서 론

양계업은 양질의 단백질원 공급을 위하여 닭고기와 달걀 을 생산하는 중요한 축산업 중 하나이다. 전국적으로 2014 년에는 약 1억 8천만 마리 이상의 닭이 사육되었고, 닭 사육 을 위하여 약 9백만 마리 이상의 종계가 사육되었다 (한국양 계협회, Korea Poultry Association). 그러나 부화장에서 많은 달걀이 부화에 성공하지 못하고 폐기되고 있다. 한 달에 20 만개의 달걀을 부화하는 경우에 약 13톤의 폐달걀이 생산되 고 있다. 이 폐달걀은 거의 대부분 매립이나 소각 등으로 폐 기하거나 소량은 처리하여 비료 등으로 재활용한다. 폐달걀 을 처리하기 위하여 2013년에는 전국적으로 약 40억 원 이 상의 비용이 필요하였다 (축산물품질평가원, Korean Institute of animal product Evaluation).

많은 가축의 폐기물이 토양개량을 위해 비료로 사용되고 있다. 폐달걀도 비료를 생산하기 위한 양질의 재료로 이용될 수 있다. 이에 따라 여러 가지 시도가 이루어지고 있다. 특히 미생물을 이용한 폐달걀 처리는 달걀을 분해하여 아미노산 을 생산할 수 있어 액비 등의 생산에 이용할 수 있다. 그러나 이 과정에서 악취가 발생하여 민원이 발생하고 있어 폐달걀 을 비료로 이용하는데 제한 요인이 되고 있다. 대부분 동물 상 폐기물의 악취는 암모니아 또는 황화수소나 메틸메르캅 탄 같은 황 화합물에 의해 발생한다. 이런 악취원은 2005년 제정된 악취방지법의 악취목록에 기재되어있다 (환경부, The Ministry of Environment). 황화수소는 일반적으로 달걀 썩 는 냄새로 표현되고 있고, 다른 두 성분도 악취로 인식되고 있어 폐달걀을 비료로 이용하기 위하여 전환하는 과정에서 이 들 악취를 저감하는 것은 매우 중요하다.

조류, 진균, 세균 등 많은 미생물이 악취를 경감한다고 알 려져 있다 (Yoo et al. 2012). 조류, 진균, 세균이 악취를 저감 한다고 보고되어 있다. 암모니아나 아민계 화합물의 악취경 감을 위하여 Alcaligens fecalis, Vibrio alginoyticus, Arthrobacter sp. Lactobacillus, Bacillus subtilis, Candida rugose, Pichia farinose와 Saccharomyces cerevisiae 등을 이용한 연 구 보고가 있다 (Cha et al. 1999; Ho et al. 2008; Lee et al. 2009). 황 화합물에 의한 악취의 감소를 위하여 Thiobacillus, Pseudomonas, Beggiatoa, Thiotrix, Chlorobium, Chromatium, 그리고 Acidithiobacillus thiooxidans 등을 이용한 연구를 하 였다는 보고가 있다 (Lee et al. 2003; Chen et al. 2004; Kim et al. 2004a). 또한 Corynebacterium spp., Micrococcus spp., Flavobacterium spp., Bacillus spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp.와 Strepococcus spp. 같은 세균이 효과적 으로 악취를 저감하였다는 보고도 있고, Mucor spp., Copinus spp., Helminthosporium spp.와 같은 진균과 효모가 악취를 경감할 수 있다는 보고가 있다 (Kim et al. 2004b; Rappert et al. 2005a; Nakasaki et al. 2006; Yoon et al. 2009; Yan et al. 2013). 이와 같이 여러 미생물이 악취를 저감하기 위하여 이 용되고 있으며, 가축사양농가, 식품생산산업, 화학산업과 오 폐수처리장 등 여러 분야에서 악취저감을 하기 위하여 적용 될 수 있다 (Rappert et al. 2005b; Kim et al. 2008).

최근 예비실험에서 유기화합물을 빠르고 효과적으로 분해 하는 세균, Bacillus amyloliquefaciens를 발견하여 부화장의 폐달걀을 분해하여 비료로 사용하려고 시도하였으나 처리과 정에서 악취가 발생하였다. 그 결과 발생하는 악취를 저감해 야 하는 문제가 발생하여 이를 친환경적으로 해결하기 위하 여 미생물을 이용하는 방법을 모색하게 되었다. S. cerevisiae 는 식물생장을 증진하는 비료로 사용할 수 있다는 보고가 있으며 (Lonhienne et al. 2014), 여러 미생물 중에서 효모를 활용한 악취저감 가능성이 제기되었다. 이에 따라 본 연구는 B. amyloliquefaciens를 이용하여 폐달걀을 분해하는 과정에 서 발생하는 악취물질 저감에 S. cerevisiae가 유용한 효과를 내는지 알아보고자 수행되었다.

재료 및 방 법

1.효모 및 세균 균주

두 개의 효모, Saccharomyces cerevisiae (KACC 30008 와 KACC 30068) 균주는 농촌진흥청 미생물은행 (KACC) 에서 분양 받았다. 효모 균주는 YPD 배지 (yeast extract 10 g, peptone 20 g, dextrose 20 g, agar 15 g, distilled water 1 L) 에 접종하여 25℃에서 배양하여 냉장고에 보관하여 사용하 였다. 사전 예비 실험에서 단백질과 지질 분해능력이 뛰어 난 세균을 토양에서 분리하였고 16S ribosomal RNA gene sequence를 기준으로 Bacillus amyloliquefaciens로 동정된 균주를 세균 균주로 사용하였다. 세균 균주는 trypticase soy agar 배지 (TSA, tryticase soy broth 30 g, agar 15 g, distilled water 1 L, adjust pH to 7.3)에 접종하고 30℃에서 18시간 배 양한 후 냉장고에 보관하여 사용하였다.

2.달걀 현탁액에 대한 균주 처리

효모는 YPD 액체배지 (yeast extract 10 g, peptone 20 g, dextrose 20 g, distilled water 1 L)에서 배양하고, B. amyloliquefaciens는 tryipticase soy broth (tryticase soy broth 30 g, distilled water 1 L, adjust pH to 7.3)에 배양하였다. 폐달걀은 70% 에탄올에 1분간 침지하여 표면 소독을 한 뒤, 껍데기를 제거한 후 살균수에 1 : 4 (v : v) 비율로 잘 섞어 현탁액을 만 들었다. 달걀 현탁액 200 mL를 1000 mL 삼각 플라스크에 분 주한 뒤 B. amyloliquefaciens 배양액 4 mL를 접종하였다. 효 모 처리구는 세균을 접종한 플라스크에 효모배양액 4 mL를 추가로 접종하였다. 접종한 달걀 현탁액은 실온에서 rotary shaker에 놓고 150 rpm으로 7일간 배양하였다. 모든 처리는 3반복을 시행하였다

3.달걀 펩타이드의 변화 분석

세균을 처리하여 배양한 달걀 현탁액의 펩타이드의 변화 를 분석하기 위해 SELDI-TOF MS로 분석하였다. 각각 강한 음이온과 약한 양이온 교환자인 Q10 and CM10 단백질 칩 으로 달걀 현탁액을 분석하였다. 현탁액을 4℃, 13000×g에 서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하여 syringe filter (0.45 μm, Whatmann, USA)로 여과한 뒤 단백질 칩에 점적하였 다. 단백질 칩 어레이는 다음과 같이 준비하였다 (Park et al. 2013). 여과한 시료 (100 μL)는 binding buffer (단백질 칩의 종류에 따라 각각 다름, Q10은 pH 9.0의 10 mM Tris, 그리고 CM10은 pH 4.0의 100 mM sodium acetate)를 사용하여 10 배로 희석하였다. Q10과 CM10 어레이는 시료를 점적하기 전 2×200 μL의 binding buffer로 5분간 미리 평형시켰다. 시 료를 점적한 후 binding buffer로 각각 5분간 3회 세척하고 물로 2회 세척한 다음 30분 동안 건조하였다. 그리고 50% C2H3N (acetonitrile)과 0.25% C2HF3O2 (trifluoroaceticacid) 이 포함된 1 μL의 2×50% 포화된 CHCA 용액을 점적한 뒤 완전히 건조하여 SELDI-TOF MS로 분석하였다. 준비한 단 백질 칩 어레이는 SELDI-TOF MS (Bio Rad, USA)을 사용 하여 분석하였다. 각각의 시료에 대하여 3반복을 실시하였 다. 검출된 피크 분석은 Protein Chip Data Manager Software (Bio Rad, USA)를 이용하여 분석하였다.

4.냄새 분석

분해된 달걀에서 발생하는 암모니아, 황화수소 그리고 메 틸메르캅탄을 측정하였다. 암모니아 가스는 휴대용 가스측정 기 (GV-110S, Gastec, Japan)과 검지관 3 L (Ammonia detector tube, Gastec, Japan)를 사용하여 측정하였다. 측정 전에 플라스크를 세게 흔들고 검지관을 플라스크 입구와 마개 사 이로 삽입하여 검지기 제조사의 측정방법에 따라 측정하였 다. 황화합물인 황화수소와 메틸메르캅탄은 암모니아 시료 채취방법과 동일하게 10 mL의 GC용 시료채취 주사기를 사 용하였고 시료를 측정하기 적당한 농도로 희석하였다. 시 료는 pulsed flame photometric detector (PFPD)와 thermal desorption unity (Unity 2, Airserver, Markes, UK)를 장착한 gas chromatograph (GC, 6890N, Agilent, USA)를 사용하여 분석하였다. 분석조건은 Table 1과 같다.

5.통계분석

실험결과는 SAS (Statistic Analysis System, Version 9.02) 프로그램을 사용하여 ANOVA를 통하여 분석하였다.

결과 및 고 찰

CM10과 Q10 단백질 칩을 사용하여 SELDI-TOF MS로 분석한 달걀 현탁액의 펩타이드 스펙트럼이 각각의 처리에 따라 다르게 나타났다 (Fig. 1). 미생물을 사용하여 분해한 달 걀의 저분자 스펙트럼 패턴이 약 5000 D의 범위에서 무처 리 대조구의 저분자 펩타이드 패턴에서는 없던 피크가 각각 의 단백질칩에서 나타났으며, 저분자 펩타이드 스펙트럼에 서 대조구의 피크 패턴과 각 처리구의 피크 패턴이 달랐다. 이와 같이 다른 피크 패턴은 달걀의 단백질 분해와 미생물 의 대사과정에서 생산된 저분자 펩타이드로 인해 나타나는 것으로 생각된다. 또한 미생물에 의하여 처리되며 달걀의 단 백질이 작은 저분자 펩타이드로 분해된 것을 확인할 수 있 었다. 물론 이 피크 패턴에서 세균과 효모의 냄새에 대한 상 관관계를 보여주는 패턴의 변화는 관찰되지 않았지만 이 미 생물을 사용하여 분해된 폐달걀 현탁액으로 시비하여 고추 와 토마토 등 식물을 재배하였을 때 시판 아미노산 액비와 동일하거나 더 좋은 식물생장 증진효과를 보였고, 다른 피해 는 나타나지 않았다 (Lee et al. 2016). 이러한 결과는 효모 S. cerevisiae가 이미 식물생장을 증진하는 비료로 사용하고 있 다는 사실에 비추어 볼 때 (Lonhienne et al. 2014), 효모의 악 취 제거 효과만 확인된다면 폐달걀을 처리하여 비료를 생산 하는데 매우 효율적인 처리 미생물로 효모를 사용할 수 있 는 가능성을 제시한다. 이에 따라 효모의 악취제거 효과를 검정하기 위해 암모니아, 황화수소, 메틸메르캅탄 등의 발생 을 감소시키는지 조사하였다.

달걀 현탁액을 B. amyloliquefaciens로 7일간 분해하였을 때 발생한 암모니아는 1.75 ppm이었고, B. amyloliquefaciens 와 S. cerevisiae KACC 30008과 KACC 30068 균주를 각각 같이 접종하였을 때는 암모니아 발생량이 두 균주 모두 각각 1,13 ppm으로 세균만을 사용하여 분해하였을 때의 64.6% 였다. 또한 세균과 두 개의 효모 균주를 동시에 사용하였을 때는 0.75 ppm이 발생하였는데 이는 세균만 사용했을 때의 42.9% 수준으로 감소하였다 (Fig. 2). 이 같은 결과는 효모를 사용함으로써 세균으로 달걀을 분해할 때 발생하는 암모니 아의 발생을 감소시킬 수 있음을 보여준다. 황화수소의 경우 세균만 접종하여 달걀을 분해하였을 때 7일 후 발생농도는 58.88 ppm이었고, 효모 KACC 30008과 KACC 30068을 세 균과 동시에 접종하였을 경우 발생농도는 각각 34.16과 5.69 ppm으로서 세균만 처리하였을 때에 비하여 58%와 9.6% 수 준으로 각각 감소하였다. 두 개의 효모 균주를 같이 접종하였 을 경우 농도는 0.87 ppm으로 세균만 사용했을 때보다 1.5% 수준으로 감소되었다 (Fig. 3). 세균인 B. amyloliquefaciens을 사용하여 7일 동안 분해한 달걀에서는 15 ppm의 메틸메르캅 탄이 발생하였고, 세균과 함께 효모 KACC 30008과 KACC 30068을 접종한 경우 각각 15와 9 ppm으로 세균만 사용했 을 때와 비교하여 100%와 60% 수준이었다. 세균과 두 개의 효모 균주를 동시에 사용한 경우는 메틸메르캅탄 발생량이 5 ppm으로 세균만 사용한 경우에 비하여 33.3% 수준으로 더욱 감소하였다 (Fig. 4). 이러한 결과는 본 실험에서 사용한 두 효모 균주 모두 달걀의 분해과정에서 발생하는 악취 원 인 물질을 감소시키는데 효과가 있음을 보여준다. 특히 달걀 썩는 냄새로 일컬어지는 황화수소의 경우 효모의 사용은 현 저하게 냄새를 저감하였음을 알 수 있었다. 그러나 두 균주 중에서 KACC 30068 균주가 KACC 30008보다 더 효과적으 로 냄새를 감소하였는데 이는 균주에 따라 감소 정도가 다 를 수 있음을 보여준다. 이상의 결과를 종합하면 본 연구에 서는 S. cerevisiae가 달걀의 분해과정에서 발생하는 악취를 효과적으로 감소시키고, B. amyloliquefaciens와 함께 달걀에 처리하였을 때 달걀 분해를 방해하지 않았음을 확인하였다.

적 요

부화장에서 폐기하는 달걀을 Bacillus amyloliquefaciens 를 이용 분해하여 비료화하는 데 있어 발생하는 악취는 폐 기물 처리에 있어 중요한 제한요소 중 하나이다. 이런 문제 를 해결하기 위하여 두 개의 효모, Saccharomyces cerevisiae KACC 30008와 KACC 30068를 사용하여 실험하였다. 효모 균주는 모두 세균만을 사용하여 분해 처리하였을 때보다 섞 어서 사용한 경우 암모니아 발생을 약 35.4% 감소하였고, 두 균주를 같이 섞어 사용한 경우는 57.1% 감소시켰다. 두 균주 는 황화수소 또한 42%와 90.4%씩 각각 감소시켰고, 동시에 두 균주를 같이 사용했을 때에는 황화수소 발생을 98.5% 감 소시켰다. 메틸메르캅탄의 경우 KA30008은 감소시키지 못 하였으나 KA30068은 40%, 두 균주를 함께 사용한 경우는 66.7% 감소시켰다. 전체적으로 본 연구는 효모의 처리가 B. amyloliquefaciens를 사용하여 폐달걀 분해 시 악취 발생을 저감하는 효과를 더 증진시킴을 보여주었다.