서 론

점액포자충류 (Myxosporeans)는 어류에서 종종 발견되 는 기생충류로, 생활사는 명확하지 않지만 숙주를 바꾸어 가며 다양한 형태로 생존하고 있음을 알 수 있다 (Alvarex- Pellitero and Sitjà-Bobadilla 1993; Kristomundsson and Freeman 2014; Yokoyama et al. 2016). 일본에서 2010년에 발생한 원인불명의 식중독 원인을 조사하는 과정에서 일 본 후생노동성 (Ministry of Health, Labour and Welfare of Japan)에서는 넙치의 근육을 날것으로 섭취함으로써 발생 한 식중독임이 확인되었고, 그 원인체로 점액포자충의 일종 인 Kudoa septempunctata (Myxosporea: Multivalvulida)가 드러나게 되었다 (Kawai et al. 2012; Yokoyama et al. 2015). 본 점액포자충에 의한 식중독과 관련하여 일본 자국 내에 서 역학조사, 원인체 분석, 발병기작 등 병인과 그 병원성에 대한 연구가 매우 활발히 이루어져 왔다 (Kawai et al. 2012; Yoshiko et al. 2014; Takeuchi et al. 2016). 그 결과 구역질, 설사, 구토 등의 증상과 관련하여 쿠도아충의 섭취량은 개 인별 차이는 있지만 약 7.2×10⁷개/인 (Yoshiko et al. 2014) 을 섭취하였을 때 식중독의 병적증상을 보이는 것으로 보고 있다. 쿠도아포자충이 장상피에 도달하여 극사를 방출하고, 포자원형질 (sporoplasm)이 장상피에 침입하여 병증을 유발 하는 것으로 실험적으로 밝혀져 있다 (Yoshiko et al. 2014; Shin et al. 2015; Ohnish et al. 2016).

현재 쿠도아충에 관한 연구는 인체에 대한 영향에 집중되 어 있어 넙치 체내에서의 포자충의 형태와 분포에 대한 연 구는 찾아보기 힘들다. 실질적으로 PCR 검사를 통하여 근 육 내 양성밴드를 확인할 수 있는 검체는 다수 있으나 그중 에서 인체에 영향을 주는 형태인 포자의 형태로 근육 내 존 재할 확률은 급격히 낮아진다. K. septempuctata의 생활사 가 명확히 밝혀져 있지는 않지만, 넙치의 근육 내 기생하는 형태는 포자 이외의 다른 형태로도 관찰될 것으로 보이며, 넙치의 근육 내에서 포자의 형태로 다량 증식하기 위해서 는 숙주와 환경의 영향이 크게 관여할 것으로 보인다 (Chun 2006). 본 연구는 포자충의 숙주 가운데 하나인 넙치에서의 기생형태를 알아보기 위한 기반연구로 넙치의 근육조직 및 혈액을 이용하여 분자생물학적, 조직학적 분석을 위하여 쿠 도아 점액포자충에 대한 PCR 검사를 실시하였으며, 포자가 검출된 개체에서의 각 장기별 PCR 검사에 대한 결과 및 조 직학적 관찰 내용에 관해 검토해보고자 하였다.

재료 및 방 법

1.실험어

양식 넙치로부터 쿠도아포자충이 검출될 확률은 매우 낮 고 (Song et al. 2014) 양식환경에 따라 더 낮아질 수 있으며, 사육 중 폐사발생을 감안하여 양성체 확보를 위한 초기 실 험어의 개체수를 수용이 가능한 최대한으로 설정하여 500마 리로 하였다. 실험에 사용된 넙치, Paralichthys olivaceus (체 장 40.47±1.59 cm, 체중 705.2±96.3 g)는 양어장에서 활어 상태로 본 연구시설에 수송하여 유수식 3톤 (ton) 원형수조에 나누어 수용하면서 2주일 순치시킨 후, 개체구분을 위해 동 물용 chip을 전용주사기를 사용하여 후두부 근육에 이식하 고 같은 주사기를 사용하여 미부 앞쪽에 근육 두께가 깊은 부위를 찔러 근육조직을 적출한 후 약욕하고 2개월간 순치 하였다.

2.양성체 선별

칩 이식용 주사기로 넙치가 살아있는 상태에서 소량의 근 육 (약 0.02 g)을 적출하고 이 근육조직은 멸균증류수 (Ultra Pure Distilled Water, Invitrogen)로 마쇄하여 PCR 검사와 포 자유무확인을 위한 염색에 사용하였다 (Live 검사). DNA Mini kit (QIAGEN)를 사용하여 근육조직으로부터 geonomic DNA를 추출하고, 이 DNA를 주형으로 하여 쿠도아 28S rDNA를 검사부위로 하여 356 bp를 합성하는 PCR 검사법 (이하 KS-PCR 검사) (Grabner et al. 2012)으로 일본 후생노 동성의 제시방법에 따랐다. 본 실험실에서는 상기의 방법에 사용된 KSf 5′-gtgtgtgatcagacttgatatg-3′와 KSr 5′-aagccaaaa ctgctggccattt-3′의 primers를 포함시켜 사전 주문제작한 customized Hotstart PCR premix (Bioneer, Korea)를 사용하 여 annealing 온도 55℃에서 35 cycles로 하여 한 샘플에 대 하여 2회 반복 PCR을 실시하였다. 겔 전기영동에서 확인되 는 양성밴드의 명암 정도를 보고 개체 (No. 1~7, Fig. 1)를 선별하였다. 2회의 PCR 결과가 차이가 나거나 비교적 약한 밴드로 확인되는 개체로 으깬 조직을 슬라이드에 도말하여 100% 에탄올로 고정한 후 Methylene blue (MB)로 염색하였 을 때 포자가 보이지 않는 4개체와, 2회의 PCR 결과가 모두 밝고 두꺼운 밴드로 확인되면서 염색하여 포자가 확인되는 3개체, 총 7개체를 이후 실험에 사용하도록 하였다.

3.순치 2개월 후 샘플링

상기의 선별된 7개체의 실험어는 순치 2개월 후, 칩 리더 기 (Chip reader)를 사용하여 선별하였으며, 혈액을 채취하여 DNA blood & tissue kit (QIAGEN)를 사용하여 혈액으로부 터 DNA를 추출하여 상기의 KS-PCR 검사를 실시하였다. 근 육에서의 PCR 검사는 채혈 후 부검하면서 10% 중성 포르 말린 (Sigma)에 고정된 체측근을 사용하였다. 고정된 근육조 직을 멸균 증류수로 수차례 수세하여 고정액 성분을 제거한 후 DNA Mini kit (QIAGEN)를 사용하여 DNA를 추출하고 KS-PCR 검사를 실시하였다. 7개체 가운데 전기영동에서 밴 드가 명확하게 검출되고, MB 염색에서 포자가 확인된 한 개 체 (chip #74044)를 선택하여 간, 비장, 신장, 심장, 위, 소장, 근육을 샘플링하고, DNA Mini kit (QIAGEN)를 사용하여 각 장기별로 DNA를 추출하여 근육조직과 같은 방법으로 KSPCR 검사를 실시하였다.

4.조직학적 관찰

10% 중성포르말린에 고정한 근육조직과 장기에 대한 조 직처리는 다음과 같다. 조직표본 제작을 위해 세절 (약 8×2 mm 전후)하여 10% 중성포르말린에 2차고정하고 18~24 h 이내에 수세 (3 h)한 후 단계별 알콜 (60~100%)에 탈수하 고, Xylene에 투명화 과정을 거친 후 파라핀 침투시켜 파 라핀 조직블럭을 제작한다. 마이크로톰 (Leica)으로 4 μm의 조직절편을 잘라 슬라이드글라스에 부착하고 건조시킨 후 (45~50℃), H&E (Hematoxylin & Eosin) 염색을 실시하여, 봉입한 후 광학현미경 (Axio ImagerA1, ZEISS)으로 관찰하 면서 영상촬영 시스템 (Zen2012, ZEISS)을 사용하여 이미지 를 캡쳐하였다.

5.분자조직학적 관찰 (In-situ hybridization: ISH법)

ISH를 위한 Dig labeling probe의 합성에는 본 연구실에 서 디자인한 K. septempunctata의 5.8S~ITS2 (GeneBank accession No. LC028894)의 일부분인 185 bp에 대한 primer set (Left 5′-agttactgagtgatccgcga-3′, Right 5′-caagccgtcaacac aaccta-3′)를 사용하였다. K. septempunctata 양성 genomic DNA를 주형으로 Ex Taq polymerase-HS (Hot start Version) 와 2.5 mM dNTP mixture set (TAKARA)를 사용하여 annealing 온도 59℃로 하여 1차 PCR을 실시하고, 여기서 얻어 진 생성물을 주형으로 다시 같은 polymerase와 Dig labeling mix^PLUS (Roche)를 사용하여 2차 PCR을 실시하여 Dig labeling PCR product를 제작하였다. 조직절편은 상법에 따라 포르 말린 고정된 근육조직으로 파라핀 절편을 제작하여 기지의 방법 (Lee et al. 2009; Do et al. 2013)에 따라 Hybridization을 실시한 후, glycerol로 봉입하여 광학현미경 (Axio ImagerA1, ZEISS)으로 관찰하면서 영상촬영 시스템 (Zen2012, ZEISS) 을 사용하여 이미지를 캡쳐하였다.

결과 및 고 찰

1.근육과 혈액의 KS-PCR 검사 결과

500마리의 근육조직에 대한 K. septempunctata의 28S rDNA에 대한 KS-PCR 검사 결과를 확인하고, Fig. 1과 같은 겔 전기영동 결과와 MB염색결과를 통하여 7개체를 선별하 였다. No. 1, 2, 3, 6번 샘플은 MB염색으로 포자가 관찰되지 않았으며 No. 4, 5, 7번 샘플은 포자를 관찰할 수 있었던 개 체이다. 순치 2개월 후 이들 개체의 혈액으로부터 KS-PCR 검사를 실시한 결과, 1, 2, 3, 6번 샘플에서는 밴드의 밝기는 각각 다르지만 양성이었으며, 4, 5번 샘플은 음성이었다. 7번 샘플은 포자는 확인되었지만 매우 약한 양성밴드가 확인되 었다 (Fig. 2).

지금까지 H&E 염색과 같은 일반 조직염색이나 Methylene blue와 같은 단염색을 통하여 포자의 존재 또는 형태를 확 인하거나, 이들의 전자현미경적 미세구조를 관찰한 보고 (Matsukane et al. 2010; Ohnish et al. 2013a)는 있으나 본 연 구와 같이 포자가 관찰되지 않으면서 KS-PCR 검사에서 양 성밴드가 확인되는 경우의 조직표본을 관찰한 예는 없었다. 혈액의 KS-PCR 검사의 경우도 혈액검사를 통하여 검사가 가능하다는 보고 (Yokoyama et al. 2015)만 있었을 뿐, 일반 근육조직에 대한 검사결과와의 차이에 대하여 비교한 예는 없었다. 혈액에 대한 KS-PCR 검사의 결과를 비교해 보면 근 육에서의 겔 전기영동 패턴과 다른 것을 알 수 있다. 즉, 근 육 내 포자가 다수 관찰되는 경우는 KS-PCR에서 근육조직 에서는 양성밴드가 뚜렷하였으나 혈액에서의 결과는 음성이 었다. 이에 반해 근육 내 포자가 관찰되지 않거나 적은 수로 관찰되는 개체의 혈액은 KS-PCR에서 양성밴드가 관찰되었 다. 혈액에서보다 근육에서의 양성밴드가 검출되는 강도는 월등하게 강하지만 검출과 비검출의 경향으로 살펴보면 근 육조직과 혈액의 KS-PCR 검사결과가 반대라는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 성숙포자가 형성되기 이전에 K. septempunctata의 변형체 (plasmodium)가 혈액 내에 포자가 형 성되기 이전 단계의 형태로 유주하거나 혈구나 조직세포 가 운데 식작용을 하는 세포들이 이들을 탐식하여 KS-PCR 검 사에서 검출되었을 가능성이 있다. 혈액 내 변형체가 유주할 가능성도 배제할 수 없지만, 식세포의 식장용 (Phagocytosis) 이 각 조직 내 병원체 혹은 세포 잔체 (cell debris)를 제거하 는 주기능이라 본다면 (Esteban et al. 2015) 식세포 내의 유 전자가 검출될 가능성도 클 것으로 생각된다. 이후 혈액표본 의 형태학적 추가 분석이 이루어져야 할 것이다.

고정근육으로부터 KS-PCR 검사를 실시한 결과, 1, 2, 3번 샘플은 음성, 4, 5, 6, 7번 샘플은 양성으로 확인되었다 (Fig. 3). 포르말린 고정된 근육조직을 대상으로 KS-PCR 검사를 실시했을 때는 포자가 관찰되었던 4, 5, 7번에서 양성밴드가 확인되었으며, 포자가 확인되지 않은 6번 개체에서도 약한 밴드가 확인되었다. 나머지 포자가 확인되지 않았던 1, 2, 3 번 개체에서는 양성밴드가 확인되지 않았다. 7개체 모두 초 기 생체 근육조직 샘플에서 모두 양성밴드가 확인된 샘플들 이지만 고정샘플로부터 KS-PCR 검사를 하였을 때 결과가 달라진 것은 포르말린에 의한 유전자독성 (Mert et al. 2015) 이 근육 내의 변형체나 원형질체에서 작용하였을 것으로 추 정한다.

2.각 장기에서의 KS-PCR 검사 결과

MB염색에서 포자가 뚜렷하게 확인된 대표개체 (#74044) 의 각 장기 (간, 비장, 신장, 심장, 위, 소장, 근육)에 대한 KSPCR 검사 결과, 간, 비장 그리고 위 조직에서는 음성이었으 며 신장과 소장에서는 매우 약한 양성밴드가, 그리고 심장과 근육에서 비교적 명확한 양성밴드를 확인할 수 있었다 (Fig. 4). 이전 보고 (Yokoyama et al. 2015)에서도 근육, 혈액과 함 께 심장에서의 KS-PCR 검사결과에 대하여 언급하였다, 그 러나 심장 조직 내에서 포자가 관찰되는지에 관해서는 검토 하지 않았다. 본 연구에서 조직표본의 관찰 결과 근육에 포 자가 존재하여도 심장조직에서는 포자가 관찰되지 않는 것 을 확인하였다. KS-PCR 검사에서 비교적 강한 양성반응이 나타난 것은 심장 내 혈구세포가 풍부하기 때문이며 혈액분 석에 대한 고찰과 일치하는 내용이 적용될 것으로 생각된다. 또한 소장과 신장에서 약한 양성밴드가 확인된 것은 이들 장기의 조직 내에 K. septempunctata의 변형체나 원형질체 를 탐식한 유주성의 대식세포가 위치할 가능성이 있기 때문 으로 여겨진다.

3.조직학적, 분자조직학적 관찰 결과

H&E 염색을 실시하여 관찰한 결과, 근육조직 이외의 다 른 장기에서는 포자의 형성이나 조직변성이 관찰되지 않았 다. 근육조직의 경우, KS-PCR 검사에서 연한 양성밴드로 확 인되면서 포자가 확인되지 않는 개체의 경우, 근섬유의 괴사 로 인해 근섬유 다발이 융해된 것과 같은 조직변성이 관찰 된다 (Fig. 5). 겔 전기영동에서 명확한 양성밴드가 확인되면 서 포자가 확인되는 개체의 경우는 근섬유 내에 포자가 성 숙되기 전의 중간단계로 보이는 세포들과 근섬유 괴사부위 가 관찰되거나 성숙포자의 집락인 슈도시스트 (pseudocyst) 가 명확히 확인된다 (Fig. 6). 같은 근육조직을 사용하여 ISH 를 실시한 결과 (Fig 7), 근섬유에서 공포가 관찰되면서 명확 한 포자가 관찰되지 않는 경우는 Fig. 7A와 같이 괴사부위 에서 발색반응을 관찰할 수 있었으며, 명확한 포자가 확인되 는 경우는 Fig. 7B와 같이 슈도시스트에서 강한 발색반응이 확인되었다.

근육조직에 대한 H&E 염색의 조직학적 관찰 결과, 모든 개체에서 외관상에 이상은 없었으나 KS-PCR 검사에서 양 성이면서 근육에 포자가 관찰되지 않는 개체의 근육조직에 서, 진행 정도는 다르지만 근섬유 단위로 괴사가 관찰되었 으며 (Fig. 5A, B). 간혹 이 괴사된 근육조직 사이로 포자의 전 단계로 추측되는 세포가 관찰되기도 하였다 (Fig. 5C, D). KS-PCR 검사에서 양성이면서 포자가 관찰되는 개체의 경 우, 근섬유의 괴사와 함께 괴사된 근육의 조직 내에서 포자 가 형성되고 있는 것이 관찰되었으며 (Fig. 6A) 성숙포자가 pseudocyst를 형성하는 것을 알 수 있었다 (Fig. 6B, C). 간 혹 근육조직 내 대식세포 (macrophage)의 집락이 관찰되기 도 한다 (Fig. 6D). 이것은 조직 내에서 포자를 형성하기 이 전 단계의 변형체나 괴사세포를 대식세포가 탐식하기 위한 조직세포의 움직임을 보여주는 것으로 생각된다.

근조직의 괴사가 있거나 슈도시스트가 있는 조직표본에 대하여 ISH를 실시하였을 때도 양성반응이 괴사부위와 슈 도시스트에서 모두 관찰되었다 (Fig. 7). 근섬유 다발의 괴사 부위 내에 K. septempunctata의 변형체 혹은 미성숙포자가 분포하는 것으로 판단되었다. 그러나 이들 세포의 종류와 수 에 따라 유전자가 양적으로 적을 때는 ISH의 반응성이 약 해, 관찰이 어려운 경우도 있다.

이상의 실험개체에 대한 검사결과를 각 개체의 체장, 체중 과 함께 Table 1에 요약하여 정리하였다.

대부분 Kudoa속의 점액포자충은 근육을 포함한 장기에 시스트 (cyst)를 형성하는 조직기생성 (histozoic)이며, 일부 종에서는 근섬유 내에 슈도시스트 (pseudocyst)를 형성하여 근육액화 (myoliquefaction)를 나타내기도 한다 (Moran et al. 1999; Matsukane et al. 2010; Yokoyama 2016). K. septempunctata는 근육조직 내 pseudocyst를 형성하지만 숙주의 염 증반응을 유도하거나, 넙치에 외관상 병적증상을 나타내지 않는 것으로 보고하고 있다 (Matukane 2010). 인체에 해를 미 치는 것은 그 포자로부터 나오는 포자의 원형질 (sporoplasm) 이 사람의 장상피에 침입하여 장조직을 자극하므로써 복통, 구역질, 구토, 설사 등의 식중독 증세를 유발하는 것으로 알 려져 있다 (Ohnishi et al. 2013b). 실질적으로 6~7개의 극낭 을 가지는 포자의 집락인 pseudocyst가 넙치의 근육에 큰 자 리를 차지하고 있는 단계는 K. septempunctata의 생활사에 서 매우 안정적으로 장기간 숙주 (넙치) 조직 내 기생하기 위 한 단계라고 보이며 이 단계 이전의 다른 형태로도 당연히 숙주 내에서 존재할 것으로 생각하였다. 그러나 K. septempunctata가 사람에게 피해를 주는 단계는 넙치 근육조직 내 에서 106개/g 이상의 포자를 함유하고 있을 때라는 것이 실 험적으로 보고되어 (Ministry of Health, Labor and Welfare, Japan) 감염에 대한 확인이 식중독 유발 한계치의 확인에 대 한 검사에 초점을 맞추고 있다. 즉, KS-PCR 검사를 실시하 였을 때 양성밴드가 확인되지만 포자가 검출되지 않는 개체 의 경우는 논외가 되는 경향이다. K. septempunctata의 감염 으로 근육 내 염증반응이 외부증상으로 인식될 만큼 심하 게 진행되는 경우는 없으나 근육 내 포자가 형성되면 근육 의 질적 영향을 미치므로 식품으로써 가치가 하락하게 된다. 이후 혈액과 근섬유 내에서 K. septempunctata의 변형체가 ISH로 확인되는지, 쿠도아 변형체 (plasmodium)에 대한 식 작용 (phagocytosis)과의 관련성에 관한 더욱 면밀한 조사를 해 보아야 할 것이다.

적 요

Kudoa septempunctata에 대한 PCR 검사에서 양성으로 확 인된 개체를 조직 내 포자가 확인된 개체 (3마리)와 포자가 확인되지 않은 개체 (4마리)를 선별하여 순치 후 혈액과 조 직검사를 실시하였다. 혈액에 대하여 PCR 검사를 실시하여 포자가 명확하게 확인되었던 2개체에서는 음성이 확인되었 으며, 다른 5개체는 감도는 각각 차이는 있었지만 양성으로 확인되었다. 포자가 확인된 개체의 각 장기 (간, 비장, 신장, 심장, 위, 소화관, 근육)에 대하여 PCR 검사를 실시한 결과, 심장과 근육에서 명확한 양성이 나타났다. 근육조직의 H&E 염색과 ISH를 실시하여 K. septempunctata의 감염으로 근섬 유에 괴사가 발생하고, 이 부위에 포자의 슈도시스트가 형성 되는 것을 확인하였으나 심한 염증반응을 유도하지는 않는 것이 확인되었다. 이후 혈액에 대한 더욱 면밀한 조사가 필 요할 것으로 보이며, 연구내용은 넙치양식에서의 쿠도아감 염증의 예방과 구제를 위한 기반자료가 될 것으로 기대된다.