서 론

옥수수는 벼과의 한해살이 식물로 벼, 밀과 함께 세계 3대 중요 작물 중 하나로서 광합성 효율이 높은 C4 식물이기 때 문에 단위 면적당 생산량이 매우 높은 작물이다 (Varshney et al. 2012). 국내 옥수수 품종은 집단 선발을 통한 방임수 분에서 교잡을 통한 복교잡종 품종이 개발되었으나 최근에 는 잡종강세가 우수한 단교잡종 품종이 개발되기 시작하였 다 (Bernardo 1996; Troyer 1999; Park et al. 2009; Kim et al. 2014).

옥수수에서 잡종강세 (mid-parent heterosis, MPH) 및 부모 의 유전적 다양성에 대한 양적관계가 밝혀지면서 (Paterniani and Lonnquist 1963; Moll 1965) 계통과 개체군 내에서의 유 전적 다양성 정보는 옥수수 교잡종 개발에도 매우 중요하다 (Makumbi et al. 2011). 또한 옥수수에 분자마커를 이용하 여 유전적 거리 (genetic distance, GD)와 교잡종의 관계를 분 석하는 연구가 보고되었다 (Lee et al. 1989; Godshalk et al. 1990; Smith et al. 1990; Betrán et al. 2003). 최근에는 기후 변동에 대한 환경 스트레스의 대안으로 한발 스트레스와의 연관성 및 내성의 연구 필요성이 제기되고 있다. 옥수수의 경우 개화기에 한발 스트레스를 받을 경우 일반적으로 ASI (anthesis-silking interval)가 증가한다고 보고 되어있다 (Anderson et al. 2002). ASI는 암꽃과 수꽃의 개화일 차이로 산 정하며 ASI가 증가하면 수정률이 떨어져 수확량 감소를 초 래하게 된다. 따라서 ASI는 수확량과 매우 밀접하게 연관된 요인으로 한발 스트레스에 대한 지표로서 사용된다 (Smith et al. 2004). 이러한 한발 스트레스를 극복하기 위해 우수한 자식 계통의 개발이나 유전적 다형성에 대한 관심이 높아지 고 있다. 옥수수 수집 유전자원들의 유전적 다양성이나 계통 간의 유연관계는 옥수수의 한발 스트레스를 극복하기 위한 자료로 이용될 수 있다 (Lee and Tracy 2009; Kim et al. 2014).

과거 옥수수 유전자원간의 계통유전관계는 형태학적 형 질로 평가되었으나 (Goodman and Bird 1977), 오늘날 형태 학적 특징은 제한적인 평가요인, 환경적인 영향, 낮은 다형 성 및 유전율 등의 다양한 이유로 유전적 다양성 연구에 비 해 선호도가 낮다 (Smith and Smith 1992). 반면 DNA 마커 는 앞서 언급한 형태학적 특징의 제한요인을 가지지 않으 므로 유전적 특징 및 다양성 연구에 이용되고 있다 (Saker et al. 2005; Souza et al. 2008). 또한, 분자마커는 옥수수 유 전자형의 계통유전관계 분석에도 주로 이용되고 있으며, 이 것은 매우 정확하고 효율적인 분석방법으로 보고되고 있다 (Dubreuil et al. 1996; Smith et al. 1997; Ajmone-Marsan et al. 1998; Senior et al. 1998; Van Inghelandt et al. 2010). 옥수 수의 유전적 다양성 관련 연구에는 주로 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 및 SSR (Simple Sequence Repeats) 마커가 사용되고 있다. Melchinger et al. (1992)는 RFLP 마커를 이 용하여 교잡종의 유전적 거리를 측정하고 수확량을 예측하 였다. 또한 RFLP 마커를 사용하여 40개의 교잡종의 유전적 유사성을 분석하였고 이미 알려진 계통 정보와 일치하는 것 을 확인하였다 (Livini et al. 1992). 온대, 열대 및 아열대 옥 수수 유전자원 중 대표적인 770개 교잡종의 관계 패턴 및 집단구조 (population structure)를 SNP 마커를 이용하여 분 석하였다 (Lu et al. 2009; Semagn et al. 2012). 또한, SNP 마 커는 유전적 다양성 분석을 포함한 옥수수 품종 향상 등 다 양한 분석방법에 이용되고 있다 (Lu et al. 2009). SSR 마커 를 이용한 분석법은 재현성이 매우 뛰어나고 유전체 전반에 걸쳐 대립인자들이 풍부하게 분포되어 있기 때문에, 대립유 전자의 특징을 명확하게 나타낼 수 있어 유전적 다양성 연 구에 적합하다 (Smith et al. 1997; Heckenberger et al. 2002; Warburton et al. 2002; Warburton et al. 2008). 또한 SSR 마커는 PCR (Polymerase chain reaction) 기법을 기반으로 agarose gel 전기영동 방법으로 대립유전자의 분석이 가능 하기 때문에 시간절약 및 비용절감이 장점이다 (Senior et al. 1998; Pinto et al. 2003).

다른 작물에서는 작물의 형질을 향상시키기 위해 이형집단 쌍 (heterotic pairs)의 분석을 유전적 다양성 연구에 이용하였 다. Melchinger and Gumber (1988)는 분자 마커를 기반으로 유전적 거리를 분석하여 옥수수 이형집단 풀 (heterotic pool) 구축에 대한 연구를 수행하였다. 또한 옥수수 이형집단 그룹 을 식별하기 위한 SSR 마커의 기능은 다양한 연구에서 보고 되었다 (Reif et al. 2003; Barata and Carena 2006). 한편, 작물 의 개체군 내에서 유전적 다양성은 환경적 변화와 시장 수요 를 모두 충족시킬 수 있다 (Nassiry et al. 2009). 작물을 육종 하는데 있어 유전적 다양성은 품종의 유전적 변동성을 분석, 분자육종 기초 기술을 이용한 다양한 유전자원으로부터 유 용한 유전자의 이입 및 자식 계통의 선발에 매우 중요하다 (Smith et al. 1984; Barrett et al. 1998; Thompson et al. 1998).

본 연구에서는 다양한 옥수수 교잡종별 유전적 다양성과 대표적 환경 스트레스인 한발에 관한 형질을 비교분석하고, 교잡종의 관계 패턴 분석과 국내 유전자원과 해외 유전자원 의 유전적 다양성을 탐색하고자 한다.

재료 및 방 법

1.옥수수 품종 선발

한발 스트레스에 대한 표현형 분석을 하기 위해 NAM (Nested Association Mapping) parent line 16개 (B73, CML 103, CML228, CML247, CML277, CML322, CML333, CML69, Ki11, Ki3, Ky21, M37W, Mo18w, NC350, Oh43 및 Tx303), 국내 품종 4개 (강다옥, 광평옥, 청다옥 및 평안옥), 동남아시아 품종 1개 (DK9955)를 사용하였다. NAM 집단은 QTL mapping의 통계적인 분석과 association mapping, 계통 분석을 통해 다양한 형질에 대한 연구를 수행할 수 있는 옥 수수 집단이다 (Kim et al. 2014). 따라서 한발 내성연구가 되 어있는 Ki3 (한발 감수성) 및 Ki11 (한발 내성)을 기준으로 하여 국내 품종과 동남아시아 품종을 비교 분석하였다.

2.DNA 추출

옥수수 genomic DNA는 Riede and Anderson (1996)의 방 법을 변형한 extraction buffer [100 mM Tris-HCL pH 8.0, 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, 0.84% SDS, 0.38% (wv^-1) sodium bisulfate]를 이용한 추출법으로 성숙기 옥수수의 어린잎에서 추출하였다. 옥수수 genomic DNA를 추출한 후 NanoDrop spectrophotometer (Maestrogen, 275 South Eastern, Las Vegas, USA)와 1% agarose gel을 이용한 전기영동으로 genomic DNA의 순도를 측정하였고 - 20℃에 보관하여 실험에 사 용하였다.

3.한발 스트레스 처리 및 표현형 분석

옥수수 유묘기와 성숙기에 한발 스트레스를 처리하여 잎 말림과 ASI를 분석하였다. 유묘기 잎말림은 60×40×20.5 cm 화분에 질석 (vermiculite) 30 L를 넣고 물을 포장용수량 까지 공급한 후 9×11.5 cm의 재식밀도로 파종하였다. 토양 수분함량은 WT1000N (Mirae Senser Inc., Seoul, Republic of Korea)을 이용하여 측정하였으며, 세 차례 측정한 후 평 균값으로 산정하였다. 화분의 토양수분함량은 15~25%로 유지하였으며 실험구의 경우 3엽기 이후 수분 공급을 중단 하여 한발 스트레스를 처리하였다 (Song et al. 2015). 수분공 급중단 6일 이후 토양수분함량은 10%로 약한 한발 스트레 스, 16일 이후 5%로 극심한 한발 스트레스 수준에 도달하였 다. 잎말림 평가는 CIMMYT의 잎말림 평가기준을 참고하였 다 (Bänzinger et al. 2000). 각 잎 별로 잎말림을 평가하였으 며, 평가 기준은 Fig. 1과 같다. 1단계는 정상적인 잎, 2단계 는 약한 잎말림, 3단계는 잎이 V 형태로 바뀌는 것, 4단계는 잎의 가장자리가 서로 닿은 것, 5단계는 양파처럼 잎이 말린 것으로 평가하였다.

옥수수 성숙기 ASI 평가는 비가림 하우스에 21개 품종을 대조구와 실험구로 나누어 37×37.5 cm (20 L) 화분에 상토 (식물세계, 농우바이오)를 가득 채우고 각각 파종하였다. 토 양수분함량은 20~25%로 유지하였으며 지엽에 웅수가 잡 히는 순간부터 실험구의 수분공급을 중단하였다. 수분 중단 4~5일이 경과하였을 때 토양수분함량 7% 미만에 도달하였 다. 실험구의 토양수분함량은 7%로 유지하며 한발 스트레스 를 처리하였다. 밑거름은 20 : 15 : 15 kg/10 a (N : P₂O₅ : K₂O) 로 시비하였으며, 파종 후 45일이 경과하였을 때 웃거름을 시비하였다.

4.QTL 마커 수집 및 다형성 분석

한발 스트레스 관련 QTL 마커들은 Plant Stress (http:// www.plantstress.com/files/qtls_for_resistance.htm)에 공개되 어 있는 SSR 마커 또는 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) probe를 이용하여 수집되었으며, 해당 마커 의 프라이머 정보는 MaizeGDB (www.maizwgdb.org)를 이 용하여 디자인 되었다. 총 142 프라이머 세트가 제작되어 41 개의 수집종에 대하여 유전적 다양성을 분석하였다. QTL screening은 abm^TMTaq DNA polymerase (Applied Biological Materials Inc, Richimond, BC, Canada)를 이용하여 GeneTouch^TM thermal cycler (Bioer Technology Ltd, Hangzhou, Zhejiang province, China)로 증폭하였다. PCR (33 cycle의 94°C 1분, annealing temperature 30초, 72°C 1분) 증 폭 후 1.5% agarose gel에서 polymorphism을 분석하였다.

5.데이터 분석

1)군집분석 (Cluster analysis)

QTL 분석결과 얻어진 밴드를 대상으로 “0” (absence), “1” (presence)의 이진법 데이터로 전환하여 분석에 임하였 다. 각 품종 간 유전적 근연도는 Dice (1945)의 유사성 계수 [Sxy=2Nxy/(2Nxy+Nx+Ny), Sxy: sample x, sample y 사 이의 similarity coefficient, Nxy: x, y 모두에 나타난 동일한 band 갯수, Nx: x에 나타난 band 갯수, Ny: y에 나타난 band 개수; DICE]를 이용하여 조사한 후, similarity matrix를 만 들었다. Similarity matrix는 NTSYS v.2.11L의 Sequential, Agglomerative, Hierarchical and Nested clustering, SAHN (Sneath and Sokal 1973) 프로그램에서 UPGMA 분석을 사 용하여 같은 프로그램의 TREE module을 이용하여 dendrogram을 만들었다.

2)다차원척도법 (Multi-Dimensional Scaling: MDS)

각 개체들 간의 상대적인 거리를 2차원적 평면 상에 상대 적 거리로 나타내기 위하여 다차원 척도법을 활용하였다. 상 대적 거리의 계산은 NTSYSpc 2.1을 이용하였으며, 계산된 두 거리 사이의 적합도를 측정하는 통계치인 stress는 다음 의 식에 의해 계산되었다.

Stress 1 = ∑ ( d i j ∗ − d i j ^ ) 2 ∑ d i j ∗ z Stress 2 = ∑ ( d i j ∗ − d i j ^ ) 2 ∑ ( d i j ∗ − d ∗ ¯ ) 2

결과 및 고 찰

1.유묘기 잎말림 평가

본 연구에서는 유묘기에 한발 스트레스를 처리하여 잎말 림 정도를 평가하였다. 옥수수 유묘기를 이용한 실험은 시간 적, 공간적 및 경제적으로 매우 효율적인 방법이다 (Meeks et al. 2013). 유묘기에 한발 스트레스를 처리하고 뿌리 형성능 력을 평가하였을 때, 수확량 및 작물의 생장과 연관되어 있 다고 보고 되었다 (Eghball and Maranville 1993; Pandey et al. 2000a, b). 또한 한발 감수성 옥수수가 유묘기에 한발 스 트레스를 받을 경우 세포주기와 세포분열에 관련된 유전자 의 발현이 억제되고 ABA 및 cell death와 관련된 유전자의 발현이 증가한다고 보고 되었다 (Min et al. 2016). 따라서 유 묘기에 극심한 한발 스트레스를 받을 경우 식물체가 죽어버 리거나 수확량이 감소하는 결과를 초래할 수 있다.

유묘기 잎말림 평가는 각 식물체의 3엽이 활착하였을 때 수분 공급을 중단하였는데 약 10%의 약한 한발 스트레스에 도 1엽의 경우 금방 괴사해버리는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 토양수분함량 7% 미만의 심한 한발 스트레스를 처리 하고 1엽을 제외한 2, 3엽의 잎말림 지수를 평가하였다 (Fig. 2). 잎말림 지수를 평가한 결과 CML228, DK9955, Ki11, CML69, 평안옥, CML322, CML103 및 강다옥은 2.5 미만 의 수준을 보였다. 반면, CML277, Ki3, Mo18w CML333, Ky21, Tx303, 청다옥, Ms71, CML247, M37W, 광평옥, B73 및 NC350은 2.5 이상으로 평가되었다. 한발에 내성이 있는 것으로 알려진 Ki11, 감수성으로 알려진 Ki3 및 B73을 기준 으로 평가하였을 때, 유묘기 잎말림 지수를 이용한 한발 내 성평가 결과가 기존에 알려진 평가와 유사한 경향을 보이 는 것을 확인할 수 있었다 (Udomprasert et al. 2005). 한발 처 리 후 수분 재공급을 통한 회복능력을 평가해본 결과 5단계 에 도달할 경우 잎이 전체적으로 괴사가 진행되어 회복이 불가능하였고, 4단계에 도달할 경우 잎의 일부가 괴사되었 지만 잎말림은 점차 회복되었다. 반면 2, 3단계에 도달한 잎 의 경우 서서히 회복되어 정상적인 잎 수준에 도달하였다 (Song et al. 2015). 따라서 2 미만의 잎말림 수준을 보이는 CML228, DK9955 및 Ki11의 경우 유묘기 한발 내성을 갖 는다고 평가할 수 있다. 반면, 3 이상의 잎말림 수준을 보이 는 CML247, M37W, 광평옥, B73 및 NC350의 경우 유묘기 한발 감수성을 갖는다고 평가할 수 있다.

2.ASI 분석

본 연구는 성숙기의 한발 스트레스에 대한 ASI 변화를 분 석하였다. 국내 품종과 동남아시아 품종의 경우 NAM parent line에 비해 초장이 길고 지상부의 생체중이 많이 나가지만 ASI는 각 품종별로 상이한 것을 확인할 수 있었다. 한발 스 트레스를 처리하였을 때, 한발 내성 품종으로 알려진 Ki11의 경우 2.75일 증가하였고 한발 감수성 품종으로 알려진 Ki3 의 경우 10.06일 증가한 것으로 조사되었다 (Fig. 3). 일반적 으로 한발 스트레스를 처리할 경우 ASI는 대략 3~7일 증 가한다고 보고 되었다 (Anderson et al. 2002). 또한 ASI가 3 일에서 11일로 증가할 경우 수확량이 71% 감소한다고 보 고 되었다 (Hall et al. 1981). 따라서 한발 스트레스를 처리 했을때 ASI가 5일 이하이고 대조구에 비해 실험구의 ASI 가 3일 이하로 증가한 CML228, CML103, 청다옥, NC350, B73, CML322, 광평옥 및 Ki11은 수확량의 큰 변화를 보이 지 않을 것으로 평가된다. 반면, 한발 스트레스를 처리 했을 때 ASI가 10일 이상이고 대조구에 비해 실험구의 ASI가 8 일 이상 증가한 CML69, Ki3, 평안옥, M37W, Mo18w 및 강 다옥은 수확량이 크게 감소할 것으로 평가된다. 옥수수 한발 평가는 궁극적으로 실험구와 대조구에서 유사한 수준의 수 확량을 얻는 것이 목표라고 할 수 있다. 따라서 한발 스트레 스를 처리했을때 ASI가 5일 이하이고, 대조구에 비해 실험 구의 ASI가 3일 이하로 증가했다면 한발 내성 품종, ASI가 10일 이상이고 대조구에 비해 실험구의 ASI가 8일 이상 증 가했다면 한발 감수성 품종으로 평가할 수 있다. B73의 경 우 한발 감수성 품종으로 알려져 있지만, 한발 스트레스를 처리해도 ASI가 5일 미만을 보이고 대조구에 비해 1.5일 증 가한다고 보고 되었다 (Sari-Gorla et al. 1999; Gonzalo et al. 2006). 따라서 B73은 잎의 노화, 주당 이삭수, 100립중 및 수 확량 등 다양한 요인을 이용한 한발 내성 평가를 수행해야 할 것으로 보인다.

21품종의 한발 스트레스 상황에서의 유묘기 잎말림과 ASI 값을 2차원 평면으로 분석하였다 (Fig. 4). 한발조건에서 의 유묘기 잎말림과 ASI 값 간의 상관분석 결과 피어슨 상 관계수값은 - 0.006으로 서로 연관이 없는 독립적인 특성인 것으로 나타났다. 21품종 중 내성 품종을 선발하기 위하여 한발 내성 품종으로 알려진 Ki11 품종을 중심으로 유묘기 의 잎말림 지수 1.87과 생식생장기의 ASI 지수 2.25 윗부분 을 기준선으로 삼아 4분면을 구성하였다. 그 결과 CML228, Ki11 및 CML322가 한발 내성을 지니고 있는 것으로 평가 되었다.

3.QTL 마커 screening

한발 스트레스 관련 QTL 마커를 활용하여 옥수수 수집 종 간의 유전적 근연관계를 검정하기 위하여 142개의 QTL 마커를 활용하여 분석하였다 (Fig. 5). 사용된 QTL 마커는 전반적으로 염색체에 널리 분포되어 있으나 특히 3번 염 색체에 집중적으로 분포되어 있는 것으로 확인 되었다. Polymorphism을 보이는 밴드를 바탕으로 각 계통 간 근연 관계를 덴드로그램으로 나타내면 Fig. 6과 같다. Fig. 6에서 coefficient 값 0.076을 기준으로 3개의 그룹으로 나눌 수 있 다. CML103과 M37W가 속한 그룹과 CML333이 속한 그 룹, 그리고 나머지 18개의 수집종이 한 그룹으로 나뉘어진 다. NAM parents line인 B73, Ki11, Ms71, Ky21과 동남아시 아 계통인 DK9955는 국내 품종인 강다옥, 광평옥, 청다옥, 평안옥과 매우 가까운 유전적 유사성을 보이며, 이 결과는 Fig. 7의 다차원 척도법에 의한 평면상에서 더욱 두드러진 다. Fig. 7에서처럼 국내품종은 산포도가 작으며, 덴드로그램 과 유사한 결과를 보인다.

유묘기 잎말림, ASI를 통하여 한발 내성으로 선발된 CML228, Ki11 및 CML322 중 CML228과 CML322는 국내 품종과의 산포도가 높으나 Ki11은 매우 가까운 관계를 보여 주고 있기 때문에 한발에 대한 내성 품종인 Ki11의 유전적 특징을 국내 품종에 활용하는 것이 가능할 것으로 사료된다.

적 요

본 연구에서는 21개 국내외 옥수수 수집종에 대한 유묘기 와 성숙기의 대표적 환경 스트레스인 한발 스트레스에 대해 반응하는 형태적, 유전적 근연관계를 분석하였다. 유묘기 잎 말림은 5단계로 나누어 평가하였으며, ASI는 수염이 출사하 기 시작한 날과 화분이 비산하기 시작한 날의 차이로 산정 하였다. 유묘기 잎말림의 경우 4 이상의 수준을 보이면 회복 이 불가하며 2, 3 정도의 수준은 정상적인 잎으로 회복이 가 능하다. 따라서 유묘기 잎말림이 2 미만의 수준을 보인다면 한발 내성 품종으로 평가할 수 있다. 또한, ASI는 한발 스트 레스를 처리할 경우 3~7일 증가한다고 보고 되었으며 ASI 가 3일에서 11일로 증가할 경우 수확량이 71% 감소한다고 보고 되어있다. 따라서 한발 스트레스를 처리했을때 ASI가 5일 이하이고, 대조구에 비해 실험구의 ASI가 3일 이하로 증가했다면 한발 내성 품종으로 평가할 수 있다.

한발조건에서의 유묘기 잎말림과 ASI 간의 상관분석 결과 피어슨 상관계수값은 - 0.006으로 서로 연관이 없는 독립적 인 특성인 것으로 나타났다. 21품종 중 한발 내성 품종 선발 결과 CML228, Ki11 및 CML322가 높은 한발 내성을 지니 고 있는 것으로 평가되었다. CML228과 CML322는 국내 품 종과의 산포도가 높으나 Ki11은 매우 가까운 관계를 보여주 고 있기 때문에 한발에 대한 내성 품종인 Ki11의 유전적 특 징을 국내 품종에 활용하는 것이 가능할 것으로 사료된다.