서 론

흰다리새우 (Litopenaeus vannamei)는 광염성 종으로 1~40 psu까지 광범위한 염분 범위에서도 생존이 가능하여 세계적으로 지역의 제한을 받지 않고 가장 많이 양식이 되 고 있는 종이다. 우리나라의 2011년 새우 생산량은 2,844톤 이었으며 2015년에는 5,500톤으로 급격히 생산량이 증가하 였다. 이 중 흰다리새우의 비율이 99.4%로 생산량의 대부 분을 차지하고 있으며 토속종인 대하와 보리새우 양식은 매 우 미미한 상태이다. 흰다리새우가 전 세계적으로 양식이 되 고 있으며 가장 선호대상이 되는 이유는 광염성으로 생리학 적 적응성이 뛰어나 내륙에서도 담수를 이용한 양식이 가 능하기 때문이다. 그러므로 저염분 양식에 관하여서는 삼투 압 조절가능성 (Charmantier and Soyez 1994; Lignot et al. 2000), 젖산 (Racotta and Palacios 1998), 글루코스 (Hall and van Ham 1998; Racotta and Palacios 1998), 총지질, 트리글 리세라이드, 콜레스테롤 (Sánchez et al. 2001)와 같은 물질 들의 함량 변화 등 다양한 항목들이 갑각류의 저염분에서 의 생존력 향상을 위해 많은 연구가 되어 왔다. 저염분 양식 에서의 새우는 사육초기 낮은 염분에 순치되는 과정에서 경 과시간에 따라 생존율이 감소하여 생산성의 차이를 보이게 된다 (McGraw et al. 2002; Saoud et al. 2003; McGraw and Scarpa 2003, 2004). 또한 장기간 낮은 염분에서 사육 시 체 내 이온 균형 또한 생리적인 기능의 변화를 가져오며 (Roy et al. 2007), 각 이온의 농도뿐만 아니라 이온 간의 비율이 새우의 성장과 생존에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Roy et al. 2007; Castillo-Soriano et al. 2010). 저염분 사육 에서는 지하수와 해수를 섞어서 사용하는데 지하수의 경우 는 일반적으로 Ca⁺ 이온이 과량으로 존재하고 K⁺, Mg²⁺ 이 온이 부족하며, 그 양 또한 지역별로 차이를 보여 새우를 양 성할 때 필수적으로 조절이 필요한 상태이다 (Atwood et al. 2003; Boyd and Thunjai 2003; Roy et al. 2007).

이러한 환경적인 요인 이외에 해산 새우를 저염분에 양 식하기 위한 과정에서 가장 우선시 고려되어야 할 점은 어 린 새우를 저염분에 적응시키는 순치과정이다. 일반적으로 알려진 저염분 순치방법은 초기유생 (postlarvae 10~20기) 을 8시간 동안에 염분을 50%씩 감소시키며 먹이를 공급하 지 않는 것이 통상적인 방법이다. 저염분 순치를 하는 유생 은 postlarvae 15기 이하에서는 4 psu까지 순치시키는 것이 낮은 생존율을 보였고, 그 이후 유생시기에는 1 psu까지도 적응이 가능하다고 밝혀져 있다 (McGraw et al. 2002). 이러 한 과정에서의 급격한 환경변화가 초기유생의 성장과 생존 에 미치는 영향에 관한 많은 연구들이 발표되었으나 (Davis et al. 2004; Jayasankar et al. 2009), 크기가 작아 혈액을 쉽 게 분리할 수 없기에 삼투압 조절과 관련된 연구는 전혀 수 행되지 않았다.

본 연구에서는 자연해수에서 염분 4 psu에 도달하기까지 8시간마다 염분을 50% 감소시켜 24시간 안에 도달하는 방 법과 천천히 24시간마다 염분을 50% 감소시켜 72시간 동안 순치시키는 방법으로 초기유생의 조직으로부터 삼투압, 생 화학적 특성 및 이온변화를 파악하여 효율적인 저염분 순치 방법을 제시하고자 한다.

재료 및 방 법

1.저염분 순치실험

2012년 6월 19일~25일까지 흰다리새우 PL 20기 유생으 로 염분 4 psu까지 순치속도에 따른 이온변화 및 체액분석을 실시하였다. 유생은 200 L FRP 원형수조 9개에 6월 22일부터 3일간 비교구 (자연해수, 32 psu), 8시간마다 염분을 50%씩 감소시킨 실험구 (F.A.; fast acclimation), 24시간 동안 염분 을 50%씩 서서히 감소시킨 실험구 (S.A.; slow acclimation) 를 설정하여 각각 3배구로 실시하였다. 실험에 사용된 유생 은 수조당 2,000마리로 총 18,000마리를 수용하였다. 실험 시작 후 통상적인 방법에 따라 32시간 동안 먹이를 공급하 지 않았으며 그 이후에는 체중의 10%에 해당하는 사료를 3 회/일 나누어 공급하였다. 수질의 안정과 염분 농도를 낮추 기 위하여 3톤 수조 3개에 지하수와 해수를 섞어 수온을 조 절하였다. 준비된 물을 분당 약 150~300 mL가 실험수조로 흘러들어가게 설치하였다. 각 수조마다 포기를 하였으며 수 질환경은 8시간마다 수온, 염분, 용존산소, pH를 측정하였다 (Fig. 1). 각 분석을 위하여 염분이 50%씩 감소된 시간에 새 우 샘플을 10~15마리씩 채취하여 원심분리관에 넣고 체액 의 분석 시까지 초저온냉동고 (- 70℃)에 보관하였다.

2.체액분석

순치과정에서 각 실험구의 유생을 10~15마리씩 미리 무 게를 측정한 원심분리관에 넣어 총 무게를 측정하고 그 차 이를 유생 마리수로 나누어 한 마리당 체중을 계산하였다. 실험 유생의 크기가 작아 혈림프를 채취하기 어려움으로 각 실험구별로 수집된 총 3개의 실험구, 3 반복구 시료에 각 각 증류수 500 μL에 넣어 유생 전체를 분해한 후 15분간 원 심분리 (4℃, 8000 rpm)하고 상등액을 혈액분석기 (Fuji Dri- Chem. 3500i)로 glucose와 BUN (blood Urea nitrogen) 농도 를 측정하여 삼투압 계산에 활용하였다. 체내 잔존하는 먹이 의 성분이 체액분석 값에 영향을 미치는 것을 방지하기 위 하여 새우 평균 먹이섭취량의 사료를 체액분석과 동일한 방 법으로 측정하여 보정하였다.

3.삼투압분석

일반적으로 유생은 등장액에 넣어 마쇄 후 원심 분리하 여 근육 세포내외의 삼투압을 측정하는 방법을 활용하나 (Loeza et al. 2005) 본 연구에서는 삼투압 이외에 이온변 화, 체액 성분을 조사하기 위하여 증류수를 사용하였으며 혈림프 측정 항목을 이용하여 체액의 삼투압을 계산하였 다. 체액의 삼투압 계산식은 Serum osmolality=2Na⁺ (mEq L^-1)+2K⁺ (mEq L^-1)+(BUN [mg dL^-1])/2.8+(Glucose [mg dL^-1])/18 (Purssell et al. 2001)였다. Na⁺과 K⁺은 이온분석기 로 측정한 값을 mEq L^-1가 아닌 mg L^-1 (ppm)로 계산하였으 며 시료량의 차이에 의한 오차를 없애기 위하여 유생의 무 게 비율을 반영하여 모든 항목을 μg mg^-1으로 환산 하였다.

4.이온분석

새우 유생의 저염분 순치과정에서의 체내 이온분석을 위 하여 체액 및 삼투압 분석과는 별도로 시료를 10~30마리 씩 초저온 냉동보관을 하였으며 기기분석 가능한 최소 시 료량을 맞추기 위하여 3배구로 실시된 시료를 모아서 분석 하였다. 분석 시 시료를 증류수로 씻어내고 24시간 동결건 조하여 시료 100 mg 당 60% HNO₃ (JUNSEI) 10 mL를 넣 고 Microwave Accelerated Reaction System (MARS, CEM) 을 사용하여 완전히 용해시켰다. 용해된 시료는 3차 증류수 에 10배 희석하여 Ca²⁺, K⁺, Mg²⁺, Na⁺ 농도를 AAS (atomic absorption spectrometer, novAA^®300)로 측정하였고 이때의 표준검정식은 표준용액 (AnApureTM)을 사용하여 구하였 다.

결과 및 고 찰

1.유생 무게성장

실험시작 32시간 동안 먹이를 공급하지 않아 평균 중량이 약 6.12±1.56 mg인 유생이 먹이 공급 후 모든 실험구에서 점차 체중의 증가를 보였다 (Fig. 2). 시간이 경과할수록 개 체간의 중량 변화가 크고 편차가 심하여 실험 72시간 동안 의 성장 양상을 파악하기는 어려웠다. 그러나 각 실험이 종 료된 72시간 후에는 빠르게 저염분으로 순치한 F.A. 실험구 에서 유생의 평균 무게가 32.7±1.5 mg이었으며 가장 무게 가 낮은 실험구는 S.A.로서 22.2±3.5 mg으로 조사되었다. 실험 3일간의 유생의 성장식은 control y=2.246x+4.8441 (R²=0.9058), S.A.; y=2.0179+4.6404 (R²=0.8072), F.A.; y=2.834x+2.6979 (R²=0.8415)이었다. 본 실험 동안에 무 게의 변화는 사료 섭취, 공식에 의한 먹이량 증가 등에 의하 여 시간별 무게가 크게 변화하는 양상을 보였으나 성장식에 따르면 F.A. 실험구에서 가장 빠른 성장이 있는 것으로 파악 되었다. 양식에 있어서 가장 간단히 새우 유생의 건강도를 판별하는 방법으로 염분 스트레스에 의한 생존율을 조사하 는 것인데 (Charmantier and Soyez 1994; Lignot et al. 2000; Laramore et al. 2001), 본 연구에서 유생의 최종 생존율은 염 분 순치시간에 따른 실험구간에 유의적 차이를 보이지 않았 으며 평균 60±5% (비교구), 61±4% (F.A.), 60.3±5% (S.A.) 로 순치 방법이 생존율에는 영향을 미치지는 않았다.

2.체액특성

새우에서 혈림프는 생리적인 에너지 필요량에 따라 성분 농도가 변화하여 환경에 대한 적응력, 생존 가능성 등을 파 악하는 요소가 되기도 한다 (Bachère et al. 1995). 탄수화물 과 지질은 직접 또는 간접적으로 세포막의 투과성과 삼투압 조절을 위한 에너지로 제공되며 아주 낮은 저염분에 유생이 노출될 때 혈림프내 glucose의 농도가 감소하는 것으로 알 려져 있다 (Spaargaren and Haefner 1987). 본 연구에서 저염 분 순치 32시간 동안 먹이를 공급하지 않아 모든 실험구에 서 점차 낮아지는 glucose 농도를 보였으나 먹이공급이 이루 어진 32시간 후부터 증가하였다. 저염분 스트레스를 거치지 않은 해수 비교구에서 16시간에 순치 실험구들보다 더 낮은 최저 농도인 2.08±0.09 μg mg^-1를 보였으나 점차 증가하여 56시간에는 4.79±0.31 μg mg^-1, 그 이후에는 감소하여 72시 간에는 2.97±0.40 μg mg^-1에 달하였다 (Fig. 3). 24시간 안에 염분 4 psu까지 도달한 F.A. 실험구에서는 32시간 먹이공급 전까지는 glucose 농도가 증감을 반복 하였으나 공급 후에는 56시간까지 지속적으로 4.77±0.43 μg mg^-1까지 증가한 후 다시 감소하여 일정한 농도를 유지하였다. 72시간에 4 psu에 이른 S.A. 실험구에서는 순치 24시간 동안 glucose의 농도가 감소하였으나 72시간 후에는 다른 실험구보다 높은 5.46± 0.69 μg mg^-1에 이르렀다. 그럼으로 저염분에 의한 glucose 의 감소보다는 먹이섭취 유무에 따른 변화 양상이 더 두드 러진 것으로 확인되었다.

BUN의 경우는 해수에 수용한 비교구에서는 16시간 후에 일시적으로 0.53±0.20 μg mg^-1까지 증가하였고, 순치시간이 경과함에 따라 점차 감소하여 72시간 후에는 0.24±0.06 μg mg^-1이었다. F.A. 실험구와 S.A. 실험구는 비교구와 유사한 변화양상을 보였으며 순치 64시간 후에 F.A.에서 0.55±0.25 μg mg^-1까지 상승하였고, 72시간에는 0.37±0.01 μg mg^-1로 감소하였다. S.A. 실험구에서는 증감을 반복하였지만 순치를 시작한 직후에 가장 높은 값인 0.63±0.16 μg mg^-1, 40시간 후에 최저 0.27±0.01 μg mg^-1의 값을 보였다. 짧은 실험기 간 동안 모든 실험구에서 유사한 생존율을 보이고 glucose와 BUN의 표준편차가 큰 것을 보아 저염분 순치에 의한 영향 보다 유생의 활력 또는 사료 섭취 및 공식에 의한 개체간의 차이로 인하여 체액 조성이 차이가 나는 것으로 파악되었다.

3.이온변화

저염분 순치 방법에 따른 새우 체내와 실험 사육수내 이 온변화를 조사한 결과는 다음과 같다 (Fig. 4). Ca²⁺ 이온은 사육수 내 염분 감소에 따라 그 농도 또한 점차 감소하였으 나 순치 실험 시작 40시간 이후에는 F.A.와 S.A. 실험구에서 유사한 농도를 보이며 72시간까지 유지되었다. 저염분에 노 출시 새우 혈림프내 Na⁺ 이온은 급속히 감소하는 것으로 알 려져 있으며 (Huong et al. 2010), 저염분에서 Na⁺과 Cl^- 이 온은 수동적으로 투과가 가능한 상피세포를 통하여 손실이 되나 체내 H⁺ 또는 NH₄⁺와 교환이 되어 재흡수가 일어나는 것으로 보고되어 있다 (Palacios and Racotta 2007). 본 연구 에서도 서서히 저염분에 순치한 실험구인 S.A. (22.54 ppm) 는 일반 해수의 비교구 (23.84 ppm)와 유사한 Na⁺ 농도를 보 였으나 빠른 시간 안에 순치를 시킨 F.A. 실험구에서는 8시 간 만에 급격히 감소하여 다른 실험구의 약 50%인 11.68 ppm로 조사되었고 16시간이 지난 후에는 다시 Na⁺ 농도가 증가하여 회복되는 과정을 확인할 수 있었다.

저염분 호지에서의 이온변화에 관한 연구결과에 의하면 흰다리새우의 경우 일정량 이상의 농도 또는 비율이 유지되 어야 하고 (Castillo-Soriano et al. 2010), 탄산칼슘 (CaCO₃) 의 농도가 150 mg L^-1 이상이 되어야 흰다리새우의 양식이 원활하며 (Scarpa and Vaughan 1998), Ca²⁺ 이온은 탈피 시 주변 환경으로부터 지속적으로 흡수하여야 한다 (Robertson 1953; McWhinnnie 1962; Fieber and Lutz 1982). 새우를 저 염분에 수용하면 혈림프내 Ca²⁺의 농도는 약 6시간 내에 변 화를 하며 그 이후에는 모든 염분 구간에서 일정한 농도가 유지되는데 (Huong et al. 2010), 본 연구에서도 F.A.와 S.A. 실험구 모두 순치 8시간 (F.A. 16 psu, S.A. 30 psu)에 동일한 감소를 보였고 16시간 후에는 다시 상승함으로 환경 또는 사료로부터 칼슘을 흡수하여 저염분에 적응함으로서 칼슘이 제한요소로 작용하지 않는 것으로 확인되었다. 사육수내 K⁺ 이온은 Na⁺-K⁺-ATPase 활성을 촉진하는 세포외 양이온으 로서 최소 요구량은 1 mg L^-1로 보고 되어있다 (Mckraw and Scarpa 2003). 본 연구에서 K⁺ 이온의 변화는 일반해수의 비 교구와 큰 차이를 보이지 않아 순치과정에서 이온의 손실이 없는 것으로 나타났다. Mg²⁺은 지질, 단백질, 탄수화물 대사 작용에 필수적인 요소로서 (Roy et al. 2007) 이 두 이온들은 성장, 생존, 삼투압 기능에 중요한 역할을 하고 있다 (Mantel and Farmer 1983; Pequeux 1995). 본 연구에서 유생들이 염 분순치 과정을 거치는 동안 Mg⁺ 이온은 비교구보다 저염분 에 순치시킨 유생들이 더 낮은 값을 보였으나 순치가 완료 된 3일 후에는 오히려 더 높은 농도를 보여 순치 후 짧은 기 간 안에 회복이 되는 것으로 조사되었다.

4.삼투압

새우 유생의 초기 혈림프 채취가 불가능하여 전체 실험구 의 유생을 분쇄하여 상등액으로 이온과 체액을 분석, 삼투압 의 변화를 계산한 결과는 Fig. 5와 같다. 비교구에서는 삼투 압이 전 기간 크게 차이 없이 72.4~94.7 μg mg^-1 범위로 조 사되었으나 빠른 시간에 순치를 이룬 F.A. 실험구에서는 순 치 8시간, 즉 염분이 32 psu에서 약 16 psu로 감소된 경우에 매우 낮은 59.0 μg mg^-1을 기록한 후 16시간 후에 회복되어 85.9 μg mg^-1이었다. 그 이후에는 증감을 반복하여 72시간 후에는 97.1 μg mg^-1까지 증가하였다. S.A. 실험구는 72시간 에 염분이 32 psu에서 4 psu로 감소하여 순치 후 32시간에 최소 73.4 μg mg^-1, 72시간 후 최대 91.9 μg mg^-1의 값을 보였 다. 빠르게 염분이 변화한 F.A. 실험구가 비교구 및 S.A. 실 험구보다 전체적으로 순치 62시간까지 낮은 삼투압을 보였 다. 순치시간과 상관없이 같은 염분에 도달하였을 때의 삼투 압을 비교한 결과를 보면 F.A.와 S.A. 실험구 모두 16 psu에 도달 시 비교구보다 낮았으며, 빠른 시간에 순치한 F.A. 실험 구가 천천히 순치시킨 S.A. 실험구보다 더 낮은 삼투압 농도 를 보였다. 저염분 구간인 8 psu와 4 psu로의 순치 시 비교구 와 동일한 삼투압을 보이는 것으로 조사되어 순치가 완료된 후에는 삼투압 농도가 회복이 되는 것으로 나타났다 (Fig. 6).

광염성의 갑각류가 저염분에 노출이 될 경우는 세포가 부 풀며 그로 인하여 세포간극이 좁아지게 되어 체내 투과율이 감소하고, green gland와 antennal gland와 같은 renal organ 에 의한 체액의 배출이 늘어나며 Na⁺과 Cl^- 이온을 능동적으 로 흡수되어 묽은 소변을 배출하게 된다. 이때 Ca²⁺, Mg²⁺, SO₄^2- 및 유기 삼투물질이 환경과 혈림프 사이의 삼투압 차이를 줄이는 방향으로 조절이 된다 (Mantel and Farmer 1983; Pequeux 1995). 본 연구에서 삼투압 산정은 glucose, BUN, Na⁺, K⁺ 이온에 의해 결정이 되었는데 유기 삼투물질 인 glucose, BUN이 순치 초기에 비교구보다 높은 값을 보여 삼투압을 유지하는 역할을 담당한 것으로 예측이 가능하나 급속히 순치를 시킨 실험구에서 짧은 시간 동안 Na⁺이 급감 하여 삼투압조절에 영향을 미친 것으로 파악되었다.

결론적으로, 저염분 순치 과정에서 순치 방법, 즉 순치 속 도에 따라 새우의 삼투압 조절에 영향을 미치는 이온의 조 성이 일시적으로 달라짐으로 최대한 스트레스를 줄일 수 있 는 방안으로 32 psu에서 16 psu로 8시간 동안 급격한 저염분 순치과정 (F.A.)에서 초기 순치 시간을 좀 더 늘려서 저염분 에 적응을 시키는 것이 향후 성장 및 생존율 향상에 도움이 되는 것으로 파악되었다.

적 요

본 연구는 흰다리새우 초기유생이 (Postlarvae 15) 4 psu 저 염분 순치 시 생리학적 변화에 관한 연구로서 순치방법, 즉 일반 해수를 비교구로 하고 8시간마다 빠르게 염분을 50% 씩 감소를 한 실험구 (fast acclimation; F.A.)와 하루에 50% 씩 천천히 염분을 감소시킨 실험구 (slow acclimation; S.A.) 를 설정하여 생리학적 변화를 비교하였다. 생존율, gloucose 와 혈중 요소성 질소의 함량이 순치방법에 따라 유의적인 차이를 보이지 않았으나 이온의 조성은 순치방법에 따라 차 이를 보였다. 저염분에 순치된 새우의 체액 조성 중 마그네 슘과 나트륨은 염분 32 psu에서 보다 낮은 농도를 보였다. 특히 나트륨 농도는 직접적으로 새우의 삼투압 조절에 영향 을 미치는데 빠르게 순치를 시킨 F.A. 실험구에서 급격히 나 트륨 농도가 감소하는 것으로 나타났다 (염분 32 psu에서 16 psu로 감소). 순치과정에서 새우의 스트레스를 줄이기 위해 서는 처음 50% 염분을 감소시키는 과정은 8시간 이상으로 유지하고 그 이후에는 빠르게 순치하는 방법을 적용하는 것 이 바람직할 것으로 파악되었다.