서 론

산양삼이란 산림청에서 2012년부터 ‘임간에서 인위적 으로 종자나 묘삼을 파종하고 이식하여 재배한 인삼’으로 정의하고 부르도록 규정하였고 (Lee 2011), [산양삼에 관 한 품질관리 요령]에서는 [산지관리법] 제2조 제1호의 산 지에서 차광막 등 인공시설을 설치하지 아니하고 생산되 는 삼을 산양삼으로 정의하고 있다. 미국 West Virginia 입 법부에서 인가한 제정법에서는 ‘준비된 두둑 없이, 그리고 제초제 혹은 병해나 해충방제 약품 없이 의도적으로 숲에 심은 인삼’으로 정의하고 있다. 영문명은 Wild-simulated ginseng이고, 학명은 Panax ginseng C.A. Meyer로 표기한다.

식물은 생장하는 과정에서 가뭄 (Lipied et al. 2013), 온도 (Hatfield and Prueger 2015), 염분 (Selvakumar et al. 2014), 중금속 (Tekaya et al. 2014), 병원균 (Denancé et al. 2013) 등 과 같은 생물학적 (Biotic) 및 비생물학적 (Abiotic) 스트레 스에 노출되고, 이는 식물의 생장과 생산량에 심각한 영향 을 주게 된다 (Ramegowda and Senthil-kumar 2015;Pandey et al. 2017). 토양미생물 (Soil bacteria)은 식물의 근권 (Rhizosphere) 에서 공생하면서 유기물 분해, 양분순환, 오염물 질 제거, 식물에게 양분을 공급하는 등 식물이 생장하는 데 도움을 주고, 나아가 토양의 질과 생산성을 결정하는 중요 한 역할을 한다 (Prasad et al. 2015).

이러한 토양미생물의 군집을 분석하는 방법으로 기존 에는 배양적방법 (Culture-dependent methods)을 이용하였 으나, 분자적 기법 (Molecular techniques)을 이용한 비배양 적방법 (Culture-independent methods)이 발전하면서 미생 물의 다양성 및 기능 분석에 대한 연구가 증가하였으며 (Busby et al. 2017), 이 중에서 차세대 염기서열분석 (Next generation sequencing; NGS)은 유전자 분석을 통해 미생 물의 군집 구성을 분석하는 방법이다. 대표적인 차세대 염 기서열분석 중 하나인 Pyrosequencing 분석은 다양한 서식 지의 미생물군집을 보다 명확하게 구명하는 데 주로 사용 된다 (Sogin et al. 2006). 토양 특성과 같은 환경요인 (Environmental factor)은 서식하는 식물뿐만 아니라 토양미생물 의 생장 및 다양성에도 영향을 주게 된다 (Song et al. 2018;Wu et al. 2018). 이러한 환경요인의 변화는 결과적으로 스 트레스로 작용하여 토양미생물의 군집에 영향을 주기 때 문에 토양미생물군집을 연구하는 데 있어 토양 특성과 같 은 환경요인과의 상관관계 분석은 매우 중요하다고 할 수 있다 (Petterson 2004).

최근 국민소득 향상 및 청정임산물에 대한 관심이 높아 지면서 뿌리작물인 약용작물의 품질 및 생산성을 개선시 키는 지속가능한 유기농업에도 토양미생물에 대한 관심이 높아지고 있다 (Prasad et al. 2013). 대표적인 뿌리작물인 인 삼의 경우, pyrosequencing 분석을 이용하여 최근까지도 국 내외 인삼 재배지의 토양미생물군집에 대한 연구를 활발 히 수행되고 있다 (Nguyen et al. 2016;Dong et al. 2018). 최 근에는 국내외 산림과학 분야에서도 NGS system을 이용 하여 산림환경 변화에 따른 토양미생물군집 변화에 대한 연구를 수행하고 있지만 (Hartmann et al. 2014;Li et al. 2014;Lee and Eo 2017), 약용자원 재배지의 토양미생물군집 분 석 및 환경요인과의 상관관계에 대한 연구는 매우 미흡한 실정이다. 특히 대표적인 약용자원인 산양삼은 임간에서 무농약, 무비료를 원칙으로 7년 이상 장기적으로 재배 및 생산하기 때문에 노지에서 재배하는 인삼보다 재배적지 에 대한 기준설정을 명확히 해야 한다. 이를 위해서는 산 양삼을 재배하기 전에 예상재배지의 토양 특성 및 토양미 생물군집과 같은 입지환경을 사전에 정밀하게 분석하여 산양삼 재배에 적합한지에 대한 조사가 반드시 필요하다. 따라서 본 연구는 전국 임의의 산양삼 재배지를 선정하여 재배지 내의 토양 특성 및 토양세균군집을 분석하고, 토양 이화학적 특성, 토양세균군집 및 산양삼 생육특성 간의 상 관관계를 구명하여 산양삼의 재배적지를 선정하는 데 기 여하기 위하여 수행되었다.

재료 및 방법

1. 시료 채취 및 토양이화학성 조사

본 연구의 공시작물인 산양삼 시료는 강원, 충북, 전북, 경남 등 전국에서 임의로 8개 지역의 산양삼 재배지를 선 정하여 위부터 알파벳순으로 (A∼H) 명명하였으며, 시료 는 산양삼 중에서도 고년근인 13년생 산양삼 시료를 각 5 본씩 채취하였다 (Fig. 1). 토양 시료는 각 재배지에서 표토 를 제거하고 토심 10∼30 cm에서 근권 토양 100 g을 채취 하였다. 채취한 산양삼 시료는 [산양삼 표준재배지침]의 수확 후 관리방법에 따라 수태 (Sphagnum moss)를 위아래 로 덮은 후 4°C의 저온장소에 보관하였다 (Jeon et al. 2018). 토양 시료는 사용목적에 따라 구분해서 보관하였는데 미 생물 군집분석에 이용할 토양은 -20°C의 냉동고에 보관 하였고, 이화학성 분석에 사용할 토양은 서늘하고 건조한 곳에서 풍건한 다음 2 mm sieve를 이용하여 거른 후 실온 에서 보관하였다. 토양이화학적 특성은 농촌진흥청 [종합 검정실 분석 매뉴얼]을 참고하여 분석하였다 (RDA 2013).

2. 산양삼 재배지의 토양세균군집 분석

지역별 채취한 토양 시료의 total DNA의 추출은 Powersoil^TM DNA isolation kit (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 추출하였다. 16S rRNA Polymerase chain reaction (PCR) 증폭 및 염기서열 분석은 천랩 (Chunlab, Seoul, Korea)의 Illumina Miseq sequencing system에 따 라 수행하였다. Primer는 341F (5ʹ-TCGTCGGCAGCGTC AGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGC AG-3ʹ)와 805R (5ʹ-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGT ATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATCC-3ʹ)을 사용하여 V3-V4 region을 타겟으로 PCR 증폭을 진행하였 다. PCR 조건은 다음과 같다. Initial denaturation: 95°C, 3 min, Denaturation: 95°C, 30 sec (25 cycles), primer annealing: 55°C, 30 sec, Extension: 72°C, 30 sec, Final elongation: 72°C, 5 min. Raw sequence 분석은 Mothur pipeline (ver. 1.40)을 이용하여 분석하였고 (Schloss et al. 2009), 데이터베이스는 ‘Greengene’ reference database를 이용하여 염기서열을 분 석하였다 (Schloss 2009). 이후 염기서열은 Distance based greedy clustering (DGC) 분석을 이용하여 97% 유사수준의 Operational taxonomic units (OTUs)로 군집화하여 토양세 균군집의 군집화 (Clustering) 및 상대적 빈도수 (Relative abundance)를 분석하였다 (Kim et al. 2019).

3. 산양삼 생육특성 조사

채취한 13년생 산양삼 샘플의 생육특성을 조사하기 위 해, 국립종자원의 ^『인삼_』 작물별 특성조사요령을 준수하여 뇌두길이, 주근직경, 주근길이, 지하부 생중량을 측정하였 다 (KSVS 2014). 이후 산양삼 지하부 표면을 증류수로 세 척하고 EPSON scanner (Expression 12000XL)를 이용하여 스캔하였다. 스캔한 파일은 WinRHIZO^TM Pro software (ver. 2017, Regent Instruments, Canada)를 이용하여 산양삼 지 하부를 픽셀 (Pixel) 단위로 측정한 후, 넓이 단위로 전환하 여 단면적 (Cross-section area), 표면적 (Surface area), 부피 (Volume)를 측정하였다 (Wisam et al. 2018).

4. 통계 및 상관관계 분석

분석된 데이터는 평균±표준오차 (means±standard error; S.E.) 값으로 나타냈고, 실험 데이터의 통계처리 및 유의성 검정은 Statistical analysis system (SAS, ver. 9.4) software를 이용하여 토양세균군집 cluster 간의 상대적빈도수와 산양 삼 생육특성에 대한 통계분석은 T-검정을 통해 유의성을 검정하고 최소유의차 (Least significant difference; LSD)는 p<0.05 수준에서 통계처리 하였다. 산양삼의 생육특성과 토양세균군집 간의 상관관계 분석 (Correlation analysis)는 STATISTICA software (ver. 7. 1)를 사용하여 Spearman’s rank correlation 상관계수 (r)와 유의성 (p<0.05)을 확인하 였다.

결과 및 고찰

1. 산양삼 재배지의 토양이화학성

산양삼 재배지 8지역의 토양 이화학성을 조사한 결과, 모 든 재배지의 토성은 양질사토이고, 토양산도 (pH)는 3.84∼ 5.20으로 산성 또는 약산성토양으로 나타났다 (Table 1). 유 기물 함량 (Organic matter)은 4.2∼21.4%이었고, 유효인산 (Avaliable phosphate)은 41.9∼292.1 mg kg^-1, 전질소 (Total nitrogen)는 0.12∼0.69%, potassium (K)은 0.06∼0.54 cmol⁺ kg^-1, calcium (Ca)은 0.9∼12.0 cmol⁺ kg^-1, magnesium (Mg) 은 0.17∼5.57 cmol⁺ kg^-1, sodium (Na)은 0.04∼0.08 cmol⁺ kg^-1, 양이온 치환용량 (Cation exchange capacity)은 14.4∼ 35.9 cmol⁺ kg^-1으로 나타났다. 2013년 임업진흥원에서 조 사한 우리나라 전국 산양삼 재배지의 토양 특성은 pH 4.0∼6.0, 전질소 0.15∼0.8%, 유기물 2.0∼7.0%, K 0.3∼0.7 cmol⁺ kg^-1, Ca 1.2∼4.1 cmol⁺ kg^-1, Mg 1.0∼1.5 cmol⁺ kg^-1 으로 본 연구에서 선정하여 조사한 산양삼 재배지 8지역의 토양 특성과 비교한 결과, 토양 pH와 전질소 함량은 유사 하게 나타났으나, 유기물을 비롯한 K, Ca, Mg의 함량은 차 이를 보이는 것으로 확인되었다 (KOPPI 2013). 이와 같은 결과는 조사된 산양삼 재배지의 차이로 인한 것으로 생각 되며, 임업진흥원에서는 토양 pH 6.5 이상, 유효인산 300 mg kg^-1, 칼륨 0.8 cmol⁺ kg^-1 이상에서 산양삼이 생리적으 로 제한을 받는다고 발표한 연구결과를 통해 본 연구에서 선정한 8개의 산양삼 재배지는 산양삼의 재배에 적합하다 고 판단된다.

2. 토양미생물군집 및 상대적 빈도수

산양삼 재배지 토양세균군집의 계통학적 군집화를 phylogenetic tree를 이용하여 확인한 결과, 8지역의 토양세균군 집이 2개의 cluster (Cluster 1: A, B, C, E 재배지의 토양세균 군집, Cluster 2: D, F, G, H 재배지의 토양세균군집)로 뚜렷 하게 군집화를 이루는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). Phylum 수준의 상대적 빈도수를 확인한 결과, 8지역의 재배지 모두 Proteobacteria의 상대적 빈도수가 전체 평균의 35.4% 로 우점인 것으로 확인되었으며, Acidobacteria (22.9%), Actinobacteria (10.3%), Bacteroidetes (9.7%), Chloroflexi (6.9%), Planctomycetes (4.4%) 순으로 나타났다 (Fig. 2a). Classes 수 준에서는 Ahlpaproteobacteria가 24.4%로 우점이었고, Spartobacteria (7.6%), Acidobacteriia (7.5%), Ktedonobacteria (5.5%), Actinobacteria (5.1%) 순으로 높은 상대적 빈도수를 확인하 였다 (Fig. 2b). Nguyen et al. (2016)의 연구에서도 pyrosequencing 분석을 이용하여 우리나라 인삼 재배지로부터 채 취한 30개의 토양 시료에서 미생물군집을 분석한 결과, 본 연구의 결과와 유사하게 Proteobacteria가 전체의 30.16% 로 우점으로 나타났고, Acidobacteria (29.16%), Chloroflexi (18.15%) 순으로 나타났다. Sun et al. (2017)의 연구에서는 인삼 (Panax ginseng) 재배지의 토양미생물군집을 조사한 결과, Proteobacteria가 40.88%로 우점이었고, Acidobacteria (15.59%), Actinobacteria (11.55%), Gemmatimonadetes (7.36%), Chloroflexi (4.17%) 순으로 상대적 빈도수가 높게 나타났으며, classes 수준에서도 Alphaproteobacteria가 우점 으로 본 연구의 결과와 매우 유사하게 나타났다. 두 개의 cluster 간 토양세균군집의 상대적 빈도수를 비교 분석한 결과, 먼저 phylum 수준에서는 Proteobacteria (p=0.03)와 Actinobacteria` (p=0.02)는 cluster 1에서 cluster 2에 비해 상 대적 빈도수가 유의적으로 높았다 (Table 2). 반면 Chloroflexi (p=0.04), Fimicutes (p=0.004), Cyanobacteria (p=0.004)는 cluster 2에서 cluster 1에 비해 유의적으로 상대적 빈도수 가 높은 것으로 나타났다. Classes 수준에서 cluster 간의 상 대적 빈도수를 확인한 결과, Ahlpaproteobacteria (p=0.029) 와 Betaproteobacteria (p=0.021)는 상대적 빈도수가 cluster 1에서 cluster 2에 비해 상대적 빈도수가 유의적으로 높았 고, Acidobacteriia (p=0.041), Ktedonobacteria (p=0.019), Gammaproteobacteria (p=0.034), Bacilli (p=0.009)은 cluster 2에서 유의적으로 상대적 빈도수가 높은 것으로 나타났다.

3. Cluster 간의 산양삼 생육특성 및 토양 이화학성 비교

토양세균군집 cluster 간 산양삼의 생육특성을 비교 분석 한 결과, cluster 2 재배지에서 수집한 산양삼 시료의 지하 부 생중량은 cluster 1 재배지에서 수집한 산양삼 시료에 비 해 cluster 2에서 유의적 (p=0.04)으로 높았다 (Table 3). 두 cluster 재배지 간의 토양 이화학성을 비교한 결과, cluster 2 재배지의 토양 pH가 cluster 1 재배지에 비해 유의적 (p= 0.03)으로 낮게 나타났다 (Table 4). 다른 토양 이화학성은 cluster 재배지 간의 유의적인 차이를 확인할 수 없었다. 이 와 같은 결과는 산양삼 재배지의 토양 pH가 cluster 1 재배 지의 평균인 pH 4.86 이하에서 지하부의 생중량이 증가한 다는 것을 의미한다. 실제로 8지역의 산양삼 재배지 중에 서 pH 4.86 이하의 재배지의 산양삼 생중량이 pH 4.86 이상 의 재배지에 비해 높은 것으로 나타났다 (Data not shown). Lee (2010)의 연구에서 산양삼 재배지의 토양특성을 분석 한 결과, 평균 토양 pH가 4.85인 약산성 토양으로 나타났 고, Kown et al. (2011)의 연구에서도 전국 9개도 18지역 산 양삼 재배지의 평균 토양 pH가 4.72로 우리나라 산림 토 양의 평균 pH 5.48 (Joeng et al. 2002)보다는 대체로 낮게 조사되어 본 연구의 결과를 통해 보다 낮은 pH의 토양에 서도 산양삼의 재배가 가능한 것으로 판단된다. 또한 토양 pH는 토양미생물의 군집에 영향을 주는 대표적인 환경요 인 중 하나로, 토양미생물군집을 결정하는 중요한 역할을 하며 (Wu et al. 2017), pH가 토양미생물군집에 미치는 영 향과 이의 상관관계에 대한 연구는 최근까지도 다양한 환 경의 토양에서 활발히 진행되고 있다 (Bartram et al. 2014;Cao et al. 2016;Xue et al. 2017;Ren et al. 2018).

4. 산양삼의 생육특성과 토양세균군집 간의 상관관계

산양삼 생육특성과 토양세균군집 간의 상관관계를 분석 한 결과, Acidobacteria에 속하는 Acidobacteriia가 주근직경 (r= 0.857, p=0.007), 단면적 및 표면적 (r= 0.738, p=0.037) 과 유의적인 정의 상관관계를 보였으며, Koribacteraceae는 주근길이 (r= 0.810, p=0.015), 부피 (r= 0.857, p=0.007)와 유의적인 정의 상관관계를 보이는 것을 확인하였다 (Table 5). Acidobacteria는 본 연구의 8지역 산양삼 재배지에서 Proteobacteria 다음으로 상대적빈도수가 높은 것으로 나타났 고, 산양삼의 생육이 좋았던 G 재배지와 H 재배지의 Koribacteraceae의 상대적빈도수가 다른 재배지의 상대적빈도수 보다 유의적으로 높은 것을 확인하였다. Wang et al. (2019) 의 연구에서도 인삼 재배지의 미생물군집을 분석한 결과, 토양 pH가 낮은 재배지에서 Acidobacteria 군집의 상대적 빈도수가 유의적으로 높은 것으로 보고되었다. 이와 같은 결과는 본 연구의 토양세균군집의 cluster에 따른 상대적 빈도수를 비교한 결과에서도 Acidobacteriia의 상대적 빈도 수가 pH가 낮은 cluster 2 재배지에서 유의적으로 높은 것 을 뒷받침하며, Acidobacteria에 속하는 미생물군집이 pH가 낮은 토양에서 높은 상대적빈도수를 가지고, 산양삼의 생 육을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 판단된다. 실제로 Acidobacteria 미생물군집과 토양 이화학성 간의 상관관계 를 분석한 결과, Acidobacteria 속 미생물군집은 토양 pH와 부의 상관관계를 보였으며, 이 중에서 Koribacteraceae의 상대적 빈도수가 토양 pH와 유의적인 부의 상관관계 (r= - 0.762, p=0.028)을 보이는 것으로 확인되었다 (Table 6). 이러한 결과로 미루어 보아 산양삼 재배지의 토양 pH와 토양 내 Acidobacteria 속 세균군집의 상대적 빈도수가 산양 삼 생육과 매우 밀접한 관계가 있는 것으로 판단된다. 이후 에는 산양삼을 재배하지 않은 토양의 이화학성 및 Acidobacteria 속 미생물군집의 상대적 빈도수를 비교·분석하는 연구를 추가로 수행한다면 산양삼 재배여부에 따른 토양 이화학성 및 토양세균군집 변화를 확인할 수 있을 것이다. 산양삼의 경우, 일반적인 임산물과 비교하여 장기적인 재 배와 친환경적인 재배를 원칙으로 하는 [특별관리 임산물] 로 지정하여 관리 및 감독하고 있는 만큼 본 연구결과가 향후 토양미생물군집과 산양삼 생육 간의 상관관계를 구 명하는 중요한 자료가 될 것으로 생각되고, 나아가 산양삼 재배 이전에 산양삼의 생육에 유용한 토양세균군집을 확 인할 수 있다면 산양삼 재배적지를 선정하는데 도움을 줄 수 있을 것이다. 또한, 토양이화학성과 더불어 임상 및 주 변식생에 따른 토양세균군집과 산양삼 생육특성에 대한 상관관계 연구를 추가로 수행한다면 보다 명확한 정보를 대한 제공할 수 있을 것으로 사료된다.

적 요

본 연구는 전국 임의의 산양삼 재배지를 선정하여 재배 지 내의 토양 특성 및 토양세균군집을 분석하고, 토양 이 화학적 특성, 토양세균군집 및 산양삼 생육특성 간의 상관 관계를 구명하기 위하여 수행되었다. 토양세균군집 분석 은 pyrosequencing analysis (Illumina platform)를 이용하였 고, 토양세균군집과 생육특성 간의 상관관계는 Spearman’s rank correlation을 이용하여 분석하였다. 8개 산양삼 재배 지로부터 분리한 토양세균군집은 2개의 군집으로 군집화 를 이루는 것을 확인하였다. 모든 토양샘플에서 Proteobacteria와 Alphaproteobacteria가 각각 35.4%, 24.4%로 가장 높 은 상대적 빈도수를 보였다. 산양삼의 생육은 토양 pH가 낮고 Acidobacteria의 상대적 빈도수가 높은 토양에서 증가 하였으며, Acidobacteriia (class)와 Koribacteraceae (family)의 상대적 빈도수는 산양삼의 생육과 유의적인 정의 상관관 계를 보이는 것으로 나타났다. 본 연구 결과는 토양세균군 집과 산양삼 생육 간의 상관관계를 구명하는 중요한 자료 가 될 것으로 생각되고, 나아가 산양삼 재배 이전에 산양삼 의 생육에 유용한 토양세균군집을 확인할 수 있다면 산양 삼 재배적지를 선정하는데 도움을 줄 수 있을 것이다. 또 한 토양이화학성과 더불어 임상 및 주변식생에 따른 토양 세균군집과 산양삼 생육특성에 대한 상관관계 연구를 추 가로 수행한다면 보다 명확한 정보를 대한 제공할 수 있을 것으로 사료된다.