Journal 
서 론
우리나라 양식산업은 1970년대 이후로 빠르게 발전해오 고 있지만, 최근 환경자정능력을 초과하는 양식장의 방류수 로 인해 환경 악화와 이에 따른 양식생물의 면역력 감소 및 빈번한 질병의 발생으로 어려움을 겪고 있다. 양식장의 오 염원 중 질산염은 암모니아 및 아질산염과 함께 주요한 질 소 오염물질 중 하나이다. 수중의 높은 질산염 농도가 문제 를 일으킬 수 있음에도 불구하고, 암모니아와 아질산염이 더 높은 독성을 가진다는 기존의 인식 때문에 질산염에 대한 연구는 거의 이루어지지 않고 있는데 (Alonso and Camargo 2003), 이는 질산염의 수중생물 아가미로의 낮은 침투성 때 문에 암모니아와 아질산염보다 제한적으로 노출되며, 이로 인해 다른 질소태 오염물질에 비해 상대적으로 낮은 위해 성을 일으키는 것에 기인한다 (Jensen 1996). 그러나 수중환 경에서 질산염의 농도는 암모니아와 아질산염보다 매우 높 으며, 최근 환경적 문제로 인해 수중의 질산염 농도가 높 아지고 있어 수중생물에게 큰 위해 요소로 작용할 수 있다 (Camargo et al. 2005).
수중의 높은 수준의 질산염은 어류의 산소운반색소 (oxygen- carrying pigment)인 hemoglobin과 hemocyanin을 산 소를 운반할 수 없는 methemoglobin의 형태로 전환시킴으 로써 주요 독성작용을 나타낸다 (Scott and Crunkilton 2000; Cheng and Chen 2002). 또한, 포유동물에서 소화된 질산염은 잠재적인 발암물질인 니트로사민 (nitrosamine) 형성을 하며, 소화관의 암 발생을 유발할 수도 있다 (Camargo et al. 2005). 이러한 질산염 노출에 따른 독성 영향으로부터 안전한 수산 양식 생산을 이루어내기 위해서는 질산염 노출에 따른 기준 마련이 무엇보다 시급할 것이다.
양식 생산에 위해 요인을 정확하게 평가하기 위해서는 독 성에 따른 신뢰성 있는 기준을 정하는 것은 매우 중요하다. 급성노출을 통한 반수치사농도의 산정은 독성을 이해하는 기준을 마련할 뿐만 아니라, 향후 양식장 현장에서 발생할 수 있는 질산염 만성노출 실험을 위한 농도설정 근거를 마 련해줄 것이다.
어류의 혈액학적 성상은 독성물질의 영향을 평가하기 위 해 가장 중요한 지표 중 하나이며, 어류의 생리 및 병리학 적 변화를 확인하는 지표로 사용된다 (Kim and Kang 2014, 2015, 2016, 2017). 어류의 혈액학적 성상은 어류의 건강상 태를 나타내는 중요한 지표이며 (Harikrishnan et al. 2011), 혈액성상의 변화는 환경 독성에 노출된 어류의 건강의 변 화 및 스트레스에 따른 영향을 판단하는 지표이다 (Kim and Kang 2017). 특히, 어류의 hemoglobin과 hemocyanin과 같 은 산소운반색소에 직접적인 영향을 주는 질산염의 독성기 작을 고려해 보았을 때, 혈액학적 성상을 통한 평가는 좋은 독성 지표가 될 것이다.
본 실험에 이용된 넙치는 우리나라 대표양식 어종이며, 높 은 수요와 상품성을 지닌 어종이다 (Kim et al. 2015b). 넙치 양식장은 다른 어종에 비해서 많은 수량을 필요로 하는 어 종이다. 양식용수의 유입수와 배출수는 가까운 연안에서 공 급 및 배출이 되며, 과다한 양식 배출수로 인한 연안의 오염 으로 정화되지 않은 오염된 유입수는 양식 생물의 건강성을 위협하는 가장 중요한 요소 중 하나이다. 물 교환을 최소한 으로 하는 바이오플락 기법을 이용한 양식방법은 이러한 문 제점을 해결하는 핵심이 될 것이다. 바이오플락은 양식장에 서 발생하는 암모니아 및 아질산염을 바이오플락의 유용미 생물에 의해 낮추는 친환경 미래양식 기법으로 새우를 이용 한 많은 연구가 진행되어 왔다 (Kim et al. 2015a). 하지만, 어 류에서의 바이오플락에 대한 연구는 현재까지 많이 부족한 상황이며, 사육 기준에 대한 연구도 이루어지지 않았다. 따 라서, 본 실험의 목적은 급성 질산염 노출에 따른 바이오플 락과 일반 해수 사육 넙치의 반수치사농도 확인 및 혈액학 적 성상의 변화를 통해서, 사육수 조성에 따른 넙치의 질산 염 내성의 차이를 확인 및 독성기준을 마련하고, 향후 만성 노출실험에 필요한 근거를 제시하는 데 있다.
재료 및 방 법
1.실험어 및 실험환경
본 실험에 사용한 실험어인 넙치는 평균 무게 6.8±1.1 g 의 치어를 받아 바이오플락에서 3개월 동안 키운 실험어와 일반 해수에 유수식으로 3개월 동안 키운 실험어 (전장 19.8± 2.6 cm, 무게 97.8±15.8 g)를 사용하였다. 질산염은 KNO3 (Sigma Chemical, St. Louis, MO, ≥99.0%)를 이용하여 질 산염 20,000 mg NO3 L-1의 표준원액을 증류수에 제조 후, 바 이오플락에서는 0, 62.5, 125, 250, 500, 1000, and 1500 mg L-1, 일반 해수에서는 0, 62.5, 125, 250, 500, and 1000 mg L-1의 농도로 용액을 준비하였다. 각 30 L 사육수조에 노출 물질의 각 농도당 6마리씩 총 78마리를 이용하였고, 노출환 경은 수온 21°C, 염분 33.7‰, pH 8.2, DO 7.4 mg L-1에서 실 시하였다. 질산염 노출 후 실제 측정된 질산염 농도는 해양 환경공정시험기준 (2010)에 따라 카드뮴 - 구리 환원관을 이 용하여, 발색 후 흡광도를 검량선에 대입하여 측정하였고, 농도 값은 Table 1과 같다.
2.독성시험
반수치사농도를 산출하기 위해, 질산염 노출 후 총 96시 간 동안 노출 폐사를 관찰하였다. 노출 96시간 후, 폐사 개체 를 최종확인 후 통계프로그램 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA, probit model)을 이용하여 반수치사농도 수치를 확인하였다. 총 96시간 동안 노출을 하였고, 노출기간 동안 0, 3, 6, 12, 24, 48, 72 및 96시간째에 각 수조에서 폐사한 개체 발견 시 제거하였다.
3.혈액학적 분석 및 혈장성분
독성실험 후 생존한 개체들을 이용하여, 혈액학적 분석 을 실시하였다. 실험어의 혈액은 헤파린 (Sigma Chemical, St. Louis, MO)을 처리한 주사기를 사용하여 채취하였다. Hematocrit는 모세관 내로 혈액을 넣어, Microhematocrit centrifuge (VS-12000, 한국)에서 12,000 rpm, 5분간 원심 분리 후 Micro-hematocrit reader를 이용하여 측정하였다. Hemoglobin 농도는 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd)를 이 용하여 Cyan-methemoglobin법으로 측정하였다. 혈장 성분 을 확인하기 위해 채취한 혈액을 4°C에서 3000×g으로 5분 간 원심분리 후 혈장을 분리하였다.
분리한 혈장으로 혈장 내 효소활성 성분인 AST (Aspartate aminotransferase), ALT (Alanine aminotransminase), ALP (Alkaline phosphatase)를 측정하였다. AST와 ALT는 505 nm에서 Reitman-Frankel법, ALP는 King-King법으로 500 nm에서 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd)를 이용하여 분석 하였다.
4.통계분석 방법
독성실험을 위한 반수치사농도는 probit 모델을 이용하여 SPSS 통계 프로그램 (SPSS Inc.)으로 확인하였다. 본 실험분 석은 노출물질별 농도에 따른 각 6마리를 분석에 이용하였 고, 모든 실험은 3반복으로 이루어졌다. 실험분석 결과에 대 한 통계학적 유의성은 SPSS 통계 프로그램 (SPSS Inc.)을 이 용하여 ANOVA test를 실시하여 Tukey’s multiple range test 를 통해 P<0.05일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
결 과
1.질산염의 급성독성
질산염 노출에 따른 해수와 바이오플락에서 넙치의 생존 율 변화는 Fig. 1에 나타내었다. 일반 해수에서는 질산염 250 mg L-1 이상의 농도에서 노출 후 72시간에 폐사가 발생하였 으며, 500 mg L-1 이상의 농도에서 66% 이상의 높은 폐사의 증가를 보였다. 반면, 바이오플락에서는 1000 mg L-1의 농도 에서 폐사개체는 발생하지 않았으나, 1500 mg L-1의 농도에 서는 100% 폐사를 나타내었다. 이러한 생존율을 바탕으로 반수치사농도를 Table 2에 나타내었다. 질산염의 넙치에 대 한 96시간 반수치사농도는 일반 해수에서 597.9 mg L-1, 바 이오플락에서는 1226.7 mg L-1로 산출되었으며, 일반 해수에 서 상대적으로 높은 반수치사농도 값을 보였다.
2.혈액성상 분석
질산염 노출에 따른 일반 해수와 바이오플락에서 넙치의 hematocrit와 hemoglobin 수치는 Fig. 2에 나타내었다. 일반 해수에서 넙치의 hematocrit는 250 mg L-1 이상의 농도에서 대조구에 비해 통계적으로 유의한 증가를 나타낸 반면, 바이 오플락에서 넙치의 hematocrit는 1000 mg L-1의 질산염 노 출에서만 대조구 대비 통계적으로 유의한 증가를 나타냈다 (P<0.05). 그러나, hemoglobin은 일반 해수와 바이오플락 모두 질산염 농도 의존적 변화가 나타나지 않았다.
질산염 노출에 따른 혈장 효소 성분인 AST, ALT 및 ALP 의 변화는 Fig. 3에 나타내었다. 혈장 AST의 경우, 일반 해수 에서는 500 mg L-1에서, 바이오플락에서는 1000 mg L-1에서 대조구 대비 통계적으로 유의한 증가가 나타났다 (P<0.05). 혈장 ALT는 일반 해수에서는 250 mg L-1 이상에서 대조구 대비 통계적으로 유의한 증가가 나타난 반면, 바이오플락에 서는 1000 mg L-1에서만 대조구 대비 통계적으로 유의한 증 가가 나타났다 (P<0.05). ALP는 일반 해수 및 바이오플락 모두에서 질산염 농도 증가에 따른 처리 그룹 간 통계적으 로 유의한 차이가 관측되지 않았다.
고 찰
본 실험에서 유수식과 바이오플락에서 3개월간 키운 넙치 를 이용하여, 일반 해수와 바이오플락에서 질산염 노출에 대 한 영향을 평가하였다. 우선 높은 질산염의 노출은 실험어 인 넙치에게 독성으로 작용하여, 높은 폐사율을 나타냈다. 질산염에 대한 독성 영향은 종별 민감성의 차이 및 실험 환 경에 따라 달라질 수 있지만, Iqbal et al. (2004)는 질산염에 노출된 common carp, Cyprinus carpio에서 48시간과 96시 간 반수치사농도를 각각 995 mg L-1와 865 mg L-1로 보고한 바 있다. 본 실험에서 질산염 노출에 따른 넙치의 반수치사 농도는 바이오플락에서 1226.7 mg L-1로 일반 해수의 597.9 mg L-1에 비해 상대적으로 높은 수치를 나타내었다. Long et al. (2015)는 바이오플락에서 양성된 tilapia, Oreochromis niloticus에서 높은 면역의 향상을 보고한 바 있다. 다양한 미생물은 수중 생물의 선천적 면역, 항산화 능력 및 질병 저 항력을 향상시키는 probiotics 또는 면역증강제로 작용하며, 바이오플락은 이러한 카로티노이드, 엽록소, 다당류, 식물 스 테롤, 타우린 및 지용성 비타민과 같은 생체활성화합물이 풍 부해 면역력을 향상시킨다 (Irshad et al. 2016). Xu and Pan (2013) 역시 바이오플락은 면역증강제로 작용하여 양식생물 의 생리적 건강상태를 향상시킨다고 보고하였다.
Hematocrit는 전체 혈액 중 적혈구 양의 비율을 나타내는 지표이며, 다양한 독성물질의 노출에 의해 hematocrit의 증 가, 감소, 또는 무변화 등이 많이 보고되어 있다. 본 실험에서 질산염에 노출된 넙치에서 유의한 hematocrit의 증가가 관 측되었는데, 이는 질산염 노출에 의한 혈액용해를 일으키는 적혈구 생성의 증가에 따른 것으로 판단된다. Hematocrit 증 가는 일반 해수에서 250 mg L-1 이상에서 유의적인 증가를 보인 반면, 바이오플락에서 1000 mg L-1에서 유의적 증가를 나타내었고, 이는 바이오플락 넙치에서 일반 해수 넙치보다 질산염에 대한 영향이 덜 미쳤음을 의미한다. Hemoglobin 은 어류의 적혈구 속에 분포되어 있으며, 산소와 가역적으 로 결합하여, 산소를 운반하는 역할을 하며, 어류의 건강을 판단하는 중요한 지표이다 (Kim and Kang 2014). 질산염 독 성의 메커니즘 중 대표적인 것이 hemoglobin의 산화에 의 한 혈중 methemoglobin에 의한 methemoglobinemia이다 (Camargo et al. 2005). 하지만, 본 실험에서 질산염 노출에 의한 hemoglobin의 변화는 나타나지 않았다. van Bussel et al. (2012) 역시 질산염에 노출된 turbot, Psetta maxima에서 질산염 독성에도 hemoglobin의 수치에는 변화가 없었음을 보고하였다.
혈장 효소 성분인 AST와 ALT는 혈장 효소 성분으로 간, 심장 및 근육 등의 조직손상을 판단하는 지표로 많이 사용 된다 (Kim and Kang 2015). 본 실험 결과 넙치에서 질산염 노출에 따라 혈장 AST와 ALT 모두 유의적으로 증가하였다. Vedel et al. (1998) 역시 암모니아에 노출된 rainbow trout, Oncorhynchus mykiss에서 혈장 AST의 유의적 증가를 보고 하였으며, 이는 암모니아에 의한 조직의 괴사에 따른 것으로 판단된다. 반면 ALP에서는 유의적인 변화는 나타나지 않았 다. 혈액성상의 결과 질산염에 의해 넙치의 유의적인 변화를 나타내었으며, 바이오플락에 비해 일반 해수에서 그 정도는 더 유의적으로 나타났다.
본 실험의 결과는 바이오플락 환경에서 사육된 넙치에서 일반 해수에 사육된 넙치에 비해 질산염에 대한 한계농도 및 혈액학적 성상에서 더 높은 질산염 내성을 가지는 것을 확인했다. 최근 빈번하게 발생하고 있는 양식장 환경 악화로 인한 양식생물의 폐사와 연안환경 악화로 인해 현재 우리나 라 양식산업은 새로운 지속 가능한 양식기법을 필요로 하고 있다. 그중 바이오플락을 이용한 어류양식은 기존에 발생하 고 있는 다양한 현안문제를 해결하고, 지속 가능한 우리나라 양식산업의 발전을 이룰 수 있는 획기적인 방법 중 하나이 다. 향후 다양한 환경조건에서 바이오플락 넙치의 생리적 변 화를 확인하는 사육환경 기준 실험이 필요로 할 것이며, 지 속적인 연구를 통한 사육환경 기준의 마련이 시급할 것이다.
적 요
본 연구는 넙치 치어 (평균 체장 6.8±2.6 cm, 평균 체중 97.8±15.8 g)를 바이오플락에 각 농도별 0, 62.5, 125, 250, 500, 1,000, 1,500 mg L-1의 질산염과 일반 해수에 각 농도별 0, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 mg L-1의 질산염을 96시간 노 출시킨 후 생존율 및 혈액학적 변화를 비교하였다. 본 연구 에서 넙치 치어의 반수치사농도 (96 h LC50, 96시간 노출 후 총 개체수의 50%가 폐사하는 농도)는 바이오플락 내의 질 산염 노출 실험구에서는 1,226 mg NO3 L-1, 해수에서는 597 mg NO3 L-1 (P<0.05)였으며, 이는 넙치 유생이 높은 질산 염에 노출되었을 경우, 같은 농도에서도 바이오플락 사육수 보다 일반 해수에서 생물에 독성의 영향이 크게 나타난다고 볼 수 있다. 혈액학적 분석 결과에서는 일반 해수에서 넙치 의 hematocrit는 250 mg L-1 이상의 농도에서 대조구에 비해 통계적으로 유의한 증가를 나타낸 반면, 바이오플락에서 넙 치의 hematocrit는 1,000 mg L-1의 질산염 노출에서만 대조 구 대비 통계적으로 유의한 증가를 나타냈다 (P<0.05). 그러 나, hemoglobin은 일반 해수와 바이오플락 모두 질산염 농 도 의존적 변화가 나타나지 않았다. 질산염 노출에 따른 혈 장 효소 성분 분석 결과에서는 혈장 AST와 ALT의 경우, 바 이오플락과 일반 해수 모두 각 농도별 질산염 노출에 따라 유의하게 증가하였으나, ALP의 경우 두 실험구에서 모두 질 산염 농도 증가에 따른 유의한 차이를 나타내지 않았다.
본 연구에서는 바이오플락 환경에서 사육된 넙치가 일반 해수에 사육된 넙치에 비해 단기간 질산염 노출에 대한 한 계농도 및 혈액학적 성상에서 더 높은 질산염 내성을 가지 는 것으로 나타났다. 이는 일반 해수보다 바이오플락 내의 질산염 노출이 상대적으로 생물에게 낮은 독성을 가지며, 이 와 같은 효과는 양식에 있어 바이오플락을 이용함으로써 잠 재적인 질산염 독성 영향을 경감시켜줄 수 있을 것이다.
