F2.gif

    Real image of three dimensional platform. (A) Photo of the agarose coated 96-well-culture plate. (B) Cells were spreading on a 3D platform. (C) Monolayer culture of HeLa cell. (D) 3D culture of HeLa cell. Insert means expanded HeLa cell. Scale bar indicates (C) 20 μm and (D) 500 μm.

    KJEB-34-2-107_F3.gif

    Cytotoxicity assays of Cs+, Sr2+, and Co2+ at different concentrations (control, 0.1 mg L-1, 0.5 mg L-1, 1 mg L-1, 5 mg L-1, 10 mg L-1, and 50 mg L-1) for 1 h incubation on a various cell lines such as (A) HeLa, (B) HepG2 and (C) COS-7. All values are mean±standard deviation (SD). Results were analyzed by one-way ANOVA tests. # vs. (2D Cs+; P<0.05); * vs. (2D Sr2+; P<0.05); ** vs. (2D Co2+; P<0.05).

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    Cytotoxicity assays of Cs+, Sr2+, and Co2+ at different concentrations (control, 0.1 mg L-1, 0.5 mg L-1, 1 mg L-1, 5 mg L-1, 10 mg L-1, and 50 mg L-1) for 24 h incubation on a various cell lines such as (A) HeLa, (B) HepG2 and (C) COS-7. All values are mean±standard deviation (SD). Results were analyzed by one-way ANOVA tests. # vs. (2D Cs+; P<0.05); * vs. (2D Sr2+; P<0.05); ** vs. (2D Co2+; P<0.05).

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    Time dependent CCK-assay on 2D and 3D platform after Cs+ 50 mg L-1 treated.

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    Confocal laser scanning microscopy (CLSM) images of Cs+ treated HeLa cell viability test on a 3D platform. Cells after 6 h exposure to (A) 0 mg L-1 Cs+ and (B and C) 50 mg L-1 Cs+, respectively. Non-survival cells were stained red, survival cells were stained green by using the Ethd-1/Calcein AM staining kit. Scale bar indicates. (A and B) 100 μm and (C) 500 μm.

    Table

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    Vol. 40 No. 4 (2022.12)

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