서 론

식물의 잎, 뿌리, 껍질 등 다양한 부분에서 추출한 정유 (Essential oils)는 살충 및 살균효과가 탁월한 것으로 알려져 있 다 (Baratta et al. 1998; Carno et al. 2008; Jeong et al. 2010;Hassan et al. 2012). 따라서 이들을 이용한 살충제 개발이 활 발히 이루어지고 있다. 정유의 살충효과는 Pediculus humanus capitis (Yang et al. 2004), Callosobruchus maculatus (Jumbo et al. 2018) 등에서 나타난 바와 같이 훈증작용이 주를 이루 었으나, 접촉독성 및 기피작용 또한 보고된 바 있다 (Gao et al. 2018).

정유 중 살충성분이 우수한 물질로 알려진 것은 주로 탄소 가 10개로 이루어진 모노테르펜 (monoterpenes)류이며 탄소 수가 15개 혹은 20개인 테르펜물질도 살충성분으로 보고되 고 있다. 최근에 양강근 정유와 양강근 정유의 주요성분 중 하나인 methylcinnamate의 미국선녀벌레 (Metcalfa pruinosa Say)에 대한 살충 및 기피효과가 보고되었는데, 특히 methylcinnamate 유제는 살충 및 기피효과의 결합으로 인해 이들 해충에 대한 방제효과가 탁월한 것으로 입증되었다 (Park et al. 2018). 또한 길초근에서 추출한 정유들의 갈색날개매미 충 (Ricania shantungensis) 살충효과 실험에서는 수증기증류 법으로 추출한 정유의 살충효과가 용매추출법 또는 초임계 추출법으로 추출한 정유의 살충효과에 비해 우수한 것으로 보고되었다 (Lee et al. 2018).

정유의 뛰어난 살충효과는 아메리칸바퀴벌레 (Periplaneta americana)를 이용한 살충효과 작용기작 연구에서 밝혀진 바와 같이 시험 정유는 신속하게 공시충의 움직임을 고정화 시키며 녹다운 (knockdown)상태로 유도하였다 (Enan 2001). 더불어 시험 정유는 아메리칸 바퀴벌레의 심장박동수를 빠르 게 하고 cAMP의 체내 농도를 상승시켰다 (Enan 2001). 흥미 로운 것은 [³H]octopamine이 결합하는 수용체에 시험 정유의 성분들이 경쟁적으로 결합하여 수용체의 작동을 저해한다는 것이다. 이런 효과를 나타내는 정유성분으로 eugenol, a-terpineol, 그리고 이들의 혼합물 등이 있다 (Enan 2001). 최근에 이 르러, Malaleuca alternifolia 정유는 미토콘드리아의 NAD⁺/ NADH dehydrogenase의 활성을 저해하여 체내 NAD⁺/NADH 의 비율을 변화시키는 것으로 확인되었으며, 이는 미토콘드 리아의 전자전달계의 원활한 활동을 유지할 수 없도록 한다 (Liao et al. 2018). 이러한 작용기작 외에 신경전달물질인 acetylcholine의 가수분해를 돕는 acetylcholinesterase에 대한 활 성저해도 보고된 바 있다 (Lee et al. 2001).

그러나, 정유를 이용한 살충제의 개발 및 활용에 있어 이 들이 환경에 미칠 잠재적 영향 평가가 선행되어 환경안전성 에 대한 정보를 확보할 필요성이 있다. 최근에 고수정유 (Coriander essential oil)에 tergitol을 계면활성제로 사용한 유제 제형이 잉어에 대한 급성어독성을 나타내지 않았음이 확인되 었다 (Nam et al. 2016). 또한, 유제 및 입제화로 한 계피 정유 에 대해 잉어와 제브라피쉬에 대한 급성독성 및 만성독성을 평가하여 이들 제형의 정유의 살충제로써의 사용 가능성에 대한 연구가 보고되었다 (Nam et al. 2018).

이와 같이 본 연구는 살충효과가 뛰어난 것으로 알려진 길 초근 (Lee et al. 2018) 및 양강근 정유 (Park et al. 2018)를 활용 한 살충제 개발을 위하여 국내산 잉어를 활용하여 이들 정유 의 수계생물에 대한 급성독성을 평가하고 이들을 제형화 하 였을 때 이들 제형이 생태 및 환경에 미칠 영향을 평가하였다.

재료 및 방 법

1. 시험물질

시험에 사용된 길초근 (Valeriana fauriei) 및 양강근 (Alpinia galangal) 정유는 수증기증류법 (Solvent Extraction; SE), 핵산을 이용한 용매추출법 (Solvent Extraction; SE), 그리고 초 임계추출법 (Supercritical Fluid Extraction; SFE)을 이용하여 추출한 정유를 전북대학교 생물환경화학과 응용식물생화학 연구실로부터 제공받아 사용하였다. 사용된 유화제는 tergitol 로 비이온계 계면활성제를 Sigma-Aldrich (St Louise, MO)로 부터 구입하였다.

2. 시험생물

본 어독성 실험에 사용된 잉어 (Cyprinus carpio)는 오창양 어장 (오창, 충북)으로부터 잉어를 구입하여 사용하였으며 경 북대학교로 옮겨져 1주일 이상 순화시켜 사용하였다. 순화 조 건은 26±1°C, 광주기 16L : 8D 시간을 유지하였으며 하루 3번 먹이를 공급하였다. 시험 실시 24시간 전부터 먹이 공급을 중 단하고 잉어의 전장이 최소 3~5 cm인 건강한 개체를 선별하 여 사용하였다.

3. 유제 및 입제의 제조

길초근 및 양강근 정유 유제는 Tergitol과 에탄올을 유화제 및 용제로 각각 사용하여 최종 제형 비를 5 : 1 : 4 (정유 : 유화 제 : 에탄올)로 설정하여 제조되었다 (Nam et al. 2016). 입제는 담체로 입자크기 45 μm 미만인 Zeolite (Sigma-Aldrich, St Louise, MO)를 사용하여 유제를 흡유시켜 제조하였으며 최종 제 형비를 1 : 9 (유제 : Zeolite)가 되도록 제조하였다.

4. 급성어독성 실험

농촌진흥청 환경생물 독성 시험기준과 방법 (제5조 제1항 제4호)에 따라 잉어에 대한 급성독성실험을 수행하였다. 모 든 급성독성실험은 유리 비커를 이용하였으며 탈염소화 시 킨 물 5 L에 각각의 물질을 혼합하고 3~5 cm 전장의 잉어 10 마리를 넣은 뒤 24시간 주기로 관찰하여 96시간 동안 노출하 였으며 3반복 시험하였다. 온도 26±1°C, 광주기 16L : 8D 시 간을 유지하였으며 시험기간 내에는 먹이를 공급하지 않았 다. 길초근 및 양강근에서 세 가지 추출법으로 추출한 정유 와 아세톤을 무게비 50 : 50으로 혼합한 것을 추출법 별 원제 로 사용하였다. 잉어급성독성 시험은 길초근 및 양강근 정유 의 각 추출법 별로 상이한 농도로 설정하여 수행하였는데, 수증기증류법은 유효성분이 6, 8, 10, 11, 12, 13, 15, 20 mg L^-1, 핵산추출법은 6, 8, 10, 12, 15, 20 mg L^-1, 초임계 추출법 은 6, 8, 10, 15, 20 mg L^-1이 되도록 처리하여 급성독성시험 을 수행하였다. 유제에 대한 급성독성 실험 시 대조군은 각 유제의 추출법 별로 가장 많은 양의 유화제가 첨가된 유제를 기준으로 유효성분을 제외하고 동일한 비율로 용액을 제조 하여 사용하였다.

5. 분자생물학적 분석

양강근의 수증기증류법과 초임계추출법 두 가지 추출법에 따라 획득한 원제에 대하여 잉어의 분자수준에서의 반응을 확인하기 위해 96시간 급성독성 시험 종료 후 살아있는 잉어 시료를 수거하였다. 확보한 시료는 DEPC water (바이오세상, 성남)를 사용하여 2회 세척하고, 액체질소로 급속 냉동한 뒤 막자사발과 막자를 이용하여 갈아주었다. 이를 Trizol (Sigma- Aldrich, St Louise, MO)를 이용하여 total RNA를 추출 해 내었다. 추출한 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Sigma-Aldrich, St Louise, MO)를 사용하였으며 합성한 cDNA를 주형으로 하 여 RT-qPCR을 실시하였다. mRNA의 발현량 변화를 확인하 는데 사용한 프라이머는 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 제공하는 Primer-BLAST를 이용하 여 제작하였으며 beta-actin을 housekeeping gene으로 사용하 였다. 제작한 프라이머의 시퀀스는 Table 1과 같다.

6. 통계분석

실험에서 얻어진 결과 값은 통계프로그램 (SPSS)을 사용 하였으며 프로빗 (Probit) 분석을 통해 95% 신뢰한계에서 반 수치사농도 (LC₅₀)를 구하였다. 실험군 간의 유의성을 비교하 기 위하여 t-test (p<0.05)를 수행하였다.

결과 및 토 의

잉어에 대한 길초근 (Valeriana fauriei) 및 양강근 (Alpinia galangal) 정유 원제의 급성독성은 Table 2에 나타나 있다. 수 증기증류법 (SD)으로 추출된 길초근 정유 원제에서는 48시간 동안 치사개체가 나타나지 않았으나 용매추출법 (SE)으로 추출한 정유 원제에서는 48h-LC₅₀ 값은 12.0 mg L^-1, 96h-LC₅₀ 값은 9.85 mg L^-1으로 나타났다.

수증기증류법 (SD)으로 추출한 정유 또는 초임계 추출법 (SFE)으로 추출한 양강근 정유 원제는 독성이 관찰되지 않았 으나, SE로 추출한 양강근 정유 원제의 경우 48h-LC₅₀ 값이 17.2 mg L^-1, 96h-LC₅₀ 값은 14.0 mg L^-1으로 나타났다. 이러 한 결과는 길초근 및 양강근 정유를 용매추출법 (SE)으로 얻 은 경우 수증기증류법 (SD)나 초임계 추출법 (SFE)으로 추출 한 정유보다 잉어에 대한 독성이 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 급성 어독성의 차이는 각 추출법에 따라서 추출되는 정유 성분의 차이에 기인하는 것으로 판단되며, 용매추출법 (SE)으로 추출한 정유의 경우 독성을 일으키는 성분이 가장 많이 추출된 것으로 사료된다.

잉어에 대한 길초근 및 양강근 정유 유제의 급성어독성은 Table 3에 나타나 있다. 모든 추출법에서 얻은 길초근 정유로 제조된 유제에서 독성이 관측되지 않았는데 이는 유제 제조 시 반으로 감소된 정유의 절대양 때문인 것으로 판단된다. 반 면에 양강근 정유 원제의 경우, 모든 추출법에서 얻은 정유로 제조된 유제에서 모두 독성이 나타났다. 그 중에서도 용매추 출법 (SE)으로 추출한 정유로 제조된 유제에서는 48h-LC₅₀과 96h-LC₅₀ 모두 6.47 mg L^-1로 동일하였다. 수증기증류법 (SD) 으로 추출한 정유로 제조된 유제에서는 48h-LC₅₀과 96h-LC₅₀ 값은 12.0 mg L^-1로 산출되었고, 초임계추출법 (SFE)으로 추 출한 정유로 제조된 유제에서는 48h-LC₅₀값은 7.29 mg L^-1, 96h-LC₅₀값은 6.78 mg L^-1이었다. 산출된 모든 독성 값들이 2 mg L^-1 이상이므로 어독성 3급에 속하는 농약으로 구분된 다. 이러한 결과는 향후 또 다른 정유 원제를 제제화하여 친 환경농자재로 개발 시 환경 중 수서생태계에 미치는 영향을 평가가 수행되어야 함을 보여준다.

잉어에 대한 길초근 정유 입제의 급성어독성 결과는 Table 4에 나타내었다. 수증기증류법 (SE)으로 추출된 정유와 초임 계추출법 (SFE)으로 추출한 정유의 입제는 독성이 관측되지 않았으나 용매추출법 (SE)으로 추출한 정유의 입제만 독성을 나타내었고 48h-LC₅₀ 값은 14.8 mg L^-1, 96h-LC₅₀ 값은 12.2 mg L^-1로 나타났다. Table 4의 결과는 용매추출법 (SE)으로 추 출한 길초근 정유가 입제화 되었을 때 다른 추출법으로 추출 한 정유를 입제화한 것보다 어독성이 더 높음을 보여주었다. 그럼에도 불구하고 이 정유 입제는 어독성 3급에 속하는 농약 으로 구분된다. 비슷하게 양강근 정유의 경우, 초임계추출법 (SFE)으로 추출한 정유의 입제만이 독성을 나타내었고 48h- LC₅₀ 값이 21.8 mg L^-1 수준으로 나타났다. 동일한 시료에 대 한 96h-LC₅₀ 값은 20.3 mg L^-1으로 나타났다. 이 정유 또한 어 독성 3급에 속하는 농약으로 구분된다.

양강근 정유 원제 중 수증기증류법 (SD) 및 초임계추출법 (SFE)으로 추출한 정유 원제에 노출된 잉어의 분자수준에서 반응을 확인하여 Fig. 1에 나타나 있다. Fig. 1에서 나타난 것 과 같이, 두 가지 방법으로 추출된 양강근 정유의 원제 노출 된 잉어 모두에서 cytochrome P450 1A 유전자의 양이 약 3 배 정도 증가되었고 반면에 cytochrome P450 3A 유전자는 변 화가 없었다. 또한, catalase 유전자의 변화는 관측되지 않았고 glutathione S-transferase 효소를 발현시키는 유전자는 초임계 추출법 (SFE)으로 추출한 정유 원제에 노출된 잉어에서 15배 증가되는 유의성 있는 발현량 변화가 확인되었다. 향후, 양강 근 정유의 수계환경 노출 시 잉어 내 반응 바이오마커로서 cytochrome P450 1A 또는 glutathione S-transferase를 활용 가능할 것으로 보여진다.

식물로부터 추출한 정유를 살충제로서 개발하기 위해서는 이들이 지닌 살충효과를 검증하는 것 외에 환경 중 동태와 비표적 대상 생물에 대한 독성유무를 확인하여 환경영향평 가를 실시하여야 한다. 따라서, 본 연구에서는 길초근 및 양 강근 정유를 유제와 입제로 제형화 한 후 잉어에 대하여 나타 낸 급성어독성 값을 구하였다.

길초근과 양강근정유 원제는 잉어에 대하여 48시간 급성 어독성 실험결과를 토대로 어류에 대한 독성정도에 따른 농 약 구분에서 어독성 3급에 속하며 가장 낮은 독성정도를 나 타내었다. 길초근정유 유제는 잉어에 대한 어독성이 10 mg L^-1 이상으로 나타났으며 양강근정유 유제의 경우도 약한 급 성어독성이 관찰되었으나 반수치사농도 값이 2 mg L^-1 이상 으로서 이 모든 결과는 어류에 대한 독성정도에 따른 농약 구 분에서 어독성 3급에 속하며 가장 낮은 독성정도를 나타내 었다. 길초근과 양강근정유의 입제도 유제와 유사한 독성결 과를 나타내어 환경 중 어독성이 매우 낮은 것으로 판명되었 다. 그러나, 급성어독성 값이 낮더라도 다른 수서생물을 이용 한 실험에서 높은 독성값을 나타낼 수 있음으로 다른 시험생 물에 이용한 독성실험이 필요하다.

본 연구에서 사용한 길초근 및 양강근 정유의 유제 혹은 입 제의 어독성 외에, 계피정유의 경우 물벼룩, 송사리, 꿀벌, 지 렁이 등을 이용하여 생태독성평가 결과를 보고하였다 (You et al. 2011). 이중 계피정유의 송사리에 대한 급성독성은 LC₅₀ 값이 7.5 mg L^-1으로 나타났고 이 값은 다른 연구 결과 값과 크게 다르지 않았다 (Nam et al. 2018). 본 연구와 비슷하게 배 추좀나방을 방제하기 위하여 개발된 계피정유의 유제는 생 태독성평가를 실시하여 잉어에 대한 급성독성이 1.9 mg L^-1 로 나타났고 이는 어독성 II급에 해당되는 독성으로 판명되 었다 (You et al. 2013).

향후 길초근과 양강근정유 유제 및 입제의 경우 환경에 대 한 안전성을 확보하기 위하여 잉어와 송사리 등을 이용한 만 성어독성실험과 꿀벌에 대한 알파파 엽상잔류독성 실험 등을 실시하고 살충제로 사용될 정유의 만성 어독성정도와 육상생 태계 중 시험생물에 대한 독성정도를 평가하는 것이 필요하 다고 보여 진다.

적 요

길초근 및 양강근정유를 유제 및 입제로 제형화한 후 이들 의 급성어독성을 측정하였다. 잉어를 이용한 급성독성에 사 용된 길초근 및 양강근 정유는 수증기증류법, 핵산을 이용한 용매추출법 및 초임계추출법을 이용하여 추출하였고 이들의 유제 및 입제의 급성어독성은 반수치사농도 (LC₅₀)를 구하여 평가하였다. 길초근 및 양강근 원제 중 용매추출법으로 추출 한 정유만이 어독성을 나타내었다. 길초근 및 양강근 추출법 별 정유 이용한 유제의 급성어독성 평가한 결과 길초근의 경 우 모든 추출법 대하여 독성을 나타내지 않은 반면에 양강근 정유는 추출법에 관계없이 모두 잉어에 대한 어독성이 관측 되었다. 입제의 경우 길초근은 용매로 추출한 정유에서 독성 이 나타났고, 양강근 정유의 경우 초임계추출법으로 추출한 정유 입제에서만 어독성이 관측되었다. 이러한 결과는 3급 어독성에 해당되는 것으로 환경 중 사용에는 문제가 없다고 사료된다. 살충효과가 뛰어난 양강근 정유의 경우 수증기증 류법 및 초임계추출법으로 추출한 정유의 10 mg L^-1 수준에 서 노출된 잉어의 분자적 반응을 확인하여 cytochrome P450 1A 효소 및 glutathione S-transferase의 발현이 급격히 증가 하였음을 확인하였고 이들은 수계환경 중 양강근 정유의 동 태를 관찰하는 바이오마커로서 사용 가능하다고 사료된다.