서 론
돌조개과 (Arcidae)에 속하는 꼬막 (Tegillarca granosa), 새꼬막 (Anadara kagoshimensis) 그리고 피조개 (Scapharca broughtonii)는 방사륵의 개수에 따라 분류되며, 이들 꼬 막류는 일시적인 부유유생기와 부착치패기를 거친 후 부 착치패기에서 탈락하여 갯벌 속에서 저서생활을 한다. 종에 따라 차이는 있으나, 최적의 성장 조건에서 꼬막 (T. granosa)의 수정란은 부화 후 약 3~4주 동안 부유유생기 를 거친 후 200~450 μm의 크기가 되면 착저 및 부착유생 기를 거친 후 치패로 성장한다. 그러나 꼬막 (T. granosa) 치 패의 생존율은 낮기 때문에 성패로 성장할 때까지의 생 존율은 10% 이내로 보고되고 있다 (Moon et al. 2004;Kim 2012). 특히, 양식장에 살포된 새꼬막 (A. kagoshimensis)의 치패는 1개월 이내에 많은 양이 폐사하며, 이는 해적 생 물의 포식, 먹이생물의 감소, 살포지의 물리적·이화학적 인 요인에 의한 것으로 알려져 있다 (Kim et al. 1980;Kwon and Cho 1986;Chun et al. 1991).
꼬막 (T. granosa)은 우리나라뿐만 아니라 일본, 중국을 비롯한 동남아시아부터 인도양과 서태평양의 여러 나라 에서 식용으로 인기 높은 양식 이매패류이다 (Yoo 2000). 국내에서 꼬막 (T. granosa)은 순천만, 보성만, 강진만, 득량 만, 여자만 등의 전남지방이 위치한 남해안에서 주로 생 산되며, 전국 생산량의 약 70%를 점유하고 있다 (MIFAFF 2008). 전라남도의 꼬막 (T. granosa) 생산량은 1970년에 약 1,900톤으로 국내 생산량의 약 98%를 차지하였고 1970 년대 중반부터 1990년대 중반까지 5,000~10,000톤 이상 을 유지하였으나, 1990년대 후반에 들면서 급격히 감소하 여 2016년에는 244톤, 2018년에는 47톤으로 급감하는 추 세이다 ( Jang et al. 2006; KOSIS 2019). 이러한 현상의 원 인으로 연안환경 및 양식장 저서환경의 악화와 같은 꼬막 (T. granosa) 서식환경의 변화 등이 알려져 있다 (Park et al. 1998;Sato and Koh 2004;Jeon et al. 2018).
우리나라와 함께 중국과 일본 등의 동남아시아는 꼬 막 (T. granosa)의 성장에 유리한 수온 조건을 갖추고 있 어 갯벌 양식을 통한 연중 생산이 가능하며, 양식과 관련 된 연구가 활발히 진행되어 꼬막 (T. granosa)의 식성 (Lam and Hai 1998), 성장 (You et al. 2002), 양성 (Narasimham 1980; Sanchai 1996) 그리고 성 성숙 (Zheng et al. 1994)에 관한 연구 결과가 보고되어 있다. 우리나라 또한 꼬막 (T. granosa)의 형태변이 (Yoo 1971), 양식 (Bae 1986), 생식주 기와 산란유발 (Lee 1998), 유생 (You et al. 2001;You et al. 2002), 환경내성 (Shin et al. 2002), 연령과 성장 ( Jang et al. 2006), 난 발생 및 유생 성장 (Kim et al. 2012) 등의 활발한 연구가 이루어지고 있다. 특히 보성의 주요 수산자원인 꼬 막 (T. granosa)과 새꼬막 (A. kagoshimensis) 부유유생의 변 화는 국내의 꼬막 (T. granosa) 및 새꼬막 (A. kagoshimensis) 양식산업 및 종패생산기술의 중요 기초자료로 사용되어, 양식장의 관리 및 안정적인 생산성 향상에 기여할 수 있을 것으로 판단되나, 형태학적 동정이 매우 어렵기 때문에 그 연구는 아직까지 미비하다 ( Jung et al. 2018).
본 연구해역인 보성 바다목장은 꼬막 (T. granosa)과 새 꼬막 (A. kagoshimensis)이 주요 수산자원이다. 꼬막 (T. granosa)과 새꼬막 (A. kagoshimensis)의 수산자원량을 가름 할 수 있는 중요 기초자료인 부유유생량의 변동량을 파악 하고자, 주 부유유생기로 추정되는 8월에 주 2회 집중조사 를 실시하였다. 특히, 차세대염기서열 분석법을 통하여 형 태학적으로 동정이 어려운 꼬막 (T. granosa) 및 새꼬막 (A. kagoshimensis) 부유유생의 상대적인 출현량 및 그 출현시 기를 파악하였다.
재료 및 방법
1. 연구 지역
우리나라 남해안 중서부에 위치한 전남 보성군 벌교읍 은 고흥반도와 여수반도로 둘러싸여 있으며, 해안가 주위 에는 낮은 구릉들이 발달해 있고 만의 북서쪽에서 위치한 벌교천에 의해 담수의 유입이 발생한다 (Fig. 1). 본 연구지 역은 벌교천 하류지역 일대의 습지보호지역으로, 인근에 위치한 장도 및 지주도 등의 크고 작은 섬에 의하여 조류 및 해류의 유출입이 원활하지 않다. 이곳은 모래와 자갈의 함량이 적고 매우 세립한 니질의 퇴적물이 우세하여 패류 양식이 주종을 이루며, 보성 벌교 갯벌로 불리기도 한다. 보성 벌교 갯벌은 국내 최대의 꼬막 (Tegillarca granosa)과 새꼬막 (Anadara kagoshimensis)의 생산지로 알려져 있다. 또한 습지보전법에 의거하여 보성군 벌교읍 호동, 장양, 영 등, 대포 일원은 2003년에 습지보호지역 제 4호로 지정되 었으며, 2006년에는 람사르에 등록되었다 (Park 2016).
2. 이매패류 부유유생의 채집 및 전처리
꼬막 (T. granosa)과 새꼬막 (A. kagoshimensis)을 중심으 로 한 이매패류 부유유생의 출현 양상을 파악하기 위하여 2018년 6월부터 9월에 보성 연안해역의 4개 지역 (대포, 장 도 상진, 대촌; 만조 시 평균 수심 4~6 m)에서 채집을 실시 하였다. 특히, 꼬막 (T. granosa)과 새꼬막 (A. kagoshimensis) 의 산란 후 부유유생기를 가지는 8월에는 주 2회 (3~4일 간격)의 집중채집을 실시하였다. 이매패류 부유유생의 채 집은 어선을 이용하여 유속계 (Hydro-Bios, Germany)를 부 착한 네트 (직경 45 cm, 망목 78 μm)를 약 2 kn의 속도로 5 분간 수심 1 m에서 수평 예인하였다. 채집된 시료는 선상 에서 70% 에탄올로 즉시 고정하였다.
연구실로 운반된 시료의 일부는 실체현미경 (Ax io Imager A2, Carl-Zeiss, Germany)으로 관찰하여 이매패류 유생의 유무를 확인하였으며, 이후 500 μm 망목의 체로 불 순물을 제거하고 100 μm 체를 통해 이매패류 부유유생의 분석을 위한 시료로 농축하였다. 농축된 시료는 genomic DNA를 추출하기 위한 시료로 사용하였다.
3. 이매패류 부유유생의 차세대 염기서열 (metagenomics next-generation sequencing, mNGS) 분석
Genomic DNA (gDNA)를 추출하기 위하여 농축된 시 료는 액체질소에 급속 냉동시킨 후, Homogenizer (Daihan Scientifics, WiseMix, HG-15D, Korea)를 사용하여 균질하 게 분쇄하였다. 이렇게 균질화된 시료는 60°C dry oven에 서 건조 후, 1 g dry weight을 취하여 QIAGEN Power Soil Kit (Qiagen, Hilden, Germany)으로 gDNA를 추출하였다. 이때 분석 결과의 정확도를 높이기 위하여 동일한 시료에 서 gDNA를 3회 반복 추출한 후 실험에 이용하였다.
본 연구에서 부유유생들의 분자학적 분류를 위한 유전 자 마커로 미토콘드리아의 cytochrome c oxidase 1 (CO1) 유전자를 선정하였으며, 미토콘드리아 유전체는 동물의 분류 체계를 확립하거나 계통유연관계를 규명하는 데 매 우 유용한 유전자 마커로 널리 이용되어 왔다 ( Jung et al. 2018). 미토콘드리아의 CO1 유전자를 증폭하기 위하여 forward primer (LCO-1490; 5ʹ-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3ʹ)와 reverse primer (HCO-2198; 5ʹ-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3ʹ)를 사용하였 다 (Folmer et al. 1994;Jung et al. 2018). 1차 PCR을 수행하 기 위하여 template 10 ng에 10× PCR buffer 2.5 μL, dNTP mixture 2 μL, 1 unit Ex Taq (TaKaRa, EX Taq, Kyoto, Japan), 각각의 primer 1 μL (10 pM) 및 증류수를 넣어 총 25 μL로 맞추었다. 1차 PCR (BioRad, Hercules, CA, USA)에서 30 회 증폭을 실시하였으며, 조건은 94°C에서 5분, 94°C 30초, 55°C 40초 그리고 72°C 60초, 마지막으로 72°C에서 10분 간 반응시켰다. PCR product는 1%의 agarose gel에서 전기 영동을 실시하여 CO1유전자의 증폭 여부를 판단하였다. 증폭이 완료된 1차 PCR product는 Nextera XT Index Kit (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)로 2차 PCR을 수행하 였으며, 조건은 1차 PCR과 동일하게 설정한 후 10회 증폭 을 실시하였다. 반응이 완료된 2차 PCR 산물은 Qiaquick PCR purification Kit (No. 28104, Qiagen Inc.)로 정제하였 으며, 이후 Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 이용하여 quality control (QC) test를 실시하였다. QC test가 완료되면 동량의 3회 반복된 2 차 PCR product를 모아서 pooling 한 후 Illumina Mi-Seq platform으로 분석하였다. Mi-Seq platform에서 분석된 결과는 Mi-Seq Control Software (MCS, ver. 2.4.1)의 Fast QC를 수행하여 poor-quality 염기서열을 제거하였다. 또 한 fast length adjustment of short reads (FLASH) Software 로 short sequence reads (<150 bp), low-quality sequences (score<33), singletons 및 non-target sequences를 제거 하였다 (MagoČ and Salzberg 2011). 이렇게 처리된 염기 서열은 CD-HIT-OTU program을 이용하여 97% 수준에 서 clustering을 실시하였고 (Li et al. 2012), 이후 Mothur program을 통해 alpha-diversity (Shannon diversity, Simpson evenness)를 계산하였다 (Schloss 2009).
4. 통계 분석
보성 연안에 위치한 대포, 장도, 상진, 대촌의 4개 지역에 서 CO1 유전자의 metagenomic next generation sequencing (mNGS) 결과 차이를 살펴보기 위하여 statistical package for the social sciences (SPSS, ver. 24)를 사용하여 one-way analysis of variance (one-way ANOVA) 분석을 하였다. 또 한 mNGS 결과를 기반으로 부유유생 군집의 시·공간적 차이를 분석하기 위하여 Bray-Curtis similarity methods 와 analysis of similarity (ANOSIM)를 사용하여 nonmetric multi-dimensional scaling (nMDS)을 수행하였다. 일련의 nMDS 분석은 PRIMER 6.0을 통해 분석하였다.
결 과
1. 부유생물의 군집 분석
보성 연안에서 채집한 시료를 mNGS로 분석한 결과, 염 기서열은 98,0553~156,539,416 (45,563,530±36,152,001) 이고 reads (97% cut-off )값은 1,310~67,806 (11,733± 10,861)이었다 (Table 1). 각 시료의 rarefaction curve는 reads값과 operational taxonomic units (OTUs)의 결과가 포 화되어 데이터의 신뢰성을 확보하였다. OTUs는 25~67 (44±9)으로 나타났고, 다양도 지수는 0.35~2.59 (1.57± 0.59), 균등도 지수는 0.11~0.89 (0.62±0.22)으로 나타났 다 (Table 1). 부유생물의 군집 구성은 정점 간 유의한 차 이를 보이지 않았고 (ANOVA, p>0.05) nMDS로 수행된 군집분석의 결과는 유사도 57%를 기준으로 6월, 7월, 9월 과 8월이 각각 구분되었다 (Table 1, Fig. 2). 채집기간 중 절 지동물 (Arthropoda)이 최우점 분류군이었으나, 연체동물 (Mollusca)이 6월부터 점차 증가하여 8월에 최고 구성비 율을 보인 후 9월에 급감하였다.
채집기간 중 부유생물은 크게 14개의 분류군이었으며, 이 중 절지동물 (59%), 규조류 (Bacillariophyta; 18%), 연체 동물 (14%)이 90% 이상을 차지하였고 나머지 분류군은 각각 1% 이하의 낮은 구성비율을 보였다 (Fig. 3). 이 중 연 체동물은 이매패류 (Bivalvia; 79%)와 복족류 (Gastropoda; 21%)로 구성되어 있었다. 이매패류 중 굴 (Ostreidae)은 이매패류의 평균 67%를 차지하는 최우점 분류군이었 고 홍합 (Mytilidae)은 19%로, 이 두 분류군이 전체 이매 패류의 86%를 차지하였다 (Fig. 3). 그 외 가재더부살이 조개류 (Lasaeidae), 돌조개류 (Arcidae), 발가리맛조개류 (Solecurtidae)가 낮은 출현비율을 보였다.
2. 이매패류 부유유생의 출현량 및 출현시기
보성 연안에서 출현하는 이매패류는 21종이고 이 중 8 종이 이매패류 군집의 1% 이상을 차지하였다 (Fig. 4). 최우 점종은 구마모토굴 (Magallana sikamea)로, 이매패류 군집 에서 평균 37.25%를 차지하였다. 구마모토굴 (M. sikamea) 은 집중 조사 기간인 8월에 50% 이상의 높은 구성비율 을 보였으며, 특히 8월 9일에 최대값인 68.59%를 보이다 가 9월에 급감하였다. 왜홍합 (Xenostrobus atratus)은 평균 18.27%의 구성비율을 보였고 최대값은 7월 12일에 76.89% 로 나타났다. 종밋 (Musculista senhousia)은 평균 12.55% 의 구성비율을 보였고, 8월 6일부터 증가하여 8월 22일에 39.88%의 최대값을 보인 후 감소하였다. 참굴 (Magallana gigas)은 평균 8.42%의 구성비율로 출현하였고, 8월 27일 에 20.36%의 최대값을 보였다. 가리맛조개 (Sinonovacula constricta)는 평균 8.36%로, 6~7월까지는 거의 출현하 지 않았으나, 8월 20일에 급격히 증가하여 67.70%의 구 성비율을 보였다. 새꼬막 (Anadara kagoshimensis)은 평균 4.00%를 차지하였으며, 6월을 제외하고 8월 2일에 8.63% 로 가장 높았다. 연구기간 동안 새꼬막 (A. kagoshimensis) 의 read값은 8월 2일에 가장 높았다. Kurtiella aff. bidentata 는 평균 3.35%로 6월과 9월에는 출현하지 않았고 8월 9 일에 20.50%로 급격한 증가를 보이다가 감소하였다. 꼬 막 (Tegillarca granosa)은 평균 1.92%로, 6월을 제외하고 8 월 22일에 5.03%의 가장 높은 구성비율을 보였다. 꼬막 (T. granosa)의 read값 또한 8월 22일에 가장 높았다.
고 찰
우리나라에서 꼬막 (T. granosa)의 양식을 위한 종패는 대부분 보성을 비롯한 전남해역에서 생산되어 전국으로 공급되므로, 꼬막 (T. granosa)의 산란 및 생육장의 역할 을 담당하는 보성 연안해역에서 산란에서부터 종패에 이 르는 꼬막 (T. granosa)의 생활사에 대한 연구는 반드시 수 행되어야 한다. 특히 꼬막 (T. granosa)을 포함한 해양 무 척추동물의 분포는 부유유생기와 매우 밀접하게 연관되 어 있으며 ( Jung et al. 2010), 부유유생기를 통한 산란기 의 추정은 금어기 지정 등의 자원보호를 위한 근거 제시 를 위해 필요하다. 본 연구 결과, 꼬막 (T. granosa)을 비롯 한 이매패류 부유유생은 하계인 7~8월에 높은 출현빈도 를 보였으며, 이는 대부분의 이매패류가 여름철에 산란하 는 하계 산란형으로 알려진 기존의 연구 결과와 일치한 다 (Boolootian et al. 1962;Yoo 2000). 꼬막 (T. granosa)과 새꼬막 (A. kagoshimensis) 부유유생의 상대개체수 (relative abundance)는 비록 6월에 가장 높았지만 (Fig. 4), 6월의 이 매패류 부유유생의 read값이 매우 낮기 때문에 상대개체 수가 높게 분석되었다. 따라서 이매패류의 유의한 read값 을 고려하면, 꼬막 (T. granosa)과 새꼬막 (A. kagoshimensis) 의 부유유생은 각각 8월 초와 8월 말에 가장 높은 출현율 을 보였다 (Table 1). 꼬막류의 산란 후 부유유생기가 약 3~4주임을 감안하면 (Moon et al. 2004), 본 연구의 꼬막 (T. granosa)과 새꼬막 (A. kagoshimensis)은 각각 7월과 6월에 산란을 시작하는 것으로 판단되며, 이는 꼬막 (T. granosa) 의 생식소 발달 시기와 일치한다 (2018년 보성바다목장 사업, 미발표 자료). 꼬막 (T. granosa)은 빠르게 성숙하며, 수온이 증가하는 7월 중에 집중적으로 산란을 마치지만 일부 환경의 변화에 따라 수온이 높은 8월까지 산란을 계 속하기도 한다 (Yoo 1971). 반면 새꼬막 (A. kagoshimensis) 은 7~9월까지 꼬막보다 긴 산란시기를 가지고 있으나 주 산란기는 7~8월로 알려져 있다 (Kim et al. 2008). 꼬막 (T. granosa)과 새꼬막 (A. kagoshimensis)의 생식소 역시 7~8 월에 발달하는 것으로 보고되어 있다 (Moon et al. 2004;Kim et al. 2008;Shin et al. 2011). 본 연구에서 새꼬막 (A. kagoshimensis)의 산란시기가 다른 연구 결과에 비해 다소 빠른 것으로 확인되었으나, 꼬막 (T. granosa)의 성숙시기는 성패의 서식환경 및 수온 등에 영향을 받아 동일한 종에서 도 다소 차이를 보이는 것으로 보고되어 있다 (Yoo 1971;Kim et al. 2008).
본 연구기간 동안 꼬막 (T. granosa), 새꼬막 (A. kagoshimensis) 과 함께 구마모토굴 (M. sikamea), 종밋 (M. senhousia), 참굴 (M. gigas) 그리고 가리맛조개 (S. constricta) 등이 중요 유생으로 확인되었다 (Fig. 5). 본 연구에서 가 장 높은 출현을 보인 구마모토굴 (M. sikamea)은 보성해 역 인근에 위치한 순천만에서 출현이 확인되어 (Hong et al. 2012), 순천만과 본 연구지역은 유사한 서식환경을 가 진 것으로 판단된다. 일반적으로 8~11월에 부유유생이 관 찰되는 것으로 보고되는 종밋 (M. senhousia)은 오염지표생 물로서 유기물이 풍부한 환경에서 대량으로 출현하고 저 서환경을 혐기성 상태로 변화시켜 다른 생물들의 성장을 방해하는 해적생물로 보고되고 있다 (Morton 1974;Lim and Park 1998;Crooks 1992;Kim et al. 2006). 따라서 종밋 (M. senhousia) 유생의 높은 출현은 현재 양식장의 피해를 주고 있거나 피해를 유발할 수 있어, 주요 수산자원의 증 대 및 관리를 위해 향후 이에 따른 대책이 필요하다. 남해 득량만에서 참굴 (M. gigas) 유생은 조사기간인 7~8월에 높게 관찰되었고 (Kim et al. 2008), 본 연구 결과와 일치하 였으나, 서해 곰소만에서는 참굴 (M. gigas)의 유생은 6월 에 특이적으로 높게 출현하여 지역 및 환경의 차이에 따 라 출현의 차이를 보였다 ( Jung et al. 2018). 가리맛조개 (S. constricta)의 유생은 8월에 최대 출현율을 보였으며 이는 Han et al. (2005)에 의해 보고된 가리맛조개 (S. constricta) 의 산란기 (8월~10월 초)와 유사하다.
부유유생기의 이매패류는 형태가 유사하기 때문에, 숙 련가라 하더라도 이매패류의 부유유생을 정확히 동정하 기에는 어려움이 따른다. 한 예로 미국 동부 연안의 200여 종 이상의 패류들이 서식하고 있으나 각 유생의 형태를 구 분할 수 있는 종들은 50여 종에 지나지 않는다 (Lutz et al. 1982). 이러한 문제를 해결하기 위하여 mNGS 연구가 시 도되고 있으나 (Hajibabaei et al. 2007), 이매패류의 부유유 생을 대상으로 한 연구는 아직 미비하다 ( Jung et al. 2018). 본 연구는 보성 연안해역에 분포하는 부유유생의 출현량 을 토대로 이매패류의 산란시기를 추정하고자 하였으며, 이러한 연구 결과는 양식 자원의 자연 증대를 위한 채묘 시기의 제한 등과 같은 규제의 근거가 될 수 있을 것으로 판단된다. 뿐만 아니라 본 연구에서는 형태학적으로 동정 하기 어려운 이매패류 부유유생의 군집을 종 수준으로 분 류하여 연구해역의 높은 종다양성을 확인하였고 이를 통 해 보성 연안해역이 여러 이매패류의 산란장으로 이용되 고 있음을 확인하였다. 그러나 본 연구 결과는 이매패류 의 생활사 중 일부만을 언급하고 있으며, 장기적으로 이매 패류의 자연증대와 같은 생산성 향상을 위해서는 부유유 생기 뿐만 아니라 이매패류의 산란, 부착유생기 등의 모든 생활사를 포함한 연구가 반드시 필요하다.
적 요
이매패류의 부유유생은 성패 (양식자원)에 직접적인 영 향을 미치고 있어, 부유유생의 출현시기 및 출현량에 관 한 연구는 자연 채묘량의 증대와 인공종묘의 생산을 위해 서 매우 중요하다. 이에 본 연구에서는 유전자 분석기법 을 이용하여 보성 연안에서 총 21종의 이매패류 부유유 생을 확인하였으며, 이 중 구마모토굴 (M. sikamea), 왜홍 합 (X. atratus), 종밋 (M. senhousia), 참굴 (M. gigas), 가리맛 조개 (S. constricta), 새꼬막 (A. kagoshimensis), Kurtiella aff. bidentata 그리고 꼬막 (T. granosa)이 중요 부유유생으로 관 찰되었다. 특히, 보성 연안해역의 주요 수산자원인 새꼬막 (A. kagoshimensis)과 꼬막 (T. granosa)은 각각 이매패류의 0.51~12.50% (평균 4.00%), 0.01~12.50% (평균 1.92%)의 구성비율을 차지하며 다른 이매패류보다 낮은 출현량을 보였다. 꼬막 (T. granosa)과 새꼬막 (A. kagoshimensis)의 부 유유생은 6월부터 9월까지 관찰되었으나, 각각 8월 초와 8 월말에 가장 높은 출현율을 보였다.