서 론

미꾸라지 (Misgurnus mizolepis)는 가늘고 긴 체형과 장호 흡으로 인해 연못, 논두렁, 수로 등 수심이 얕고 수위 변화가 빈번한 담수환경에 서식하기 적합하다 (Nam 2007; Kim et al. 2011). 갑각류, 연충류, 곤충류, 동물성 및 식물성 플랑크 톤, 클로렐라 등 살아 있는 생물을 먹이로 하며, 밝은 곳보다 는 어두운 곳을 좋아하며 먹이를 찾을 때 외에는 몸은 흙 속 에 묻고 주둥이와 눈만을 밖으로 내어 아가미 호흡을 한다. 그러나 산소가 부족한 환경에서는 장호흡을 하여 창자의 벽 으로 산소를 흡수하고 남은 공기는 항문을 통하여 내놓는다. 미꾸라지는 1980년까지도 우리나라 전역의 늪과 농수로 등 에서 관찰할 수 있었으나 경지정리, 농업 환경 변화, 화학비 료 및 농약 사용 등으로 인한 수질 변화 등으로 인해 그 수 가 감소하고 있다 (Kim and Lee 1985; Han et al. 2013).

미꾸라지는 맛이 우수할 뿐 아니라 단백질, 비타민 A, 비 타민 D가 풍부해 예로부터 우리나라를 포함한 동북아시아 에서 애용되어온 강장식품으로, 최근에는 국민소득 수준 향 상 등으로 삶의 질과 건강에 대한 관심이 크게 증가하면서 식량으로서의 미꾸라지에 대한 수요가 급격한 증가 추세에 있다. 부족한 수요를 충족시키기 위한 대책으로 중국산 미꾸 라지 종묘의 수입과 미꾸라지의 고밀도 사육이 성행하고 있 으나 이로 인해 발생하는 사육 환경의 악화, 개체 간의 잦은 접촉, 스트레스, 질병의 빠른 발생과 전파 등의 문제는 미꾸 라지 양식 산업에 큰 경제적 손실을 유발하고 있다 (Park et al. 2012).

어류의 물곰팡이병의 원인체는 주로 편모균아문 (Mastigomycotima) 의 난균강 (Oomycetes), 수생균목 (Saprolegniales), 수생균과 (Saplolegniaceae)에 속하는 균류로, 그중 에서도 Saprolegnia parasitica가 담수어와 어란에 주로 기 생하여 감염한다 (Diéguez-Uribeondo et al. 1994; Jee et al. 2001). 수생균은 주로 20℃ 이하인 저수온기에 발생하며, 어 체의 물리적인 또는 외부 기생충 감염으로 인해 형성된 상 처 부위에 착생하여 감염한다. 감염 부위에는 솜털 모양의 균사체를 형성하여 육안으로도 쉽게 판별이 가능하고, 균사 체의 증식이 심한 경우에는 어체 전체에 광범위하게 퍼져 괴사를 일으켜 감염 개체를 폐사시킨다 (Meyer 1991). 미꾸 라지를 포함한 양식어류에서 수생균은 활어 수송, 선별, 채 란, 채정 등의 작업에 생기는 상처 부위, 체표 기생충의 기생 부위, 병원체 및 영양성 질병에 의한 염증부위 등 1차적으로 형성된 체표 이상 부위에 2차적으로 감염되는데, 주로 상피 조직에 침입하여 균사체를 증식하여 생존 어류의 경제적 가 치를 떨어뜨리거나 심한 경우에는 내장 또는 아가미까지 감 염하여 어류를 폐사시킨다. 이를 예방하기 위해서는 항생제 와 화학약물의 사용이 불가피한 실정이다.

말라카이트 그린은 트리페닐메탄계 염료로 담수어류의 수 생균 및 어류의 외부 기생충 치료에 탁월한 효과가 있고 가 격이 저렴하여 1930년대부터 전 세계의 양식업에서 사용되 어왔다 (Alderman 1985; Rushing et al. 1997; Bergwerff and Scherpenisse 2003; Hashimoto et al. 2011). 그러나 1980년대 초반부터 발암성과 변이원성, 어체 내 축적, 그리고 어류를 섭취한 인체 내 축적 등의 공중보건학상 문제점들이 보고되 면서 식용 어류의 양식에는 사용이 금지되었다 (Srivastava et al. 2004; Myung and Kang 2005; Hashimoto et al. 2011). 그 러나 현재도 말라카이트 그린만큼 뛰어난 항균력과 가격 경 쟁력을 가진 구충제와 항균제는 거의 없는 실정이다 (Myung and Kang 2005; Olesen et al. 2007; Pourreza et al. 2007; Hashimoto et al. 2011; Conti et al. 2015). 따라서 친환경 소 재의 말라카이트 그린의 대체제 개발은 양식어민의 경제적 부담과 공중보건학상 문제 해결을 위해 시급한 과제이다.

유황은 살충력이 강하여 옴, 습진, 가려움증 등 피부병 치 료에 효과가 있고 병원성 미생물의 생육을 억제하는 것으 로 보고되어 왔다 (Kumar and Berwal 1998; Kim et al. 2001; Seo et al. 2004). 또한 마늘과 양파 추출물에 있는 함유황유 기화합물은 현대적인 항생제가 나오기 전, 티푸스, 콜레라, 이질과 같은 질병의 치료약으로 널리 사용되어 왔다 (Block 1986; Block 1992). 이런 여러 가지 효능이 알려져 있음에도 불구하고 유황은 독성이 강하여 부작용을 초래하기 때문에 유황을 약으로 사용하기 위해서는 법제 과정을 거쳐야 하고 사용 전, 그 안전성이 평가되어야 한다 (Choi and Kim 2002; Song et al. 2007). 최근에는 법제 유황이 항생제를 대체하여 친환경 농산, 축산 및 수산물의 개발에 이용되고 있으며, 또 한 의약품 및 기능성 건강식품에도 독성을 제거한 법제유황 이 활용되고 있다 (Jung et al. 2000; Youm et al. 2000; Kim 2002; Lee et al. 2005). 본 연구에서는 수산 분야에서 법제유 황의 어류 병원체에 대한 효력, 의약품으로서의 사용 가능 성, 그리고 미꾸라지에 대한 안전성에 대해서 평가하였다.

재료 및 방 법

1천연유황수의 제조

천연유황은 인도네시아 이스트 자바섬의 카와이젠 화산 에서 채취된 것을 구매하여 분쇄하였다. 12종의 유용 미생 물 (Raphael®; Lbiotech, Korea)은 보이차 잎, 녹차 잎, 광 나무 잎을 발효시키는 과정에서 분리하였고 다음과 같다; Lactobacillus parafarraginis, L. paracasei subsp. tolerans, L. harbinensis, L. buchneri, L. perolens, L. rhamnosus, L. vaccinostercus, Acetobacter lovaniensis, A. peroxydans, Pichia fermentans, Candida ethanolica, Saccharomycopsis schoenii. 천연유황 분말과 12종 미생물 배양액을 골고루 혼 합한 뒤 30℃, 습도 35%에서 96시간 발효 법제를 2회 반복 수행하였다. 실험실 조건에서 다양한 비율과 조합으로 용해 도를 측정 후 확립한 조건을 이용해, 법제된 천연유황 분말, NaOH, 그리고 물을 20 : 22 : 58 비율로 혼합하여 천연유황 수 (effective-microorganisms-processed sulfur solution, EMPSS) 를 제조하였다.

2어류 병원체의 분리와 배양

2015년 가을, 전남 장성에 위치한 미꾸라지 양식장에서 육안적으로 수생균에 대한 감염증을 나타내는 미꾸라지 개 체를 임의 수집하였다. 병어 5마리를 200 mL 멸균식염수가 포함됨 1 L 삼각플라스크에 넣은 후 1시간 동안 침지 반응 시키어 수생균이 멸균식염수로 분리되어 나오도록 하였다. 수생균이 포함된 멸균식염수를 취하여 고체 배지에 도말한 후 배양하였다. 수생균의 분리에는 sabouraud dextrose agar (SDA, Difco) 및 potato dextrose agar (PDA, Difco)를 사용 하였으며, 이후의 배양과 실험에서는 potato dextrose broth (PDB, Difco)와 PDA를 사용하였다. 순수분리된 수생균은 complete rDNA (18S, ITS1, 5.8S, ITS2, and 28S) 시퀀싱 후 NCBI BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/, USA) 검색을 통해 동정한 뒤 사용하였다.

3수생균에 대한 천연유황수의 최소억제농도 시험

법제된 천연유황 22.6%를 함유하는 천연유황수 (Lee et al. 2013)를 사용하였다. 유용 미생물을 이용해 법제한 천연유 황수의 수생균에 대한 억제능 평가는 한천배지 희석법 (agar dilution)과 액체배지 희석법 (broth dilution)으로 수행되었 다. 한천배지 희석법의 경우, 천연유황수 10, 30, 60, 100, 300, 600 그리고 1000 ppm을 포함한 PDA배지를 제조한 뒤, 5일간 25℃에서 배양한 S. parasitica 균사의 선단 부분을 일 정량 채집하여 각 농도의 유황수를 포함하는 PDA 배지의 한 가운데에 도말하여 5일간 배양하였다. 액체배지 희석법의 경우, 기존 수생균 처리제와의 성장 억제능력 비교를 위해 PDA에 성장한 균사의 선단 부분 일정량을 채집 후 천연유 황수, 과산화수소, 그리고 포르말린 10, 30, 그리고 50 ppm을 첨가한 PDB 배지에 각각 접종하여 육안으로 균사체의 성장 을 비교하였다.

4어병 세균에 대한 천연유황수의 최소억제농도 시험

본 시험은 천연유황수 0, 25, 50, 그리고 100 ppm을 첨가 한 Mueller-Hinton agar에 멸균 식염수를 이용해 희석한 0.5 McFarland 탁도의 세균액을 접종하여 한천배지 희석법으 로 수행하였다. 본 시험에 사용된 분리주는 2016년 봄과 여 름에 전북지역 미꾸라지 양식장의 폐사 시료에서 분리한 Vibrio sp., Aeromonas hydrophila, 전북 지역의 한 호수에서 집단 폐사한 붕어에서 분리한 Yersinia ruckeri, 그리고 연쇄 구균증이 발생한 넙치에서 분리된 Streptococcus parauberis 등 총 4종이었다.

5어류 사육 관리

본 연구에 사용된 미꾸라지 미성어 (10 g 전후)와 치어 (3.13±1.51 g)는 전남 장성에 위치한 양식장에서 각각 2015 년 가을과 2016년 여름에 구매하여 사용하였다. 사육수는 수 돗물을 어류 입식 7일 전부터 순환 여과시켜 탈염하여 1차 모래 여과, 2차 생물학적 여과, 그리고 3차 자외선 살균 처리 하여 사용하였다. 미꾸라지의 사육은 산소 발생장치가 장착 된 가로 47×세로 29×높이 40 cm의 사각유리수조에서 15 일간 이루어졌으며 사육온도는 24±1℃로 유지하였다.

6천연유황수에 대한 미꾸라지의 안전성

천연유황수가 미꾸라지 어체에 미치는 급성 독성을 조사 하기 위해 미성어와 치어를 대상으로 0, 25, 50, 75, 100, 125 그리고 250 ppm이 되도록 천연유황수를 첨가하였다. 각 수 조에 미성어 15마리, 치어 20마리씩 넣고 5일간 급성 독성을 관찰하였다. 시험에 사용된 미성어는 시험 종료 후 3마리를 임의 선택하여 아가미, 간, 비장을 수집하였다. 장기는 일주 일간 10% 중성 포르말린에 고정 후 hematoxylin and eosin (HE) 염색 후 검경하여 병리조직학적 분석을 수행하였다.

7물벼룩을 통한 생태 영향 예측

천연유황수의 첨가로 인한 수질의 변화는 시험 수행 기간 5일과 시험 종료 후 5일간 매일 아침 10~11시 사이에 유황 수 농도별로 수조의 수온, 용존산소량 (DO), 그리고 pH를 측 정하였다. 또, 천연유황수의 생태 독성 평가는 한국화학융합 시험연구원 (KTR, Korea)에 의뢰하여 국립환경과학원 고시 제2015-8호와 OECD TG 202의 가이드라인에 따라 수행하 였다. 시험 방법을 간략히 서술하면, 3주령의 어미 개체에서 생산된 생후 24시간 미만의 Daphnia magna neonate를 사용 하였다. 배지는 OECD TG 202 방법에 따라 조제된 M4 배지 를 135 mL 용량의 원통형 유리수조 (65 mm H×57 mm φ)에 100 mL 처리하여 사용하였고, 시험 수조당 물벼룩 5마리씩 사용하여 총 2회의 예비 시험과 4회의 본 시험을 반복하였 다. 광주기는 시험 기간 동안 16시간 광 조건과 8시간의 암 조건으로 유지하였으며 사육 수온은 20±1℃를 유지하였다. 모든 시험수조에 대하여 실험시작 후 24 및 48시간 경과 시 에 유영저해 및 이상증상 관찰을 실시하였고 유영저해의 판 정은 시험용액을 가볍게 저어준 다음, 약 15초간 관찰하여 물의 흐름을 벗어나지 못하거나 유영하지 못하는 개체는 유 황수의 독성 영향을 받은 것으로 간주하였다. 치사개체는 유 영저해 개체에 포함시켰다.

결과 및 고 찰

수생균 감염으로 인한 미꾸라지 양식 현장의 경제적 피해 는 늘어나고 있지만, 국내에서 수생균에 대한 연구나 보고는 거의 없는 편이며, 그 마저도 뱀장어와 연어과 어류에 대한 것이다 (Min et al. 1990; Jee et al. 2013; Kim et al. 2013). 본 연구에서는 법제 유황수가 수생균과 병원성 세균에 대한 성 장을 억제하는 농도를 찾고, 천연유황수의 미꾸라지 어체에 대한 안전성 및 담수생태계 등에 미칠 수 있는 영향을 고려 한 생태영향 평가 등을 수행하였다.

1수생균과 병원성 세균에 대한 천연유황수의 성장 억제 효과

PDA plate에 배양한 S. parasitica를 각 농도의 천연유황 수가 첨가된 PDA 배지에 도말하여 5일간 배양한 결과, 60 ppm 이상의 농도에서는 균사체의 성장이 억제되었다 (Table 1). 임상 검체에서 분리된 어병 세균 4종에 대한 성장 억제 를 조사한 결과, S. parauberis는 24시간째 25 ppm에서, 48 시간째에는 50 ppm에서 성장이 억제되었으나, 나머지 3종의 세균 Vibrio sp., A. hydrophila 그리고 Y. ruckeri는 천연유황 수 100 ppm 이하에서 성장이 억제되지 않았다.

PDB 액체배지에서는 천연유황수 50 ppm 이상에서 수 생균 균사체의 성장이 억제되었고 그람 음성 세균인 S. parauberis에서 대해서도 동일 농도에서 성장이 억제되었다 (data not shown). 법제 방법은 다르지만 Ha et al. (2009)도 제독 유황수를 사용해 사람의 피부 질환 곰팡이와 그람 양 성 세균에 대해 항균활성을 관찰하였고 이는 본 연구의 결 과와 비슷하였다. 그러나 천연유황수는 그람 음성 세균인 A. hydrophila, Y. ruckerii, Vibrio sp.의 경우 유황수 100 ppm에 서 억제 효과가 없었다. Lee and Lee (2014)는 다량의 유황을 함유한 삼채 뿌리 추출물의 억제력을 곰팡이 및 그람 음성 세균, 그리고 그람 양성 세균을 포함하는 미생물 7종에 대해 시험한 결과, 시험에 사용한 추출물이 그람 양성 세균과 곰 팡이의 성장을 억제시켰으나 그람 음성 세균에 대해서는 억 제력이 없었다고 보고하여 본 연구의 결과와 비슷하였다. 이 는 상대적으로 다당체가 많은 곰팡이와 그람 양성 세균의 세포벽 구조의 공통성에 의한 것으로 생각되지만 정확한 기 전에 대해서는 추가적인 연구가 필요하다. 또한 본 연구의 항진균 효과에 대한 시험 결과는 in vitro 소독 효과를 측정 한 것으로서, 실제 양식현장에 바로 적용하기에는 무리가 있 다. 따라서 in vivo 효력 시험과 현장 적용 시험을 추가 수행 할 필요가 있으며, 이를 통해 실제 적용시의 효과를 유추할 수 있을 것이다.

한편, PDB 액체 배지에서 포르말린, 과산화수소의 수생균 억제력을 천연유황수 억제력과 비교한 결과, 50 ppm의 과산 화수소수에서는 균사체의 성장이 전혀 관찰되지 않았다. 동 일 농도의 포르말린에서는 균사체의 억제가 관찰되었고, 천 연유황수의 경우 포르말린에 비해서는 조금 약하거나 동일 한 수준의 균사체 억제 효과를 보였다 (Table 2). 포르말린은 50 ppm 이상에서 무지개송어에 감염된 S. parasitica에 대한 치료 효과가 보고되었는데, 이는 본 연구의 결과와도 일치 하였다 (Marking et al. 1994; Fitzpatrick et al. 1995; Mitchell and Collins, 1997; Bruno and Wood 1999; Gieseker et al. 2006). Willoughby (1994)에 따르면 과산화수소는 25 ppm에 서 연어과 어류의 알에 감염된 수생균의 제어 효과가 있는 것으로 보고되어 본 연구의 결과와 2배 정도의 차이를 보였 다. 그러나 과산화수소는 수질, 수온, 존재하는 Saprolegnia spp.의 수에 따라 효과가 달라지는 것으로 추정된다 (Barnes et al. 1998).

2천연유황수에 대한 미꾸라지의 안전성

천연유황수 0, 25, 50, 100, 그리고 125 ppm에 대한 96시 간의 급성 독성 시험 종료 후, 미꾸라지의 미성어와 치어의 대조구 및 천연유황수 100 ppm 이하에서는 폐사가 전혀 발 생하지 않았다. 그러나 125 ppm 농도부터는 폐사가 발생하 였으며 250 ppm에서는 24일 이내에 모든 개체가 폐사하였 다 (Fig. 1). 미성어와 치어 모두 급성 독성 시험에서 최저영 향농도 (LOEC)는 125 ppm으로 결정되었으나, 미성어의 반 수치사농도 (96hr-LC₅₀) 는 250 ppm, 치어에서 96hr-LC₅₀는 125 ppm으로 결정되었다. 조직에 대한 독성 피해를 조사하 기 위해 미성어 아가미, 간, 비장 표본의 병리조직학적 분석 결과, 100 ppm 이하에서는 각 장기에 대한 특별한 이상소견 및 병변이 관찰되지 않아 무영향농도 (NOEC)로 결정되었다 (Fig. 2). 이전에 수행한 독성 연구에서도 대조군과 100 ppm 농도에서 10마리의 잉어 치어에 대해 96시간, 30마리의 꿀 벌에 대해 48시간 독성 시험을 수행한 결과, 100 ppm에서 1 마리만이 비행 불능 상태를 보인 것을 제외하고 두 시험에 사용된 모든 개체에서 폐사와 이상행동은 관찰되지 않았다 (Lee et al. 2013). SD Rat에 대한 급성경피독성 14day-LC₅₀ 값은 4,000 mg kg bw^-1 이상으로서 농약관리법에 의거 독성 구분 IV급 (저독성, ≥4,000 mg kg^-1)에 해당하였다 (Lee et al. 2013).

3생태 독성 영향 측정

천연유황수의 생태 독성을 알아보기 위한 예비 실험시 사 용된 모든 시험농도 (0, 10, 50, 100 ppm)에서 물벼룩의 유영 저해가 일어나지 않았다 (Lee et al. 2016). 본시험은 예비 실 험시 사용된 최대 농도인 100 ppm으로 수행되었는데, 시험 기간 중 음성대조군 및 양성대조군인 약제 처리군에서 일반 중독증상 및 특이증상은 관찰되지 않았다. 시험 개시 48시간 경과 후 천연유황수 100 ppm에서 유영 저해 개체는 관찰되 지 않았다. 따라서 반수영향농도 (EC₅₀) 및 95% 신뢰한계는 산출하지 않았다. 한편, 무영향관찰농도 (NOEC)는 중독증상 과 유영저해가 발생하지 않은 최고 시험 농도 이상 (>100 ppm)으로 결정되었다. 즉, 시험 농도 내에서 100 ppm 이하의 농도에서는 생태 독성으로 인한 영향이 관찰되지 않았다.

적 요

말라카이트 그린과 메틸렌 블루 같은 기본 염료는 1930년 대부터 물 곰팡이 감염을 통제하는 소독제로 사용되었다. 하 지만 이 염료의 발암성 및 생체 내부 축적이 보고된 후 공중 보건을 위해 이 염료의 사용이 금지되었다. 본 연구에서는 천연유황수의 Saprolegnia parasitica의 감염에 대한 치료 효 과와 어류에서의 안전성을 평가하고자 하였다. 천연유황수 의 항진균성 시험에서 S. parasitica 균사체의 성장이 50 ppm 또는 그 이상의 농도에서 억제되었다. 미꾸라지의 치어와 미 성어에 대한 천연유황수의 급성 독성 시험에서 무 영향농도 (NOEC)는 100 ppm, 최저 영향농도 (LOEC)는 125 ppm 그 리고 반수치사농도 (LC₅₀)는 치어에서 125 ppm, 미성어에서 250 ppm으로 측정되었다. 또한, 물벼룩을 이용한 천연유황 수의 생태 독성 시험에서는 100 ppm 이하의 농도에서 물벼 룩의 유영저해가 나타나지 않았다. 결론적으로, 천연유황수 는 50 ppm 농도에서 미꾸라지에 대한 S. parasitica의 감염을 방지하였을 뿐만 아니라 100 ppm 농도까지 미꾸라지에 급성 독성 그리고 물벼룩에 생태독성을 나타내지 않았다. 그러므 로 미꾸라지 양식에서 많은 문제를 일으키는 수생균을 제거 하기 위하여 말라카이트 그린 및 메틸렌 블루 같은 발암성 소독제를 대신하여 천연유황수를 유용하게 사용할 수 있으 며 잠재적으로 다른 어종 양식에서도 천연유황수를 친환경 소독제로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.