서 론

현재, 원자력 발전소는 전 세계적으로 442기가 가동 중이 며, 원자력 발전소에서 생산하는 에너지 비율은 전체 에너지 생산의 13.5%를 차지하고 있다 (Davis 2012). 한국은 2015년 기준으로 원자력 발전 비율이 총 에너지 생산량의 31.3%를 차지하고 있다. 원자력 발전은 화력 발전소에 비하여 이산 화탄소 (CO₂), 황산화물 (SO_x), 질소산화물 (NO_x)을 배출하지 않는 친환경 발전이며 전력 생산 가격이 저렴하고 경제성이 매우 높아 안정적 전력의 공급 확보, 기후변화로 인한 이산 화탄소 감축 대응을 위한 지속가능한 에너지원으로 개발되 고 있다. 원자력 발전의 가장 큰 장점 중 하나는, 원자력 발 전소의 원료인 우라늄이 세계 전역에 고르게 매장되어 있어 세계의 에너지정세에 크게 영향을 받지 않으며, 에너지 밀 도가 높아 소량의 우라늄으로도 막대한 에너지를 생산할 수 있다는 점이다. 또한, 지속적인 경제성장에 의해 에너지소비 가 증가함에 따라 원자력 발전을 통한 에너지 생산 비율은 더욱 더 증가할 것이며 원자력 발전소 의존도는 더욱 심화 될 것으로 예측된다 (Budnitz 2016; Lee 2016). 그러나, 전 세 계적으로 원자력 발전소의 꾸준한 증가율에 비해 발전소의 부산물인 방사성 폐기물 (radioactive waste)을 처리할 수 있 는 처리시설의 공간적 한계에 직면하고 있으며, 이에 환경 친화적이면서도 효율적인 폐기물 처리방법의 개발이 시급한 사회적 문제로 대두되고 있다 (Gallegos and Bonano 1993). 방사성 폐기물은 방사능 준위에 따라 고준위 방사성 폐기물 과 중·저준위 방사성 폐기물로 구분할 수 있다 (Sung et al. 2008). 고준위 방사성 폐기물은 원자로 반응 후 사용하고 남 은 핵연료 등이며 95% 이상을 재활용할 수 있기 때문에 폐 기물로 간주되지 않는다. 중·저준위 방사성 폐기물은 원자 력 발전소를 가동할 때 사용한 의복, 각종 부품, 관련 산업체 및 병원에서 나오는 폐기물로 전용 철제 드럼통에 고정시켜 폐기물 저장소에 보관하여야 한다 (Gershey et al. 1990). 한국 에서 연간 발생하는 중·저준위 방사성 폐기물은 연간 700 톤이며, 한국수력원자력에 따르면 현재 방사성 폐기물 저장 률은 고리 원자력 발전소 82%, 한빛 원자력 발전소 60%, 월 성 원자력 발전소 78.4%, 한울 원자력 발전소 65.8%이다. 이에 2019년부터 각 원자력 발전소의 방사성 폐기물 저장률 이 한계치에 도달할 것으로 예상하고 있다 (Cho et al. 2008). 따라서 재활용이 가능한 고준위 방사선 폐기물과 달리 재활 용이 불가능한 중·저준위 방사성 폐기물 처리에 대한 연구 의 필요성이 증대되고 있다 (Pitman and Sargood 1990). 대표 적인 방사선 폐기물 처리 방법은 공결정화법, 침전법 및 파 이로프로세싱 방법 등이 있다 (Roberts 1990). 하지만, 위 방 법들은 상대적으로 분리 비용이 높고, 공정이 복잡하며 2차 폐기물의 생성, 기기 부식 등의 제반 문제점이 있다 (Lee et al. 2010). 따라서, 이러한 공정들의 문제점을 극복하기 위하 여 처리가 용이하고, 경제적이면서 빠른 증식으로 인하여 높 은 회수율을 가지는 균주 (algae, bacteria, fungi)를 이용한 친환경 흡착 (biosorption) 제거를 통한 방사성 폐기물 처리 방법이 새롭게 주목받고 있다 (Williams 1960; Harvey and Patrick 1967; Brookshaw et al. 2016). 균주의 세포벽은 인산 기 (PO₄^3-), 카르복실기 (COOH^-) 및 수산기 (OH^-)로 이루어 져 있으며 (Lovley et al. 1991; Ahimou et al. 2007), 음전하 를 띠므로 양이온인 방사성 핵종 원소 (radionuclide)와의 상 호작용을 통해 흡착 및 침전 반응을 일으킨다 (Beazley et al. 2007; Shim et al. 2010; Shim et al. 2011). 이와 같이 균주들 의 대사작용을 통하여 방사성 핵종 원소들의 화학적 형태와 물리적 거동을 변화시켜 방사성 핵종 원소의 이동을 지연 및 차단시킬 수 있는 매개체로 이용이 가능하다 (Fisel et al. 1976; Shoda et al. 1980; Strandberg et al. 1981; Choudhary and Sar 2011).

대표적인 방사성 폐기물인 핵분열생성 핵종 세슘-134 (¹³⁴Cs), 세슘-135 (¹³⁵Cs), 세슘-137 (¹³⁷Cs)의 반감기 (half-life) 는 각각 2.1년, 230만년, 30년의 긴 반감기를 갖는다 (Avery 1995; Dekker et al. 2014). 또한, 높은 용해도 (water solubility) 와 1가 세슘 이온 (monovalent cesium ion)의 생물학적 이용 도 때문에 중요한 핵 분열 폐기물로 취급되고 있다. 무엇보 다, 세슘은 생체 필수 원소인 칼륨 (K⁺)과 화학적 거동이 유 사하기 때문에 유기체 (organism) 내부로 쉽게 흡수/축적되 어 토양 및 해수 등에 치명적인 환경 오염 및 파괴를 일으키 며 최종적으로 인간을 장시간 피폭시켜 심각한 질병의 원인 이 된다 (Nishita et al. 1978; Bossemeyer et al. 1989; Avery 1995; Mosquera et al. 2006; Chakraborty et al. 2007). 이러 한 세슘의 생물학적 특성을 이용하여 최근에 다양한 균주를 이용한 세슘 제거 연구가 진행되고 있다 (Ivshina et al. 2002; Kuwahara et al. 2011; Kato et al. 2016). 반면, 국내에서는 아 직까지 국내에 서식하는 균주를 이용하여 방사성 핵종 원소 제거 연구를 수행한 연구결과가 보고된 사례가 거의 없는 상 황이다.

본 연구는 한국원자력연구원 첨단방사선연구소 (Advanced Radiation Technology Institute (ARTI), Korea Atomic Energy Research Institute (KAERI)) 인근 환경에서 시료를 채취한 후, CsCl (cesium chloride) 환경에서 배양하여 세슘 저항성 토종 균주를 선택적으로 선별하였다. 선별된 균주는 R2A (Reasoner’s 2A) 배지로 배양을 하였으며, CsCl를 다양한 농 도로 노출시킴으로써 균주의 생장 및 세슘 제거 능력을 정 량 및 정성적으로 평가하였다.

재료 및 방 법

1.재료

CsCl은 (Sigma-Aldrich, NY, USA)에서 구매하였고, 균주를 키우기 위한 배지는 R2A 액체 배지 (medium)를 제작하여 이 용하였으며 구성 성분은 다음과 같다. Proteose Peptone No.3 (Merck, Germany), Casamino Acids (Bacto^TM, NJ, USA), Dextrose (Yakuri, Kyoto, Japan), Yeast Extract (Bacto^TM, NJ, USA), Soluble Starch (Junsei, Tokyo, Japan), CH₃COCOONa (Sigma-Aldrich, NY, USA), KH₂PO₄ (Junsei, Tokyo, Japan), MgSO₄ (Sigma-Aldrich, NY, USA), Agar (BMA, ME, USA) 에서 각각 구매하여 성장배지 및 R2A 평판 배지 (R2A agar plate)를 제작하였다. 형광시약 LIVE/DEAD® Baclight^TM Bacterial Viability Kit를 (MOLECULAR PROBES, MA, USA)에서 구매하여 분석에 이용하였다. 또한, 균주를 고정 하기 위해 포르말린 (Formalin)을 (Junsei, Tokyo, Japan)에서 구입하였다.

2.실험방법

1)연구 지역 및 샘플채취

한국원자력 연구원 첨단방사선연구소 인근지역 세 곳을 선별하여 호수 (전라북도 정읍시), 강 (전라북도 정읍시), 토양 (전라북도 정읍시)에서 각각 샘플을 100 g씩 채취한 후 이를 이용해 실험을 실시하였다 (Fig. 1A). 시료는 표면으로부터 10~15 cm의 깊이에서 채취하였고 포집한 샘플들은 1차 증 류수를 통한 현탁처리를 통해 전처리를 하였으며 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 멸균 처리된 500mL 유리병에 가득 담아 - 70℃에서 보관하였다.

2)균주 성장배지 제조 및 세슘 저항성 균주 선별

채취한 샘플에서 세슘 저항성 균주를 스크리닝하기 위 해 사용된 성장배지는 R2A 평판 배지를 사용하였으며 실 험방법은 다음과 같다. 먼저, 2 L의 삼각플라스크의 3차 증 류수 1 L와 제작된 R2A 액체 배지 및 Agar 15 g을 넣은 후 고압멸균기 (autoclave)를 이용하여 121℃ 온도와 1.2 kgf cm-2의 압력 조건에서 멸균하여 경화를 진행하였다. 이 때 R2A 평판 배지 및 R2A 액체 배지의 pH는 7.0~7.4이 다. 그 후에 전처리 과정을 거친 샘플 200 μL와 100 mM CsCl 100 μL를 각각 R2A 액체 배지에 주입하여 30℃ 에서 150 rpm 환경에서 1주일간 반복적으로 농화배양 (enrichment culture)을 실시하였으며 30분간 질소로 퍼징 (purging)하여 밀폐하였다. 그 후에 생존한 균주를 멸균한 백금이 (platinum loop)를 이용하여 R2A 평판 배지에 쿼드런 트 획선법 (quadrant streak method)를 사용하여 세슘 저항 성을 지닌 균주를 선택적으로 선별하였다. 선별된 균주는 1 차적으로 Bergey’s manual of systematic bacteriology 방법에 의하여 세포 형태, 운동성 및 형태학적 특성을 조사하였으 며 최종적으로, 솔젠트 (Solgent, Daejeon, Korea)에 의뢰하 여 생존한 균주의 16S rRNA에 염기서열과 NCBI’s BlastN 의 database의 염기서열을 비교/분석을 통해 균주 동정 분석 (identification)을 하였다 (Fig. 1B).

3)세슘 처리시간에 따른 균주 배양 및 형광염색

선별된 세슘 저항성 균주를 R2A 액체 배지에 계대배양 (subculture)한 후, CsCl 농도에 따른 생존곡선을 확인하기 위 하여 CsCl (1 M)을 3차 증류수에 희석하여 10, 50, 100mM 의 농도를 준비하였다 (Kato et al. 2000; Linda et al. 2014; Kato et al. 2016; Wang et al. 2016). 그 다음, 균주를 배양 중 인 R2A 액체 배지에 100 μL씩 처리함으로써 실험을 수행하 였다. 그 후 micro plate reader (Infinite®, Tecan Co, Switzerland) 를 사용하여 600nm 파장에서 흡광도 (O.D, Optical density) 를 측정하여 CsCl 농도 및 노출 시간에 따른 생장곡선 (growth curve)를 확인하였다. 분석 원리는 다음과 같다. 세균 의 농도가 증가할수록 빛이 산란된 정도가 정비례하게 증가 하게 되므로 이때 분광광도계를 이용하여 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세균의 생장률을 측정할 수 있다. 추가적 으로 형광이미지 분석은 10% 포르말린 (FBS : Formalin=9 : 1)과 LIVE/DEAD® Baclight^TM Bacterial Viability Kit (live: SYTO 9, green-fluorescent nucleic acid stain, dead: Propidium iodide, red-fluorescent nucleic acid stain)를 각각 50 μL씩 처 리 후 공초점 현미경 (CLSM; Cal Zeiss, LSM 800, Germany) 을 이용하여 관찰하였다. 분석 원리는 SYTO 9 화합물이 살 아있는 세균 핵 내부 DNA의 구성요소인 핵산 (nucleic acids) 과 강하게 결합하여 형광 (λ_em=509)을 발하게 되며, Propidium iodide는 균 사멸에 의하여 파괴된 DNA 내부로 들어 가 형광 (λ_em=635)을 발현함으로써 외부환경 요인에 의한 균 사멸을 형광염색을 통해 정량 및 정성적으로 관찰할 수 있다.

4)pH에 따른 세슘 흡착능 평가

선별된 균주를 200 mL R2A 액체 배지를 이용하여 30℃, 150 rpm 환경에서 순수배양 (pure culture)를 진행하였다. 48 시간 후에 R2A 액체 배지 50mL씩 팔콘 튜브 (falcon tube)에 분주한 후, 원심분리기 (Hanil Science, Combi-514R, Korea) 를 이용하여 (10000 rpm min^-1)로 5분간 균주를 침전시켰다. 그 다음, 상등액 (supernatant)을 제거한 후에 0.2 mg L^-1 Cs가 함유된 R2A 배지 10mL(pH 4, 7, 10)를 24시간 동안 처리하 였다. 그 후, 원심분리기 (12000 rpm min^-1)로 5분간 균주를 선택적으로 침전시킨 후, 상등액만 추출하여 각 균주에 대 한 세슘 흡착능을 유도결합플라즈마 질량분석기 (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (ICP-MS), Agilent Technologies, 7500CE, US)를 이용하여 분석하였다.

결과 및 고 찰

1.세슘 저항성 균주 선별

샘플 (호수, 강, 토양)로부터 세슘 저항성 균주를 선별하기 위해 100 mM CsCl를 함유한 R2A 액체 배지에서 농화배양 시킨 균주를 실험에 바로 사용하지 않고, 약 1주일간 농화배 양을 반복적으로 실시한 후 균주를 선별하였다. 이러한 이 유는, 초기 샘플에는 균주들의 개체 수 및 종류가 매우 많기 때문에 되도록 세슘 저항성을 가진 균주의 개체 종류를 최 대한 줄이고자 하였다. 따라서, 최종적으로 배양하여 획득 한 균주들이 현장 조건을 대변할 수 있는 대표 균주가 될 수 있다. 즉, CsCl 배양 환경의 우점종 균주들이 CsCl의 생지 화학적 반응특성 및 거동을 잘 나타낼 수 있으며, 현장 특성 을 가장 잘 대변하기 때문이다. 선별된 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열 동정 분석 결과, Bacillus anthracis Roh-1, B. cereus Roh-2, Pantoea agglomerans JCM1236, Ralstonia pickettii NBRC 102503, Sphingomonas aquatillis NBRC 16722와 99.99% 이상 일치하는 것을 확인하였으며, 다양한 균주가 CsCl를 처리한 환경에서 살아남았다. 본 실험은 그 중에서 가장 많은 군집 (colony)을 형성한 B. anthracis Roh- 1, B. cereus Roh-2 균주를 이용하여 실험을 진행하였다 (Fig. 2).

2.세슘 저항성 균주 생장곡선 평가

선별된 세슘 저항성 균주 (B. anthracis Roh-1, B. cereus Roh-2)를 CsCl의 농도 및 노출시간을 다양하게 하여 생장 곡선을 확인해보았다 (Fig. 3). Fig. 3A와 같이 B. anthracis Roh-1 균주는 10mM 이하의 CsCl 농도에서 세슘에 대한 저 항성을 보이는 것을 확인할 수 있었으며, 30시간 동안 50, 100 mM CsCl의 농도를 처리하였을 때 대조군 (0 mM CsCl) 에 비하여 59%, 56% 생장하였다. Fig. 3B와 같이 B. cereus Roh-2 균주는 CsCl 노출시간 12시간 미만일 때 B. anthracis Roh-1 균주보다 느린 성장률을 보였지만, 12시간 이후에 는 10 mM CsCl 이상의 농도에서도 탁월한 생존 능력을 보 이는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 B. anthracis Roh-1 균 주는 CsCl 농도가 증가함에 따라 B. cereus Roh-2 균주보 다 사멸이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, 50mM CsCl 환경에서 B. cereus Roh-2 균주보다 30% 이상 더 사멸 하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, B. cereus Roh-2 균주가 B. anthracis Roh-1 균주보다 CsCl 환경에서 세슘에 대한 저항 성을 보이는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3C).

3.균주 형광 염색을 통한 균주 생존능력 평가

Figs. 4, 5와 같이 CsCl 처리 농도에 따른 B. anthracis Roh- 1, B. cereus Roh-2 생존능력을 LIVE/DEAD® Baclight^TM Bacterial Viability Kit를 사용하여 형광 분석을 수행하였 다. 먼저 R2A 액체 배지에 각각의 균주를 48시간 배양 한 후에 0, 10, 50, 100 mM CsCl을 100 μL씩 24시간 노 출했으며, CsCl 농도가 증가할수록 균주 사멸이 증가하 는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고, 대조군 (0 mM CsCl) 의 Red fluorescence 값과 비교군의 (10, 50, 100 mM CsCl) Red fluorescence 값을 Image-pro plus (Media cybernetics, CA, USA) 프로그램을 사용하여 균주 사멸을 정량적으 로 비교/분석하였다. B. anthracis Roh-1는 10, 50, 100 mM CsCl을 처리하였을 때 대조군의 Red fluorescence 값 보다 1.45±0.22, 1.82±0.20, 2.89±0.34배가 증가하였다 (Fig. 4E). 반면, B. cereus Roh-2는 1.10±0.12, 1.56±0.14, 2.28±0.29배가 증가하였다 (Fig. 5E). 즉, 100 mM CsCl을 처 리하였을 때 대조군에 비하여 B. anthracis Roh-1는 2.89배, B. cereus Roh-2는 2.28배가 사멸했다는 것을 확인할 수 있 었다. 이와 같은 결과는 Fig. 3과 같이 B. cereus Roh-2가 B. anthracis Roh-1보다 CsCl 환경에서 저항성을 갖는다는 것 을 나타낸다.

4.세슘 흡착능 평가

Fig. 6과 같이 각각의 균주에 0.2 mg L^-1 Cs⁺ (pH 4, 7, 10) 을 24시간 동안 처리한 후, 균주는 침전시키고 상등액만 채 취하여 각 균주의 Cs⁺ 흡착량을 유도결합플라즈마 질량 분석기를 통하여 분석하였더니 모든 균주에서 pH가 증가 할수록 흡착능이 높아지는 것을 확인하였다. 그 이유는 높 은 pH에서 균주 세포막 표면의 Phosphate group의 일종인 Peptidoglycan, Teichoic acid가 활성화되기 때문에 pH가 증 가할수록 보다 많은 Cs⁺을 흡착할 수 있기 때문이다 (Shim et al. 2010). 특히 pH 10에서 B. anthracis Roh-1, B. cereus Roh-2는 균주 g당 최대 2.01 mg L^-1, 1.32 mg L^-1 Cs⁺을 흡 착하는 확인할 수 있었다. 이러한 이유는 B. anthracis Roh-1 균주 세포막 표면의 Phosphate group들이 B. cereus Roh-2 균주보다 활성화 (activation)되어 Cs⁺ 흡착에 기여한 것으로 보인다.

결 론

본 연구는 한국원자력 연구원 첨단방사선연구소 근방 (흙, 강, 침전물)에서 샘플을 채취한 후, 세슘 저항성 균주 스크리 닝 기술을 이용하여 세슘 저항성 균주 (B. anthracis Roh-1, B. cereus Roh-2)를 선택적으로 선별하였다. 각 균주에게 CsCl (0, 10, 50, 100 mM)를 시간에 따라 노출하였을 때, 10 mM CsCl를 처리한 투여군에서 세슘 저항성을 갖는 것을 균 주 생장곡선 분석 및 형광 염색을 통해 정성, 정량적으로 확 인할 수 있었다. 특히 B. cereus Roh-2 균주는 50 mM CsCl 의 고농도에서도 탁월한 생존능력을 보여주는 것을 확인하 였다. 더 나아가, 0.2 mg L^-1 Cs⁺가 함유된 R2A 배지를 24시 간 동안 처리하였을 때, pH 10에서 B. anthracis Roh-1 균주 는 g당 최대 2.01 mg L^-1의 세슘 흡착능을 보여주었다. 본 세 슘 실험 결과를 토대로 실제 방사성 핵종에 오염된 환경에 서도 균주 방사성 세슘 흡착능이 높을 것으로 예상된다. 이 는 국내의 자생하는 토종 균주의 방사성 핵종에 대한 생화 학적 영향 및 생광물화에 대한 가능성을 제시하는 첫 사례 이며, 균주를 사용한 방사성 핵종의 처리 및 제거 연구를 위 한 선행연구 자료로 사용이 기대된다.

적 요

현재 전 세계적으로 원자력 발전소가 직면하고 있는 문제 중 가장 큰 문제는 방사성 핵종 (¹³⁴Cs, ¹³⁵Cs, ¹³⁷Cs)에 오염된 핵 폐기물 저장 및 처리시설 확충이다. 원자력 발전소의 꾸 준한 증가율에 비하여 방사성 폐기물을 처리할 수 있는 처 리시설의 공간적 한계에 직면하고 있기 때문이다. 이에 환 경 친화적이면서 효율적인 폐기물 처리방법의 개발이 시급 하다. 이에 따라, 경제적이면서 높은 회수율을 가지는 균주 와 세슘 이온의 상호 작용을 통한 방사성 세슘 생물학적 흡 착에 대한 연구가 각광받고 있다. 하지만, 현재 세슘 저항성 을 지닌 균주는 많이 보고되어 있지 않은 상태이다. 본 연구 는 한국원자력연구원 첨단방사선 연구소 주변에서 샘플을 채취하여 세슘 저항성을 지닌 균주를 선별하였다. 세슘 저 항성 균주 선별 방법은 다음과 같다. 샘플 및 100 mM CsCl 을 R2A 액체 배지에 첨가한 뒤, 72시간 후에 살아남은 균주 들을 16S rRNA 염기서열을 NCBI’s BlastN의 database의 균 주들의 염기서열과 비교/분석을 하여 균주를 동정 분석하였 다. 동정 분석 결과, B. anthracis Roh-1, B. cereus Roh-2 균 주들이 세슘 저항성 우점종 균주인 것을 확인할 수 있었다. B. cereus Roh-2 균주가 B. anthracis Roh-1 균주보다 세슘 에 대한 저항성을 보이는 것을 본 실험을 통해 확인할 수 있 었으며, 특히 50 mM CsCl 환경에서 B. cereus Roh-2 균주는 B. anthracis Roh-1 균주보다 최대 30% 이상 세슘에 대해 저 항성을 가지는 것을 확인하였다. 또한, 0.2 mg L^-1 Cs⁺가 함 유된 R2A 배지를 24시간 동안 처리하였을 때, B. anthracis Roh-1 균주는 g당 최대 2.01 mg L^-1의 세슘 흡착능을 유도결 합플라즈마 질량분석기 분석을 통해 확인하였다. 본 세슘 저 항성 균주 스크리닝 기술 및 선별된 균주들은 차후에 방사 성 오염지역 생물학적 환경 정화 및 제염해체를 위한 플랫 폼 기술로 활용될 수 있을 것으로 보인다.