서 론

산업이 발달하고 생활 수준이 향상됨에 따라 화학물질의 사용 및 유통이 크게 증가하고 있다. 특히 산업활동과 더불 어 발생되는 산업폐수는 화학물질의 종류와 농도가 제각각 다르며, 중금속을 비롯한 다양한 환경오염물질을 함유하고 있는 경우가 많다. 이와 같은 화학물질은 수중생물에 해로운 영향을 유발할 뿐만 아니라 궁극적으로 인체건강에도 영향 을 미칠 수 있다, 그동안 산업폐수의 수질은 이화학적 분석 에 근거한 개별물질에 대한 방류허용기준으로 관리되어 왔 으나 화학물질의 종류별로 오염도를 분석하기에는 비용, 시 간, 기술, 인력 등의 측면에서 현실적으로 많은 어려움이 수 반된다. 따라서 수계로 배출되는 다양한 유해물질에 대한 위 험을 극복하고자 미국을 비롯한 유럽의 여러 국가들은 지 표생물을 이용하여 폐수의 독성을 평가하는 방법인 산업폐 수 통합독성평가 (Whole Effluent Toxicity Test)가 수질의 모 니터링 수단으로 활용되고 있다 (USEPA 2002). 우리나라 역 시 수 생태계보호를 위해 2007년도 수질 및 수 생태계 보전 에 관한 법률을 개정하고 2011년도에는 생태독성관리제도 를 도입하여 운영하고 있다 (Korea Ministry of Environment 2009, 2011).

생태독성관리제도는 산업폐수를 대상으로 생물감시를 통 해 독성물질의 방류를 규제하기 위한 법으로 물벼룩에 미 치는 급성 영향 정도를 파악하여 그에 따른 배출허용기준 을 정하는 제도이다. 그러나 표준 시험생물 종인 Daphnia magna는 외래종으로 국내 서식 생물 종 발굴 및 국내 서 식 종을 이용한 생태독성평가기법 개발이 요구되고 있다. 현재 주로 사용하고 있는 수생태 독성평가는 현장관리자 가 직접 시료를 채취하여 독성평가를 수행하고 있어 시험 분석 시 시험자의 숙련도에 따른 결과의 차이 등으로 정확 한 분석 데이터를 얻는 데 어려움이 있다. 또한 시험 생물 종에 따라 상이하나 일반적으로 생리적 활성 변화 또는 생 장영향 등의 측정은 수 시간 (D. magna, 24시간)에서 수일 (Pseudokirchneriella subcapitata, 96시간) 후에나 독성 영 향을 판단할 수 있어 실시간으로 수질을 관리하기에는 많은 단점이 있다. 따라서 국내 수계 관리에 적합하고 수질의 체 계적 관리가 가능하며 실시간으로 모니터링이 용이한 자동 화된 독성평가 시스템개발이 필요하다.

유글레나는 체내에 엽록체를 가지고 광합성을 하는 식물 적 특성과 탄소 원으로 유기물을 이용하고 세포벽이 없으며 편모로 유영생활을 하는 원생동물의 편모충류에 해당하는 동물적 특성을 동시에 가지고 있는 진해생물이다 (Cramer and Myers 1952; Brochiero et al. 1984; Einicker-Lamas et al. 2002). 유글레나는 세포의 생리적 특성 변화와 세포의 생 장저해율 그리고 세포 운동성 변화 등 다양한 종말점을 이 용한 독성평가가 가능하다. 유글레나 (Euglena gracilis)는 빛 (light)과 중력 (gravity)에 대해 운동성 반응을 나타내고 있 으며 (Häder 1987, 1991) 특히 중력에 대한 일정한 방향성 (gravitaxis)은 화학물질에 대한 독성을 측정하는 민감한 지 표가 될 수 있음이 보고되었다 (Stallwitz and Häder 1994; Tahedl and Häder 1999). E. gracilis의 중력에 대한 방향성 뿐만 아니라 이동 속도, 움직임, 그리고 세포 형태 등 동물적 특성을 이용한 독성반응 측정기법이 개발된 이래 다양한 유 해화학물질 및 환경시료에 대해 독성평가가 수행되고 있으 며 도출된 결과를 기반으로 E. gracilis가 수생태 독성평가에 적합한 시험법으로 제안되고 있다 (Tahedl and Häder 1999, 2001; Einicker-Lamas et al. 2002; Azizullahand Richter 2012). 본 연구팀은 최근 수행한 국내 서식 종 유글레나 (Euglena agilis)를 이용한 독성 시험법 개발을 위한 기초연 구 및 유기용매에 대한 영향평가를 통해 E. agilis 역시 운동 성 변화에 기인된 변수 (velocity, motility)가 신속하고 효과 적인 독성평가 지표가 될 수 있을 것으로 판단하였다 (Lee et al. 2015). 따라서 E. agilis의 운동성 변수 (velocity, motility, alignment, r-value, upward, compactness)를 자동으로 측정 하여 정량화하는 장비인 E. agilis 모니터링 시스템 (E-Tox) 을 이용하여 생태독성 평가의 도구로서 E. agilis 운동성 시 험 (E. agilis biomonitoring test)의 적용 가능성을 평가하 였다.

재료 및 방 법

1.시료 채취

축산폐수 시료는 전라북도 B 분뇨처리장에서 도금폐수 시 료는 경기도 A 도금시설 폐수처리 공정에서 각각 2015년 7 월과 8월에 취수하였다. 채취한 시료는 4 L 갈색 유리병에 담아 4°C 차광상태에서 보관하였다. D. magna 생태독성시 험과 E. agilis 시험은 시료 채취 후 48시간 이내 수행하였고 그 외 모든 실험은 시료 채취 후 7일 이내 실시하였다.

2.E. agilis의 배양

본 실험에 이용된 E. agilis는 인천대학교 수서독성 생리생 태학 실험실에서 분양받아 사용하였다. E. agilis는 sodium acetate가 포함된 배양액 (pH 6) (Starr 1971; Lee et al. 2015) 에 초기 접종한 후 2800 Lux, 24±1°C, 광 주기 16 : 8 (명 : 암) 조건하에서 배양하였다. 시험은 배양 후 최소한 7일 이상된 E. agilis (약 1.5×10⁵ cells mL^-1)를 이용하여 수행하였다.

3.E-Tox 시스템 측정원리

E-Tox는 시험생물 종인 유글레나 (E. agilis)의 움직임을 기반으로 세포의 운동성 변수를 측정하는 장치로 Tahedl and Häder에 의해 고안된 E. agilis 자동화 기기의 측정원리 (Tahedl and Häder 2001)를 기본으로 적용하였으며 간략한 과정은 다음과 같다. 증류수 또는 시료에 노출된 E. agilis를 CCD (Charge coupled device) 카메라로 촬영하여 (1초에 5 번, 총 2분) 화면을 이미지화한다. 화면 속 세포에 대한 인식 과정 후 대상 세포에 대해 연속된 화면을 비교함으로써 세 포의 운동성 반응을 계산한다 (Fig. 1). E-Tox가 측정하는 E. agilis 운동성 변수는 다음과 같다. Velocity는 대상 세포들의 평균속도를 나타낸다. Motility는 대상 세포들 중 활동성 있 는 세포의 백분율을 나타낸다. Compactness는 세포의 형태 를 나타내는 값으로 세포의 길이와 폭의 비 (값이 작을수록 구형)를 나타낸다. Upward는 대상 세포들 중 위로 움직이는 세포의 백분율을 낸다. 각 운동성 변수는 다음과 같은 계산 식 (Tahedl and Häder 2001; Lee et al. 2015)을 이용하여 산 출한다.

d=벡터의 길이 (1째 화면과 5째 화면의 세포거리, x축 상의 이동거리와 y축상의 이동거리)

Δt: 1째 화면과, 5째 화면의 시간 차이

n_s: velocity>v_s인 벡터의 수

n: 모든 벡터의 수

v_s: 활동적으로 움직이는 세포와 활동성이 없거나 바닥으 로 가라 앉는 유글레나를 구별하는 최소한의 속도

n_s: velocity>v_s인 벡터의 수

n₀: 0°≤α≤180°인 벡터의 수

벡터의 수

v_s: 활동적으로 움직이는 세포와 활동성이 없거나 바닥으 로 가라 앉는 유글레나를 구별하는 최소한의 속도

l: 유글레나 길이

d: 유글레나의 폭

4.D. magna test

24시간 급성 물벼룩 독성시험은 US-EPA와 환경부에서 제시하는 시험법에 따라 수행하였다 (USEPA 2002; Korea Ministry of environment 2011). 농도별로 준비된 시료 (50 mL)에 생후 24시간 미만의 어린 개체 (5마리)를 넣어 21± 1°C, 광 조건 명 : 암=16:8 (800 Lux)에서 시험을 실시하였 다. 표준 독성시료는 중크롬산칼륨 (K₂Cr₂O₇)을 이용하여 수 행하였고 모든 시험은 4반복으로 실시하였다. 시료에 노출 된 어린 개체의 유영저해를 판단 후 Trimmed Spearman- Karber method를 이용하여 시험생물의 50%에 영향을 미치 는 농도 (EC₅₀)를 도출하였고 이 결과로부터 Toxic Unit (100/ EC₅₀)를 산출하였다.

5.E. agilis 시스템을 이용한 독성평가

1)단일 독성 원 영향 분석

환경유해 화학물질에 대한 생태독성측정 수단으로 E. agilis 운동성 시험의 적용 가능성을 평가하고자 중금속 8 종 (은(Ag), 카드뮴 (Cd), 구리 (Cu), 크롬 (Cr), 수은 (Hg), 니 켈 (Ni), 납 (Pb), 아연 (Zn) 등)을 대상으로 농도별 E. agilis 운동성 반응을 측정하였다. 각 시험물질에 대해 농도별로 산출된 평균 운동성 반응 값을 이용하여 각 운동성 변수 에 대한 EC₅₀ (반수영향농도)를 산출하였다. 시험물질에 대 한 E. agilis 운동성 시험의 독성민감도는 기존 생태독성 시 험의 문헌상 자료의 결과 (D. magna, V. fischeri, 그리고 E. gracilis)와 비교하여 평가하였다. 시험물질 및 시험농도의 범위는 Table 1에 나타내었다.

2)현장시료에 대한 영향분석

생태독성 모니터링 장비로서 E-Tox의 현장적용 가능성을 평가하기 위하여 축산폐수 처리 방류수, 도금폐수 처리 방류 수, 그리고 도금폐수 1차 처리수를 대상으로 생태독성 모니 터링 장치 시스템 (E-Tox)을 이용하여 E. agilis 운동성 평가 와 D. magna 급성독성 평가를 수행하여 비교하였다.

6.통계처리

대조군과 실험군의 유의성 검정은 students t-test로 비교하 였고 SAS 통계프로그램을 이용하여 95% 신뢰구간을 포함 한 EC₅₀을 분석하였으며 모든 통계 값에서 유의 수준은 0.05 이하 (p<0.05)로 하였다.

결과 및 고 찰

1.단일독성 원에 대한 E. agilis 영향 분석

단일독성 원에 대한 E. agilis의 영향을 분석하기 위해 총 8종의 중금속, 은 (Ag), 카드뮴 (Cd), 구리 (Cu), 크롬(Cr), 수 은 (Hg), 니켈 (Ni), 납 (Pb), 아연 (Zn)에 대한 E. agilis의 반응 을 측정한 후 각 물질의 농도별 평균 반응 값을 이용하여 E. agilis 운동성 변수에 대한 EC₅₀을 산출하였다. 중금속 시료 노출에 의해 1개 이상의 E. agilis의 운동성 반응 변화가 농 도 의존적으로 측정되었으며 산출된 E. agilis의 운동성 변수 의 EC50 (95% 신뢰구간 포함)을 Table 2에 나타내었다.

E. agilis 운동성 변수의 평균 EC₅₀을 기준으로 낮은 농도 에 유의한 반응을 나타내는 변수를 민감한 반응이라고 규정 하였을 때, 은 (Ag)에 대한 E. agilis 운동성 변수는 velocity 와 motility로 분석되었다. 은 (Ag)에 대한 농도별 E. agilis 운동성 변수의 변화를 Fig. 2에 나타내었다. 카드뮴 (Cd)을 비롯한 구리 (Cu), 크롬 (Cr), 수은 (Hg), 니켈 (Ni), 납 (Pb), 아 연 (Zn) 역시 motility와 velocity가 민감한 변수로 분석되었 다.

E. agilis 운동성 시험의 시험물질에 대한 민감도를 평가 하기 위해 독성 원 영향 평가에 사용된 8개의 중금속 중 E. agilis는 평균 EC₅₀ (velocity 또는 motility)을 기준으로 비교 하였다 (Table 3). 시험물질에 대한 독성이 Ag≃Hg>Cd≃ Cr(IV)>Cu>Pb>Zn>Ni 순으로 E. agilis 운동성 시험은 은 (Ag)과 수은 (Hg)에 대한 민감도가 가장 높으며 아연 (Zn) 과 니켈 (Ni)에 대한 민감도는 낮은 것으로 나타났다. 동일 시험물질에 대한 생태독성 생물 종 및 시험법 간의 독성 민 감도를 비교하기 위해 중금속 시험물질에 대한 E. agilis 운 동성 시험 EC₅₀과 기존 생태독성 실험으로부터 도출된 EC₅₀ (문헌상 자료)을 비교하였다. E. agilis는 비록 유의한 운동성 변수가 E. gracilis와 일치하지는 않았으나 독성민감도는 전 반적으로 유사하였다. 특히 6가 크롬 (Cr (IV))과 아연 (Zn)에 대해 E. agilis의 독성 민감도가 E. gracilis보다 약 5~7배 높 았다. 이와 같은 결과는 생물 종의 차이 또는 시료 노출 시간 그리고 사용된 운동성 반응 측정장비의 차이에서 기인된 것 으로 판단된다. E. agilis 운동성 시험은 D. magna 급성독성 시험과 비교할 때 시험물질에 대한 독성 민감도가 전반적으 로 낮았다. 그러나 수은 (Hg)과 납 (Pb)을 제외한 모든 시험 물질에 대해 V. fischeri보다는 민감한 것으로 나타났다. 특히 카드뮴 (Cd)과 6가 크롬 (Cr (IV))에 대해서는 E. agilis가 V. fischeri보다 약 6배, 아연 (Zn)과 니켈 (Ni)은 약 1.5~2배 정 도 민감하게 반응하는 것으로 측정되었다.

2.현장시료 적용 평가

현장시료에 대한 E-Tox시스템의 적용 가능성을 평가하기 위해 축산폐수 방류수, 도금폐수 방류수, 그리고 도금폐수 1 차 처리수에 대하여 D. magna 유영저해 시험과 E. agilis 운 동성 시험을 수행하여 비교하였다. 물벼룩 24시간 급성독 성시험 결과 축산폐수 방류수, 도금폐수 방류수, 그리고 도 금폐수 1차 처리수의 TU는 각각 0.0, 2.4, 그리고 42.2로 도 금폐수 1차 처리수의 독성이 가장 높았다. 축산폐수 방류수 에 노출된 E. agilis의 운동성 반응 패턴은 대조군과 유사한 반면 도금폐수 방류수는 평균 이동속도 (velocity)와 움직임 (motility)이 대조군에 비해 각각 28.2%와 9.8% 감소하였으 며 도금폐수 1차 처리수에 노출된 E. agilis는 세포의 평균 이동속도 (velocity)와 움직임 (motility)이 대조군에 비해 약 89.9%와 98.0% 감소하였으며 compactness 역시 9.6% 감소 하였다 (Fig. 3). 이와 같은 결과는 D. magna에 무 영향을 나 타낸 축산폐수 방류수는 E. agilis의 운동성 변화를 유발하지 않았으나, D. magna에 급성독성을 유발한 도금폐수 1차 처 리수는 E. agilis의 운동성 역시 저해하였음을 나타낸다.

동일 시험물질 및 동일 시료에 대해 적용된 생태독성 시 험생물 종 및 시험법에 따라 독성영향 및 정도가 상이한 경 우도 있다. 따라서 수질을 관리하고 생태계의 위해성을 평가 하고 예측하기 위해서 다양한 생물 종을 적용하여 평가하는 것이 바람직하다.

Microtox test는 적은 양의 시료 (1 mL 이하)로 신속하게 (5~30분) 독성시험을 수행할 수 있다는 장점이 있으나 시 험생물인 V. fischeri는 해양성 발광박테리아로 분석 시 시료 에 OAS (osmotic adjusting solution)을 첨가해야 하며 구입 시 가격이 비싸고 시험생물을 활성 후 3시간 이내 시험을 완 료해야 하는 단점이 있어 자동분석기에 적용 시 관리에 어 려움이 있다. D. magna 급성 독성시험은 US-EPA와 OECD 의 표준 시험 종을 이용한 국제적으로 통용되는 시험법이라 는 장점이 있다. 그러나 국내 서식하지 않는 외래종으로 분 석 후 국내 수계에 유입되지 않도록 특별한 관리가 필요하고 24시간 후에나 독성의 유무를 인지할 수 있으며 자동분석기 에 적용 시 시험생물을 다루기 어렵다는 단점이 있다. 이에 반해 E-Tox 시스템을 이용한 E. agilis 운동성 시험은 시료 노출 기간 (2분) 및 독성영향 인지 시간 (5분 이내), 자동화된 시스템을 이용하여 적은 시료 (100 μL 이하)에 대해 다양한 종말점 (movement parameters)을 신속하게 평가할 수 있다. 따라서 E-Tox 시스템을 이용한 E. agilis 운동성 반응시험은 자동으로 신속하게 독성분석이 가능하여 실시간으로 수질을 평가하고 생태독성을 모니터링 하는데 적용 가능성이 있을 것으로 판단된다. 향후 다양한 현장시료를 대상으로 분석한 자료를 축적하고 D. magna 생태시험과의 상관관계 분석 및 독성원인 물질탐색시험 분석법이 개발된다면 생태 위해성을 예측하는 시험법으로 활용 가능성이 있을 것으로 판단된다.

적 요

Euglena agilis의 운동성 반응을 자동으로 측정하는 장치 인 E. agilis 시스템 (E-Tox)을 이용하여 8종의 중금속 (Ag, Cd, Cr(VI), Cu, Hg, Ni, Pb, Zn)에 대한 독성시험을 실시하 였다. E. agilis 운동성 시험 (biomonitoring test)으로부터 도 출된 EC₅₀과 문헌상의 자료 조사로 얻은 기존 생태독성 시 험 생물 종들(D. magna, V. fischeri, 그리고 E. gracilis)의 EC₅₀을 비교하여 시험물질에 대한 E. agilis의 독성 민감도 를 평가하였다. 또한 축산폐수 방류수, 도금폐수 방류수, 도 금폐수 1차 처리 시료에 대해 D. magna 급성 독성시험과 E. agilis 운동성 반응 시험을 수행 후 TU를 비교하여 E. agilis 운동성 시험의 현장 적용 가능성을 평가하였다. E. agilis는 시험 중금속에 대해 D. magna보다 독성민감도가 전반적으 로 낮았으나 V. fischeri 또는 E. gracilis와 유사하거나 좀 더 민감하였다. E. agilis는 D. magna test로 유독성으로 판명된 도금폐수 1차 처리수에 대해 신속한 독성반응을 나타내었 다. E-Tox 시스템은 기존의 생태독성시험장비에 비해 빠르 고 작동이 간편한 자동화 기기라는 장점이 있다. 본 연구의 결과 E-Tox 시스템을 이용한 E. agilis 운동성 시험은 향후 독성폐수에 대한 조기경보를 위한 생태독성시험법으로 적용 될 수 있을 것으로 판단된다.