서 론

흰다리새우 (Litopenaeus vannamei)는 아열대종으로 남아 메리카가 주산지로 알려져 있지만 현재는 전 세계에서 가장 많은 양식이 이루어지고 있는 품종이다. 특히 광염성으로 낮 은 염분인 1 psu에서 40 psu에서도 서식이 가능하다. 일부 국 가에서는 무병어미관리 및 종묘생산 기술이 확립되어 어미 와 종묘의 국가 간 이동이 활발하고 국제 새우 양식산업의 주요품종이 되었다 (Samocha et al. 1998, 2002). 이러한 광염 성의 생태특성은 사막지대뿐만 아니라 해수를 접하고 있지 않은 내륙지역 담수, 기수에서도 사육수 내 이온균형을 맞 추어 대량양식에 성공하는 사례가 점차 증가하고 있으며 많 은 연구들이 진행되고 있다 (Saoud et al. 2003; Cheng et al. 2006; Roy et al. 2010). 저염분 양식에 따른 새우의 삼투압 조절 기능 (Charmantier and Soyez 1994; Lignot et al. 2000; Palacios et al. 2004), 순치 적정 유생 시기, 순치 시간, 최종 염분농도 (McGraw et al. 2002; Kim et al. 2017) 뿐만 아니 라 저염분에 따른 이온변화 및 염분스트레스가 생존 및 성 장에 미치는 영향 등 다양한 연구가 진행이 되었다 (Liu et al. 2014). 저염분 양식에서 가장 중요한 요인은 삼투압 조 절 능력으로서 흰다리새우의 경우 이온 농도보다 각 이온 간 비율이 중요한 요인으로 작용하고 있으며 부족한 이온 을 첨가하여 비율을 조절하면 최적의 성장과 생산량을 유도 할 수 있기 때문에 적정 비율을 찾는 것이 중요하다 (Boyd 2003; Saoud et al. 2003; McNevin et al. 2004). 지하수의 경 우 낮은 마그네슘 (Mg), 높은 칼슘 (Ca) 농도의 특성을 갖는 데 그 비율에 따라 새우의 생리적인 반응이 달라짐으로 성 장 및 생존율의 큰 차이를 보인다 (Fry 1971; Kinne 1971; Fegan 1992; Roy et al. 2007; Li et al. 2008). 해수에서 생산 된 종묘를 저염분 조건에서 양식을 하려면 가장 먼저 그 염 분에 순치하는 과정을 거쳐야 한다. 일반적인 방법으로는 염 분을 50%/8시간 낮추는 방법이며 이 기간은 비교적 짧기 때 문에 먹이를 공급하지 않고 있다. 새우를 순치과정 없이 바 로 다양한 저염분에 넣어 환경적응 능력을 파악한 많은 연 구들이 있지만 (Parado-Estepa et al. 1987; Rosas et al. 2001; McGraw et al. 2002; Kim et al. 2017) 이 기간동안의 먹이 공급이 미치는 영향에 관한 연구는 이루어지지 않았다. 그러 나 염분에 순치하는 어린 유생은 PL 10~20기 사이로 염세 포가 형성이 되어 염분조절이 가능한 시기인데, 유생발달이 빠르게 진행되어 에너지 소비와 영양분의 결핍이 될 경우 생존율에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Davis et al. 2004; Jayasankar et al. 2009). 본 연구에서는 순치기간동안 먹이를 섭취한 경우와 섭취하지 않았을 때에 유생의 생리특 성의 변화를 조사하여 적응과정에서의 스트레스를 감소시 키고 향후 저염분에서도 최적의 성장과 생존율을 유도할 수 있는 방법을 모색하고자 하였다.

재료 및 방 법

1. 실험설계 (Experiment design)

실험은 해수에 지하수를 첨가하여 염분구간별로 2, 8, 16, 24, 32 psu로 맞추어 사용하였다. 수온은 가온기로 실온 28℃로 유지하였으며 사육수는 2일 전 실험실로 옮겨 28℃ 수온을 맞추었다. 실험수조는 1 L 비이커 총 30개로 염분구 간별 먹이섭취구 (fed group), 비섭취구 (starved group)로 나 누어 3반복으로 실험을 실시하였으며 비이커마다 산소를 공 급하였다. 실험에 이용한 흰다리새우의 평균체중과 유생발 달단계는 PL 21기 (postlarvae, 11.75±3.12mg)로 실험시작 1일전 (PL20)에 옮겨와 먹이를 공급하지 않고 환경에 순치 후 30마리씩 각 비이커에 수용 (총 900마리)하여 진행하였 다. 먹이섭취 실험구는 초기배합사료 (CP 40%, pellet)를 체 중의 10% 일일 1회 공급하였으며 비섭취구는 사료를 공급 하지 않았다. 24시간 단기간 순치 후 전량 수거하여 증류수 로 빠르게 세척을 한 후 물기를 제거하고 원심분리관 (micro centrifuge tube)에 넣어 분석 시까지 냉동보관을 하였다 (- 90℃). 해수 및 지하수의 이온농도를 이온 크로마토그래 피 (ICS-1100, Thermo Fisher Sci., Germany)를 이용하여 5가 지 이온 (Na, Cl, K, Mg, Ca)을 분석하고 이온불균형에 의한 생존율에 미치는 가능성을 파악하였으며, 그 결과는 Table 1 과 같다.s

2. 체액분석 (Body fluid factors)

원심분리관의 무게를 측정 후 새우시료를 10~15마리씩 넣어 다시 무게를 측정하여 유생 한 마리의 무게를 산정 하 였다. 새우 시료의 크기가 작아 혈림프를 채혈하기가 어려 워 증류수 250 μL를 넣고 수동 마쇄기를 이용하여 얼음위 에서 전체 유생을 분쇄한 후 다시 250 μL의 증류수 (ice cold distilled water)를 넣어 총 500 μL의 시료를 준비하였으며 본 연구에서는 체액분석으로 정의하였다. 그 후 원심분리 (8,000 rpm, 10분, 4℃) 후 상층액을 분리하여 혈액분석기 (Fuji Dri-Chem, 3500i, Japan)를 이용하여 혈액분석 (protein, cholesterol, glucose, triglyceride, creatine, BUN (Blood urea nitrogen))을 실시하였다.

3. 소화효소분석 (Enzyme activity)

소화효소 분석은 체액분석 시 남은 상등액을 활용하였 으며 TG-Lipase 활성은 p-NPP 방법으로 405 nm (Hung et al. 2003), α-Amylase는 Bernfeld (1955)에 따라 최대 흡 수파장인 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, trypsin은 Erlanger et al. (1961)에 따라 410 nm에서, alkaline protease 는 Dabrowski and Glogowski (1977)의 방법에 따라 410 nm 에서 분광광도계 (Molecular Devices, SpectraMax i3)를 이용 하여 각 효소별 흡광도에 따라 분석하였다. 효소활성은 먹이 섭취와 비섭취 실험구의 사료의 유무, 시료의 크기 및 마리 수로 인한 단백질 함량의 차이에 의한 오차를 없애기 위하 여 각 효소의 활성 단위인 unit를 다음과 같이 정의하여 사 용하였다. 즉 1 unit는 1분당 1 μmol의 p-NPP를 유리시키 는 lipase, 1 μg의 maltose를 생성하는 α-Amylase, 1 μmol의 BAPNA를 유리시키는 Trypsin, 1 μg의 azo-casein을 유리시 키는 protease의 양으로 정의하고 희석비율에 따른 총 활성 을 구한 후 시료의 무게로 나누어 각 효소활성을 표시하였 다.

4. 통계처리 (Statistics)

소화효소 및 체액분석의 결과는 SPSS (Statistical Package for Social Science, version 13 software) 통계프로그램으로 먹이섭취 실험구와 비섭취구를 분리하여 각 실험구별로 염 분구간에 따라 일원분산분석 (one-way ANOVA, Duncan’s multiple range test (p<0.05))에서 유의성 검증을 실시하여 염분별 먹이섭취 실험구는 대문자로, 절식 실험구는 소문자 로 유의적인 차이를 표시하였다. 동일 염분에서 먹이섭취 유 무에 따른 비교는 t 검정분석을 이용하였으며 별 (*)표시로 p<0.05에서 유의적인 차이를 표시 하였다.

결과 및 고 찰

1. 생존율 (Survival rate)

저염분에서 새우를 양식할 경우 생존율에 영향을 미치는 요인은 유전적인 요인 이외에 종묘의 건강도, 사육수의 이 온불균형과 같은 환경스트레스, 먹이의 품질, 섭취량 등 다 양한 원인에 의해 결정이 된다. 후기 유생 (PL20)의 경우 이 시기에 소화기관 (Abrunhosa and Melo 2008)과 생식기관 (Garza-Torres et al. 2009), 삼투압 조절기관이 형성이 되며 저염분에 적응하기 위해 많은 에너지를 소비하게 된다. 그 러므로 삼투압조절에 필요한 에너지를 보충 할 수 있는 먹 이가 없을 경우는 생존율이 낮아지게 된다 (Palacios et al. 2004). 염분구간별 유생의 영향을 평가하기 전에 예비실험 으로 2 psu부터 자연해수인 32 psu까지 2 psu 간격으로 염분 을 조절한 후 PL 20기의 유생 30마리씩 총 3반복으로 실험 한 결과 사망이 일어나는 시기는 각 염분농도에 유생을 넣 6시간 이내에 발생하였으며 그 이후에는 폐사가 일어나 지 않았다. 염분이 낮은 2 psu에서 45.6%의 높은 사망률을 보였으며 10 psu에서는 1.1% 그리고 12 psu 이상의 염분에 서는 폐사가 발생하지 않았다 (Fig. 1). 이러한 예비실험을 바 탕으로 실시한 본 연구에서 염분구간별 생존율을 보면 가 장 낮은 구간인 2 psu에서는 먹이를 섭취한 경우에 생존율이 81.1±12.3% (SD; standard deviation), 먹이를 섭취하지 않 은 경우는 86.7±7.2%로 차이를 보였으나 이 구간을 포함한 다른 염분구간에서 먹이를 섭취한 것과 섭취하지 않은 실험 구간의 통계적으로 유의한 차이는 없었다 (Fig. 2). 염분농도 에 따른 생존율의 차이를 보면 2 psu에서는 먹이섭취구와 비 섭취구 모두 8 psu를 제외하고 16, 24, 32 psu 구간과는 유의 적으로 낮은 생존율을 보였다. 염분농도 16 psu 이상에서는 먹이를 섭취한 실험구에서 모두 생존율이 100%였으며 먹이 를 섭취하지 않은 경우는 97.8±3.1%, 100%, 97.8±3.1%로 조사되었다.

순치과정에서의 저염분 스트레스에 의한 사망 개체의 증 가 이외에도 이온 농도 및 불균형이 사망 개체 증가의 원인 으로 작용하는데, Roy et al. (2007)의 연구에서 새우 유생 의 성장은 Na/K, Mg/K, Mg/Ca의 비율이 자연해수의 비율 (28.5, 3.7, 3.4)에 근접할수록 좋았지만 생존율은 Mg/K 비 가 0.73~10.1, Mg/Ca이 0.37~1.98인 경우는 유의적인 차이 를 보이지 않았다. 본 연구에서도 가장 낮은 2 psu 구간에서 Mg/K의 비가 1.79, Mg/Ca의 비가 1.88로 생존에 영향을 미 치지 않는 범위로 조사되었다. 그러나 Na/K의 비가 22~33 이상 또는 이하의 경우 생존율에 영향을 미친다는 Liu et al. (2014)의 보고와 같이 본 연구에서의 2 psu에서는 3.86으로 적정 범위를 벗어나 Na/K의 비율이 염분농도에 따라 생존 율에 영향을 미치는 요인이 될 수 있었다. 본 연구에서는 비 록 이온의 불균형을 이루어 순치과정에서 염분에 따라 생존 율의 차이를 보였지만 먹이섭취 유무에 의해서는 생존율의 차이를 보이지 않았다. 향후 염분에 따른 이온불균형의 영향 을 조사하면 순치된 이후의 최대 성장과 생존을 유도할 수 있을 것으로 파악되었다.

2. 체액분석 (Body fluid factors)

염분농도별 흰다리새우 유생의 체액성분 분석을 한 결 과는 Fig. 3과 같다. 먹이를 섭취한 실험구와 섭취하지 않 은 실험구간의 유의적인 차이를 보인 요소는 glucose와 triglyceride이었으며 이 요소들은 염분농도에 따른 차이를 보이진 않았다. 다른 요소인 protein, cholesterol은 일부 염분 구간을 제외하고 glucose와 triglyceride와는 반대로 먹이섭 취와 비섭취에 따른 차이를 보이지 않았지만 염분농도에 따 라 차이를 보였다. 먹이를 섭취한 실험구에서 일반 해수 염 분농도인 32 psu를 제외하고 cholesterol의 농도가 먹이 비 섭취구보다 약 1.25~2.6배 더 높았다. 건강도를 알아볼 수 있는 혈림프 지표로서 glucose, triglyceride는 에너지원으 로 활용이 되며 먹이를 섭취한 염분 실험구에서 4.2~7.6배, 2.7~3.4배 높은 것으로 분석되었다. 갑각류는 개방순환혈관 계를 갖고 있어 지질을 포함한 영양분의 기관 간 수송이 혈 림프를 통해 이루어지고 있다. 새우의 초기 유생발달에 중요 한 에너지원인 Triglyceride와 cholesterol은 사료의 지질 함 량이 증가하면 혈림프 내 농도 또한 증가하는 것으로 보고 되었다. 본 연구에서도 먹이섭취에 의하여 cholesterol 값이 더 높은 것으로 나타났지만 통계적 유의적 차이는 없었던 반면 triglyceride는 2.7~3.4배로 유의적으로 큰 차이를 보 였다. 이는 본 연구가 단기 순치실험으로 생존율에 큰 영향 을 미치지 않았지만 저염분 순치기간동안에 먹이를 섭취하 는 것이 신진대사가 활발한 초기 유생의 향후 성장에 영향 을 줄 것으로 추정되었다.

새우와 같은 갑각류가 저염분에 노출 시 세포막의 인지 질의 포화지방산 비율과 지방산 사슬 길이의 증가, HUFA 의 감소로 물과 이온의 투과성이 감소하며 (Whitney 1974; Morris et al. 1982), 신장기관 (renal organ)을 통한 물의 배 출이 증가하여 체내 삼투물질 (osmolyte)의 농도를 조절하게 됨으로 외부와의 삼투압 차이를 감소시키게 된다. 막의 투 과성을 조절할 수 있는 지질은 cholesterol과 phospholipids (Whitney 1974; Hazel and Williams 1990)인데 새우에는 필 수 cholesterol 요구량이 적어 (Teshima 1982) 갑각류의 삼투 압조절원으로 작용할 것으로 여겨지지 않았으나, cholesterol 은 인지질 이중층을 통해 물과 Na⁺투과성을 억제하며, ATP 와 에너지 소비를 줄여주고 (Haines 1994), 스테로이드 및 탈피호르몬의 전구체로서 작용하기 때문에 (Teshima et al. 1997) 저염분 적응을 위한 중요한 요소로 작용한다. 직접적 으로 삼투압을 조절할 수 있는 요인은 혈중 이온 이외에도 glucose와 BUN의 농도를 들 수 있는데 직접 혈림프를 채 혈하기 어려운 유생시기에 삼투압을 추정할 수 있는 공식 인 Serum osmolality=2Na⁺ (mEq L^-1)+2K+ (mEq L^-1)+ (BUN[mg dL^-1])/2.8+ (Glucose[mg dL^-1])/18 (Purssell et al. 2001)에서 볼 수 있듯이 두 개의 혈림프 요소가 삼투압 결정 에 영향을 미치기 때문이다. 새우 혈림프 내 glucose의 농도 증가는 잦은 시료채취 (Racotta and Palacios 1998), 포르말린 과 같은 약품에 노출 되었을 때 (Hall and van Ham 1998), 산 소가 부족할 경우 (van Ham and Hall 1998), 고농도의 암모 니아에 노출 (Racotta and Hernández-Herrera 2000; Mugnier and Justou 2004) 되었을 때 등 스트레스 반응에 의한 것으 로 잘 알려져 있는데 본 연구에서는 염분구간에 따른 차이 가 없어 염분 스트레스보다 먹이섭취로 인한 체액 내 농도 증가로 파악되어 순치기간에 삼투압 조절에 먹이섭취가 중 요한 작용을 할 것으로 추정되었다. 혈중요소성질소 (BUN) 는 16 psu 실험구를 제외하고 먹이섭취와 비섭취 시 그리고 염분농도에 따라 유의적 차이를 보였으며 가장 낮은 값은 저염분 먹이섭취구인 2 psu에서 0.14±0.02 μg mg^-1, 가장 높 은 값은 먹이를 섭취하지 않은 자연해수 32 psu에서 0.24± 0.01 μg mg^-1, 혈중요소성질소는 단백질대사산물로서 먹이의 단백질 함량 (Evans and Witty 1978; Melo et al. 2006)에 의 해 차이를 보이기도 하며 농도의 증가 시 노폐물을 배출하 는 기능의 이상을 나타내는 요소이다. 본 연구에서는 먹이를 섭취하지 않았을 경우 오히려 더 높은 값을 보였다. 그 이외 에 조직손상의 지표가 되는 creatine의 농도를 보면 먹이를 섭취하지 않은 경우에 섭취한 구간보다 1.1~1.5배 더 높은 값을 보였지만 개체간의 차이가 매우 커서 8 psu를 제외하고 통계적으로 유의적인 차이를 볼 수는 없었다.

3. Enzyme activity

저염분 순치 시 먹이섭취와 비섭취에 의한 새우 소화효소 의 활성은 Fig. 4와 같다. Lipase는 염분 24 psu를 제외하고 모든 염분 실험구에서 먹이를 섭취한 경우와 섭취하지 않은 실험구간의 유의적인 차이를 보였다 (t-test, p<0.05). 먹이를 섭취한 2 psu 실험구에서 가장 낮은 효소활성이 3.03±0.15 U mg^-1을 보였으나 16 psu와 32 psu와는 통계적으로 유의적 인 차이를 보이지 않았으며 중간 염분구간인 8 psu와 24 psu 에서 차이를 보여 염분농도와 효소활성 간 뚜렷한 상관관계 는 보이지 않았다. 먹이를 섭취하지 않은 경우는 모두 낮은 lipase의 활성을 보였으나 24 psu에서 특이하게 높은 값을 보 였는데 이는 공식이 전혀 일어나지 않은 생존율 100% 구간 으로 표준편차가 매우 컸으며 예외적으로 일부개체 체내에 잔류하고 있는 먹이에 의한 활성의 증가로 추정이 되었고 그 이외의 염분구간은 활성의 차이를 보이지 않았다. 그 이 외의 소화효소인 α-amylase, trypsin, alkaline protease의 경 우 먹이를 섭취한 실험구에서 가장 낮은 활성은 모두 저염 분 구간인 2 psu에서 나타났으며 먹이를 섭취하지 않은 실험 구에서는 세 가지 효소 모두 8 psu에서 가장 낮은 활성을 보 였다. 또한 8 psu와 가장 높은 활성을 보인 염분 32 psu 실험 구 사이에는 세 효소 모두 유의적 차이를 보였다. 저염분 (3, 17, 32 psu)에서의 소화효소활성을 분석한 Li et al. (2008)의 연구에서는 염분이 가장 낮은 3 psu에서 trypsin의 경우 유의 적으로 낮은 활성을 보였으며 amylase, cellulase, lipse의 경 우는 차이가 없었고, Rosas et al. (2001)의 연구에서는 저염 분에서 소화효소의 활성이 더 높거나 같았다고 보고되었다. 본 연구에서는 먹이를 섭취한 경우 염분구간과 효소의 활성 과의 뚜렷한 상관관계를 보이지 않았으나 저염분인 2 psu에 서 가장 낮은 활성을 보였고, 먹이를 섭취하지 않은 실험구 에서는 자연해수인 32 psu보다는 염분이 낮을 경우에 소화 효소활성이 유사하거나 오히려 줄어드는 경향 있는 것으로 조사되었다.

적 요

저염분 순치기간에 먹이를 섭취함으로서 얻을 수 있는 초 기 유생의 생리적 변화는 다음과 같이 요약할 수 있다. 하루 동안의 순치기간에 염분농도에 따른 유생의 생존율은 차이 를 보였지만 각 염분구간별 먹이섭취 유무에 따른 생존효과 는 유사하였다. 그러나 먹이섭취 시 유생이 에너지원으로 활 용할 수 있는 cholesterol, triglyceride의 증가가 있었으며 삼 투압에 영향을 미칠 수 있는 glucose 농도가 유의적으로 증 가하였다. 또한 저염분 순치기간 동안에 스트레스, 조직손상 및 대사작용의 지표가 되는 BUN과 creatine의 감소가 있었 다. 먹이섭취로 인한 소화효소의 활성이 먹이를 섭취한 실험 구 모두에서 증가하였다. 그러므로 유생발달과 함께 중요한 소화, 순환, 생식기관이 형성되며 탈피 성장을 위한 신진대 사가 빠르게 진행되는 유생시기에 저염분 순치가 효율적으 로 이루어져 향후 지속적인 성장을 유도하기 위해서는 먹이 를 섭취하는 것이 더 효과적인 것으로 판단되었다.