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서 론
방오도료는 선박의 선체에 부착 및 성장하는 해양생물 을 억제하기 위해서 사용되는 물질로, 선체의 부식 및 연료 소비를 감소시켜주기 때문에 선박 운항에 매우 중요하다 (Fernandez-Alba 2002; Schultz 2007; Soroldoni et al. 2017). 방오도료로 가장 널리 알려져 있는 물질은 유기주석화합물 의 일종인 Tributyltin (TBT)로 방오능력이 대단히 뛰어났으 나, 어패류 등에 농축되었을 경우 기형 및 Imposex를 유발 시키는 내분비교란물질로 밝혀지면서, 2003년부터 국제해사 기구 (IMO)에서 단계적으로 제한하여 2008년에 사용을 전 면 금지시켰다 (Jacobson and Willingham 2000; Jung 2012; Lee et al. 2016). 이러한 TBT를 대체하기 위해 고농도의 아 산화동 (copper oxide)을 사용하였지만 유기주석화합물 보다 방오능력이 떨어져, 현재 Diuron, Igarol, Cu pyrithione (CP), Zinc pyrithione (ZP), Sea-nine 211 (SN), Zinc undecylenate (ZU), Ziram, Zineb 등과 같은 신방오도료가 사용되고 있다 (Jung 2012; Shin et al. 2015).
신방오도료 중에 ZU는 일반적으로 이온화된 Undecylenate에 의한 항균작용을 이용하여, 피부 연고 및 헤르페스 바 이러스 (herpes virus)를 살균하는 의약품으로 사용되는 물 질이다 (Lin et al. 2006). ZU는 동물 피부 자극실험 (rabbit, guinea pig, mouse)에서 다른 아연화합물에 비해 생물영향 이 적다고 알려져 있으나 (Lansdown 1991), 방오능 검사결과 미세조류 (Navicula incerta)의 성장률을 감소시켰으며, 파래 (Ulva prolifera) 포자의 운동성에 영향을 미치는 것으로 알 려져 있다 (Jung 2012). 또한, 이온화된 Zn은 중금속으로써 해산로티퍼 (Brachionus plicatilis)와 미세조류 (Skeletonema costatum)의 개체군 성장률에 영향을 미쳤고 (Hwang et al. 2014, 2016), 브라질 Patos lagoon 강의 퇴적물에서 분리한 방오도료 입자에서 Cu와 Zn이 가장 높게 검출되었다는 보 고도 있다 (Soroldoni et al. 2017).
방오도료는 항구, 조선소, 어항 (fishing port) 등과 같은 해 상활동이 두드러진 지역에서 높은 농도로 나타난다 (Lam et al. 2017). 우리나라 연안에서 부틸주석화합물을 제외한 신 규방오도료의 평균 농도가 2006년 10.5 ng L-1에서 2009년 50.3 ng L-1로 약 5배 정도 농도가 증가하였으며, 2009년 군 산지역에서 평균최대농도 215.18 ng L-1로 오염이 확대되고 있는 것으로 보고되었다 (Lee et al. 2011, 2015). 특히 양식장 이 밀집해 있고 해안선이 복잡한 서해와 남해지역에서 신방 오도료 농도의 증가가 두드러지며 (Lee et al. 2011), 이로 인 해 양식생물의 체내 축적뿐만 아니라 직·간접적으로 이를 섭취하는 인류의 보건에도 심각한 영향을 미칠 수 있을 것 으로 생각된다.
본 연구에서는 해양생태계 내에서 1차 소비자이며, 해산 어류의 치어기 먹이생물인 해산로티퍼 (B. plicatilis)의 생존 및 개체군 성장률을 이용하여 ZU 독성에 의한 무영향농도 (No Observed Effective Concentration; NOEC), 최소영향농 도 (Lowest Observed Effective Concentration; LOEC) 및 반 수영향농도 (50% Effective Concentration)를 나타냈다. 이러 한 연구결과는 신방오도료 물질의 생태안정성 평가를 위한 기준치 설정 및 다른 신방오도료 물질과의 독성치을 비교할 수 있는 유용한 자료로 활용될 것으로 판단된다.
재료 및 방 법
1. 시험생물
시험생물 B. plicatilis는 서해수산연구소 해양생태위해평 가센터 항온실에서 3개월 이상 계대배양하며 이용하였다. 배 양액은 자연해수를 0.45 μm membrane filter로 여과 한 후에 멸균하여 사용하였고, 먹이생물로 Chlorella vulgaris를 하 루에 한 번 공급하였다. 실험당일 계대배양중인 B. plicatilis 에서 포란중인 성체 (amitic female)를 분리하고 2시간 이내 부화된 암컷 신생개체 (female neonate) 중 운동성이 활발한 neonate를 선별하여 시험에 사용하였다 (Fig. 1).
2. Zinc undecylenate 조성
시험에 사용된 Zinc undecylenate (Phenanthrene, Sigmaaldrich, USA)은 DMSO (Dimethylsulfoxide, Sigma-aldrich, USA)를 carrier solution으로 사용하여 100,000 mg L-1의 stock solution을 제작한 뒤, 멸균된 자연해수로 희석하여 사 용하였다. 시험용액에 사용된 DMSO의 최대 농도는 0.1%로 B. plicatilis에서 독성이 나타나지 않는 농도로 사용하였다 (Gallardo et al. 1997). 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위 하여 ZU의 농도는 0, 12.5, 25, 50, 100 mg L-1으로 조성하였 고, 개체군 성장률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 농도를 0, 3.1, 6.3, 12.5, 25.0, 50.0 mg L-1로 조성하였다. 개체군 성 장률 시험의 농도 구간은 사전 예비실험을 바탕으로 설정하 였고 생존율 시험의 최고농도는 개체군 성장률 대비 2배로 설정하였다.
3. 생존율
생존율 시험은 24-well plate에 시험용액을 농도별로 1 mL 씩 6반복 실시하였다. 2 h 이내 부화한 B. plicatilis의 neonate 를 well 당 5개체씩 넣고 25±1.0℃에서 24 h 암 배양 한 뒤, 현미경을 이용하여 생존한 개체수를 계수하고 생존율을 계 산하였다 (Table 1). B. plicatilis의 생존 여부는 시험물질에 노출된 neonate의 유영 운동성 및 내부기관 (섬모와 저작기) 의 활성에 따라 판단하였고 (Fig. 1), 대조구의 생존율이 90% 이상일 경우 유의한 시험결과로 사용하였다 (ASTM 1991).
4. 개체군 성장률
개체군 성장률 (r)은 24-well plate에 시험용액을 농도별 로 1 mL씩 6반복 실시하였다. 먹이생물 C. vulgaris는 원심 분리하여 미세조류 배양액을 최대한 제거하여 사용하였고 각 실험구당 200만 cell mL-1을 급여하였으며, 추가적인 C. vulgaris는 급여하지 않았다. B. plicatilis의 neonate를 well 당 5개체씩 넣고 25±1.0℃에서 72 h 암 배양한 뒤 (Jansen et al. 1994), 3% 포르말린으로 고정하고 현미경으로 모든 개 체수를 계수하여 개체군 성장률을 계산하였다 (Table 1). 개 체군 성장률은 아래와 같은 상대생장률 계산식으로 도출하 였고, 대조구의 개체군 성장률이 0.5 이상일 경우에 유의한 시험결과로 사용하였다 (Lee et al. 2016).
5. 통계분석
대조군과 실험군의 유의성 검정은 SigmaPlot software (Sig maPlot 2001, SPSS Inc., USA)의 Student’s t-test로 비교하 였으며 p가 0.05 이하인 것을 유의한 것으로 판단하였다. 생 존율 및 개체군 성장률에 대한 반수영향농도 (50% Effective Concentration; EC50)와 95% 신뢰구간 (95% Confidence Limit; 95% Cl)은 Toxicalc 프로그램 (Toxicalc 5.0, Tidepool scientific software, USA)의 probit 통계법을 이용하여 분석 하였다. 무영향농도 및 최소영향농도는 Toxicalc 프로그램의 Dunnett’s test를 이용하여 분석하였다.
결 과
1. 생존율 변동
24 h 동안 Zinc undecylenate (ZU)에 노출된 B. plicatilis의 생존율 변화를 Fig. 2에 나타냈다. 대조구의 생존율은 90% 이상으로 시험조건에 적합하였으며, ZU 농도가 증가해도 생 존율에는 변화가 나타나지 않았으며, 실험 최고농도 100 mg L-1에서도 변화가 없었다 (Fig. 2).
2. 개체군 성장률 변동
72 h 동안 ZU에 노출된 B. plicatilis의 개체군 성장률 변화 를 Fig. 3에 나타냈으며, 대조구의 개체군 성장률은 0.5 이상 으로 시험에 적합한 것으로 나타났다. 개체군 성장률은 6.3 mg L-1 이하의 농도구에서는 대조구와 유의한 차이가 없었 지만, 12.5 mg L-1에서 대조구와 비교해 11.0% (0.44±0.03) 감소해, 유의적인 차이를 나타냈다 (p<0.05). ZU의 농도가 증가 할수록 개체군 성장률은 감소해, 25.0 mg L-1에서 대 조구 대비 48.4% (p<0.01)를 나타냈으며, 50.0 mg L-1에서 는 대조구 대비 90% (0.05±0.04) 이상 감소하였다 (p<0.01) (Fig. 3).
3. 생존 및 개체군 성장률을 이용한 독성평가
본 실험에서 시험최고 농도인 100 mg L-1에서도 생존율 은 대조구와 비교하여 특별한 변화를 나타내지 않았으나, 개 체군 성장률은 ZU 농도가 증가할수록 감소하는 농도 의존 적인 결과를 나타냈다. 또한, ZU에 대한 개체군 성장률의 반 응은 표준독성 반응으로 잘 알려진 Sigmoid 형태를 나타내 (Fig. 4), B. plicatilis의 개체군 성장률은 ZU와 같은 신방오 도료 물질의 독성평가에 유용한 지표인 것으로 판단된다. 이 들 실험결과를 이용한 ZU에 대한 개체군 성장률의 EC50은 26.4 (19.5-37.0) mg L-1, NOEC는 6.0 mg L-1, LOEC는 12.5 mg L-1를 나타내었다 (Table 2).
고 찰
TBT로 대표되는 유기주석화합물을 이용한 방오도료는 해양생물에게 다양한 영향을 미치는 것으로 알려져 왔지 만 (Barr et al. 2018), 특히 어패류에서 Imposex 현상, 기형, DNA 손상 등을 유발하는 것으로 잘 알려져 있다 (Jacobson and Willingham 2000; Jung 2012, Sousa et al. 2014). 이러 한 이유로, TBT 사용으로 인한 오염 피해가 발생하지 않도 록 하기 위하여 TBT를 대체할 수 있는 신방오도료를 사용 해 오고 있다 (Sousa et al. 2014; Oliveira et al. 2017). 이론 적으로 신방오도료는 환경에 악 영향을 미치지 않도록 독성 이 없어야 하지만 (Zecher et al. 2018), biocide의 기능을 가 져야하는 특성상 현재 사용되는 신방오도료도 비표적 해양 생물에게 독성을 나타내고 있다 (Jung et al. 2017). 현재 다 양한 생물을 이용하여 신방오도료에 대한 생물독성평가가 수행되고 있지만 (Fernandez-Alba 2002; Kwok and Leung 2005; Bellas 2006; Ytreberg et al. 2010; Jung et al. 2017), 해 양생물을 이용하여 ZU의 독성평가를 한 연구는 다른 신방 오도료에 비해 거의 찾아볼 수 없다 (Tables 3, 4). 특히, 동물 성플랑크톤으로 어류 치어기 먹이생물로써 중요한 역할을 담당하는 해산로티퍼 B. plicatilis를 사용한 연구는 전무하 다. 스웨덴 해양국 (Swedish Maritime Administarion)에서 허 용한 친환경 방오도료 5개 (Mile light, Micron Eco, SSC-44, Legant H2000 및 Intersleek 700)에 노출된 조류 (Ceramium tenuicorne)와 갑각류 (Nitocra spinipes) 조차도 독성이 나타 난 것을 미루어 보아 (Karlsson and Eklund 2004), ZU도 잠 재적으로 해양생물에게 영향을 미칠 가능성이 있다.
본 연구결과, ZU에 72 h 노출된 B. plicatilis의 개체군 성 장률은 ZU의 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 감소 하는 현상을 보였지만, 생존율은 노출 24 h 후 최고농도 (100 mg L-1)에서도 대조구와 유의한 차이를 나타내지 않았다. 개 체군 성장률이 생존율에 비하여 민감하게 나타나는 것은 노 출시간의 증가와 더불어, 생존율보다 개체군 성장률이 독성 에 민감하게 반응하는 것으로 설명할 수 있다 (Hwang et al. 2016; Lee et al. 2016). Garaventa et al. (2010)에 의하면 신 방오도료 물질인 Zin pyrithione (ZP)의 경우에 노출시간이 24 h에서 48 h으로 길어지면, B. plicatilis와 같은 동물성플랑 크톤의 생존율에 영향을 주는 것으로 보고하고 있다. 본 연 구에서 ZU에 대한 개체군 성장률의 반응은 표준독성 반응 인 sigmoid 형태를 나타내, 개체군 성장률은 ZU와 같은 신 방오도료 물질의 독성을 평가하기 위한 적절한 시험으로 판 단된다.
ZU는 다른 방오도료 물질과 비교하여 플랑크톤류, 해조 류, 박테리아와 같은 생물별 독성 범위가 다양하게 나타나 는 것으로 보고하고 있다 (Jung 2012). 본 연구에서 ZU에 노 출된 B. plicatilis는 100% 생존하여 LC50이 >100 mg L-1 로 예측되는 것에 비해, B. plicatilis를 Cu pyrithione (CP) 에 24 h 노출한 경우 LC50이 24 μg L-1 (Li et al. 2014), ZP에 24 h 노출한 경우 LC50이 0.07 μg L-1로 나타나 (Garaventa et al. 2010), ZU는 ZP와 CP에 비해 독성이 낮은 것으로 판 단된다. 또한, ZU에 노출된 파래 (Ulva prolifera) 포자의 운 동성도 ZU가 ZP보다 10,000배 이상 독성이 낮았으며 (Jung 2012), 구멍갈파래 (Ulva pertusa) 포자를 6일간 방오도료 에 노출한 결과도 ZP와 CP가 독성이 큰 것으로 나타났다 (Shin et al. 2015). ZU는 전반적으로 항균작용이 뛰어나, 박 테리아 (Bacillus subtilis)를 ZU에 노출한 결과 독성세기는 ZP>Ziram>ZU>CP 순서로, ZU는 CP보다는 약 2배 독 성이 높은 것으로 보고하고 있다 (Jung 2012). 이러한 결과 를 종합하면, ZU는 동·식물플랑크톤 및 파래류에서 생물 독성이 낮게 나타나, 전반적으로 다른 방오도료에 비해 독성 이 낮다고 판단할 수 있지만, 상대적으로 박테리아에서 독성 이 높게 나타나는 것을 알 수 있다. 선박의 보수, 청소 및 물 리적인 충격에 의해 탈락된 방오도료 입자는 퇴적물에 축적 되고, 축적된 방오도료가 지속적으로 유출되어 환경 내 방 오도료의 농도를 증가시키고 있기 때문에 (Song et al. 2005; Soroldoni et al. 2017), ZU와 같이 상대적으로 낮은 독성이 예상되는 방오도료도 환경 내 농도가 지속으로 증가 할 수 있다는 점을 간과해서는 안 되며, 다양한 생물을 이용한 독 성연구와 모니터링은 주기적으로 실시되어야 할 것이다.
본 연구에서는 ZU에 대한 B. plicatilis 생존율과 개체군 성장률의 연구결과를 바탕으로, 무영향농도 (NOEC), 최소영 향농도 (LOEC) 및 반수영향농도 (EC50)을 도출하여 신방오 도료물질의 독성을 평가하고자 하였으며, 이러한 결과는 해 양환경 내에서 ZU의 기준치 설정 및 다른 신방오도료 사이 의 독성치를 비교할 수 있는 유용한 자료로 활용될 것이다.
적 요
해산로티퍼 (Brachionus plicatilis)의 생존 및 개체군 성장 률 (r)을 사용하여 Zinc undecylenate (ZU)에 대한 독성평가 를 실시하였다. 24 h 동안 ZU에 노출된 B. plicatilis의 생존 율은 실험 최고농도 100 mg L-1에서도 영향이 나타나지 않 았으나, ZU에 72 h 노출된 개체군 성장률 (r)은 농도 의존적 으로 감소하는 경향을 나타내, 12.5 mg L-1 에서 유의적인 감소를 나타냈고 최고농도 50.0 mg L-1에서 개체군 성장률 이 90% 이상 감소되었다. ZU에 노출된 B. plicatilis의 개체 군 성장률의 반수영향농도 (EC50)값은 26.4 mg L-1, 무영향농 도 (NOEC)는 6.3 mg L-1, 최소영향농도 (LOEC)는 12.5 mg L-1로 나타났다. 자연생태계 내에서 ZU 물질이 해수 중에 서 12.5 mg L-1 이상을 초과하여 나타낼 때 B. plicatilis와 같 은 동물성플랑크톤의 개체군 성장률이 영향을 받을 것으로 판단되며, 이러한 연구결과는 신방오도료물질의 생태안정성 평가를 위한 기준치 설정 및 다른 방오도료물질과의 독성치 를 비교할 수 있는 유용한 자료로 활용될 것으로 판단된다.
