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서 론
남세균은 오늘날 인류에게 중요한 분류군으로 대두되 었으며, 긍정적인 측면과 동시에 부정적인 측면도 가지고 있다. 많은 종류의 남세균은 전 세계적으로 녹조현상을 일 으키고, 독소를 생산하고 있다 (Graham et al. 2009).
남세균은 담수와 해수 환경에 널리 분포하고, 부유하거 나 또는 기질에 부착하여 자란다. 또한 육상 환경의 토양, 암반 등에 자라는 기중조류가 있으며 다양한 생물과 공생 관계로 살아가기도 한다 (Sze 1997). 남세균이 동굴 벽화나 비석과 같은 석조문화재 등에 서식함으로써 생물풍화의 원인을 제공하기도 한다 (Mandrioli et al. 2003).
남세균의 분류는 오랫동안 주로 형태적 특징을 위주로 이루어져 왔으나, 현대의 연구에서는 형태적 형질과 함께 분자적 연구방법, 세포형태학적 특징 그리고 생태적 특징 등을 도입하여 여러 측면의 형질의 조합을 통한 연구가 진행되고 있다 (Komárek and Anagnostidis 2005;Komárek 2016).
남세균에 대한 연구는 전 세계적으로 4,707종이 보고된 반면, 국내에서는 343분류군이 보고되어 있다 (Kim 2015;Guiry and Guiry 2019). 남세균의 주요 속에 대한 분포를 비교해보면, Oscillatoria속은 세계적으로 501분류군이 보 고되어 있으나, 국내에는 21분류군이 보고되어 있다. 녹조 현상의 원인종인 Microcystis속은 68분류군이 수록되어 있 으나, 국내에는 9종이 보고되어 있다 (Yim et al. 2018). 또 한 Anabaena속은 222분류군이 보고된 반면, 국내에는 9분 류군이 보고되어 있다. Aphanizomenon속은 22분류군이 보 고되어 있는데 국내에는 3종이 보고되어 있다 (Ryu et al. 2017). Phormidium속은 265분류군이 보고되어 있는데 국 내에는 30분류군만이 보고되어 있다. 이와 같이 국내 남세 균 분포에 관한 연구는 미흡한 실정이며, 더 많은 연구를 통한 국내 남세균의 분포에 대한 연구가 필요하다.
특히 국내 기중조류에 대한 연구는 담수와 해양 남세 균 연구에 비해 더욱 부족한 상황이다. 국내의 기중조류는 Chang et al. (1998)에 의해 토양조류의 생활사 연구를 통 하여 16분류군이 보고된 바 있다. 또한 국내 석조문화재에 서식하는 기중조류의 연구가 수행되었으며, 이를 통하여 Haplaosiphon fontinalis와 Stigonema turfaceum종을 포함한 7분류군의 국내 미기록종이 보고되었다 (Klochlkova et al. 2006;Lim and Lee 2008a, 2008b;Kim et al. 2010, 2011).
국외의 기중조류 연구를 살펴보면, 미국 텍사스 지역 의 토양조류 연구에서 Anabaena, Phormidium 등 52분류군 이 보고되었고 (King and Ward 1977), 이집트에서는 30분 류군의 토양 남세균이 보고되었다 (Mansour and Shaaban 2010). 인도에서는 Nostoc, Tolypothrix 등 수피에 서식하 는 25분류군의 남세균이 연구되었다 (Mikter and Shukla 2006).
최근의 연구에서는 흔들말목 (Oscillariales)에 속하는 Phormidium속, Microcoleus속 등은 많은 연구에서 다계통임 을 제시하고 있다 (Siegesmund et al. 2008;Strunecký et al. 2011;Casamatta et al. 2012). 따라서 형태형질과 함께 분자 적 연구를 통하여 신속 또는 신종에 대한 보고가 계속되고 있다.
남극의 담수수계로부터 채집된 시료의 형태적 형질 및 유전적 형질 등을 이용한 연구에서 Phormidium속으로부 터 Wilmottia속이 신속으로 분리, 명명되었다 (Strunecký et al. 2011). 또한 브라질 지역의 열대지역 시료로부터 Wilmottia속의 새로운 종이 보고된 바 있다 (Machado-de-Lima et al. 2017). Phormidium속과 유사한 형태를 가지는 시료의 연구에서 Pycnacronema속이 분리되어 신속, 신종으 로 명명된 바 있다 (Martins et al. 2019). 이와 같이 기중성 남세균에 대한 신종 발굴이 세계적으로 활발히 진행되고 있다.
본 연구에서는 금강수계 하구역 하제항 주변의 암벽에 서식하는 기중성 남세균을 채집하여 단조류 배양을 실시 하였다. 형태적 형질과 세포 미세구조, 그리고 분자적 형질 을 사용하여 종 동정을 실시하였고, 이를 통하여 국내 미 기록속과 미기록종을 추가하는 연구를 수행하였다.
재료 및 방법
1. 채집지 및 채집방법
본 연구의 기중성 남세균은 2019년 2월에 금강수계 하 구역의 하제항 (35°53ʹ21.2″N/126°37ʹ41.8″E)에 위치한 건 조한 암벽으로부터 채집되었다. 기중성 남세균은 건조한 암벽에 부착되어 검은색과 진한 갈색 등 여러가지 색으로 나타났다. 부드러운 솔이나 멸균된 스패튤라를 이용하여 암벽의 검은색의 지의류와 선태류를 채집하였다 (Kiel and Gaylarde 2006). 채집된 시료들은 현장에서 증류수를 부어 수화시킨 후, 4°C의 아이스박스에 보관하여 실험실로 운 반되었다.
2. 실내배양
단조류 배양을 위해 광학현미경 하에서 파스퇴르 피 펫을 이용하여 한 군체를 뽑아서 1.2% agar를 넣은 고체 배지에 올려 배양하였고, 한 가닥씩 24-well plate (SPL, Pocheon, Korea)에 넣어 분리하였다. 24-well plate에서 1~2주간 배양 후, 50 mL cell culture flask (SPL, Pocheon, Korea)에 옮겨 대량배양을 실시하였다. 단조류 배양 및 대량배양은 BG-11 배지 (Stanier et al. 1971)를 사용하였다. 실내배양은 20~25°C, 광 : 암 주기 16 :8, 조도는 25 μmol m-2 s-1의 조건 하에서 실시되었다.
3. 형태관찰
본 연구에서는 광학현미경 (Axio Imager A2, Carl Zeiss, Germany; Olympus BX53, Olympus, Japan)을 이용하여 Wilmottia의 배양주 2주 (ACKU581, ACKU582)를 100~1000 배율로 관찰하였고, 200~1000 배 하에서 사진촬영을 실 시하였다 (AxioCam HRC camera, Carl Zeiss, Germany; Olympus UC-90, Olympus, Japan).
남세균의 분류체계는 Komárek et al. (2014)에 따랐고, Algaebase를 참조하였다 (Guiry and Guiry 2019). 또한 남세 균의 동정은 Komárek and Anagnostidis (2005), Strunecký et al. (2011), 그리고 Machado-de-Lima et al. (2017)를 참조 하였다.
4. DNA 추출
남세균의 genomic DNA 추출을 위해 배양주 2주의 세 포 (50 mL)를 3,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 수확하였다. 농축된 세포를 1 ×TE buffer (10 mM Tris- HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) 200 μL에 희석하여 -20°C에 서 DNA를 추출하기 전까지 보관하였으며, 이후 cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 방법을 이용하여 gDNA를 추출하였다 (Richards et al. 2003).
5. 효소중합연쇄반응 (PCR) 및 DNA 시퀀싱
남세균 Wilmottia 배양주 2주의 16S rDNA 유전자를 박 테리아 16S 대상의 범용 프라이머 (27F, 5ʹ-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3ʹ)와 23S 대상으로 자체 제작한 역 방향 프라이머 (CY-23R600, 5ʹ-CGG CTC ATT CTT CAA CAG GCA C-3ʹ)를 사용하여 PCR 기법으로 증폭하였다. PCR 반응은 추출한 gDNA (1 μL), 각각의 프라이머 (10 pmole, 1 μL)와 PCR 반응액 (17 μL)을 혼합하여 실시하였 다. PCR 반응액으로 1×PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.5 mM forward-reverse 프라이머, 1 unit Ex Taq polymerase (Takara Bio, Shiga, Japan)를 사용하였다. PCR 반응은 iCyclerTM (Biorad, Hercules, CA)를 이용하여 초기 94°C 5분간 DNA 를 변성시키고, 이후 94°C 20초, 50°C 30초, 72°C 60초를 40 회 반복하여 대상 유전자 영역을 증폭하였다. PCR 증폭 반응이 종료되면 추가로 72°C 10분간 유지하여 반응을 종 결하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 겔에서 전기영 동하여 관찰하였다.
DNA sequencing은 PCR 산물을 QIAquick PCR purification kit (Qiagen GmbH, Germany)로 정제하여, PCR 프 라이머 (27F, CY-23R600, 시퀀스-walking 프라이머)와 ABI PRISM® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (PE Biosystems, CA)를 이용하여 실시하였다. DNA sequencing 단편은 자동 DNA 분석기 (Model 3700, Applied Biosystems, CA)로 분석하였다. 각각의 배양주로 부터 얻은 염기서열 단편을 Sequencher 4.1.4 (Gene Codes, MI)을 이용하여 조합된 단일 염기서열로 만들고, 염기서 열을 GenBank에 등록하였다 (Table 1).
6. 염기서열 유사도, 유전거리, 계통 분석
남세균 Wilmottia 배양주 2주의 16S rRNA 유전자의 염기서열 유사도 (DNA similarity)와 유전거리 (genetic distance)를 분석하였다. 본 연구에서 규명한 염기서열 과 GenBank로부터 얻은 Wilmottia 염기서열로 데이터 조합을 만들고, BioEdit 소프트웨어 (http://www.mbio. ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)를 이용하여 염기서열 재 배열 (alignment)한 후, 같은 길이가 되도록 양 끝을 제 거하였다. 이후, BioEdit를 이용하여 유사도를 계산하고, MEGA 6.0 (http://www.megasoftware.net)에서 Kimura 2-parameter 모델을 이용하여 유전거리를 계산하였다.
본 연구에서 채집된 배양주 2주와 GenBank로부터 얻은 18주, 총 20주의 Wilmottia속의 16S rDNA 염기서열을 이용 하여 (Table 1), Maximum Likelihood (ML) 계통분석을 실 시하였다. 분석은 16S rDNA 염기서열을 MAFFT 소프트 웨어 (Katoh and Standley 2013)로 재배열하고, 이 후 양 끝 을 동일한 크기로 자른 후 데이터 세트를 준비하였다 (16S rRNA, 1,493 sites에서 1,402 sites 선택). ML 계통도는 GTR nucleotide substitution model을 이용하여 RAxML 8.0로 추정하였다 (Stamatakis 2014). 추가적으로 MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck and Ronquist 2001)을 이용하여 Markov Chain Monte Carlo (MCMC) 과정을 100만번 실시하 여 Bayesian tree를 만들고, 각각의 clade에 대한 posterior probability (PP) 신뢰도 값을 구하였다.
7. TEM 미세구조
TEM (transmission electron microscope)촬영을 위해 시 료의 전처리 과정은 고정-후고정-탈수-치환-포매-중합- 초박절편 순으로 진행되었다. 시료는 Glutaraldehyde 2%, Paraformaldehyde 2% 용액 (희석 용액 PBS)을 이용하여 고 정하였고, 후고정은 Osmium tetroxide 2%으로 1시간, 탈수 는 Ethanol 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%에서 각 20분씩, 치환은 Ethanol : Propylene oxide=2 : 1, 1 : 1, 1 : 2, Propylene oxide 100%에서 각 20분씩, 포매는 Propylene oxide : Epon=2 : 1, 1 : 1, 1 : 2, Epon 100%에서 각 20분씩 처리하 였다. 중합은 60°C에서 48시간 동안 정치하였다. 그 후 초 박절편을 하여 Coated Square Grid에 올려 JEm-2100F ( JEOL, Japan), OneView (Gatan, USA)를 통하여 촬영하 였다 (Kim et al. 2015).
결과 및 고찰
본 연구에서는 금강 하제항 주변 암벽에서 채집된 기중 시료로부터 형태적 특징, TEM의 세포 미세구조, 염기서열 에 의한 계통수 분석을 통해 Wilmottia murrayi를 동정, 분 류하였고, 이는 국내 미기록속 및 미기록종으로 밝혀졌다.
1. 형태적 특징
Family Coleofasciculaceae Komárek, Kastovsky, Mares and Johansen 2014
Gunus WilmottiaStrunecký, Elster and Komárek 2011
사상체 (filament)는 단일가닥으로 존재하거나 다발을 이룬다. 다발은 전체적으로 원통형으로 길게 뻗어 있거나 감겨져 있으며, 무색의 얇고 넓은 점액질 초 (sheath)에 불 규칙하게 싸여 있다. 세포사 (trichomes)는 얇고 뚜렷한 무 색의 점액질 초로 싸여 있으며, 간혹 점액질 초가 융해되 어 보이기도 한다. 세포사는 원통형이고, 세포간 격벽은 함 입되지 않거나 약하게 함입되기도 한다. 또한 세포사 끝부 분은 폭이 일정하게 나타나며, 둥근 정단부를 가지고, 칼 립트라 (calyptra)가 없다. 세포는 옅은 청록색이며, 원통형 의 정사각형이고, 간혹 길이가 폭보다 짧기도 하며, 세포의 길이가 다양하게 나타난다. 대부분 큰 과립이 흩어져 있지 만, 드물게 세포간 격벽 부분에 모여 있기도 하다. 틸라코 이드의 배열은 대부분 세포 측면에 위치하며, 환경조건에 따라 간혹 불규칙하게 변한다.
Wilmottia murrayi (West and West) Strunecký, Elster and Komárek 2011 (Fig. 1)
Basionym:Lyngbya murrayi West and West 1911
Synonyms:Phormidium murrayi (West and West) Anagnostidis and Komárek 1988
Microcoleus glaciei Johansen and Casamatta 2005
사상체 (filaments)는 단독이거나 여러 가닥이 무색의 매 우 얇은 점액질 초 (sheath)에 싸여 평행하게 다발을 이룬 다. 세포사 (trichomes)를 싸고 있는 무색의 점액질 초는 얇고 뚜렷하며, 파상무늬가 없고 끝이 열려있다. 세포사 는 반듯하거나 약간 구부러져 있으며, 세포간 격벽은 함입 되어있지 않고, 간혹 약하게 함입되기도 한다. 세포 폭은 3.84~5.01 μm이다. 세포는 정사각형이고, 폭보다 길이가 짧기도 하며, 다양한 길이의 세포가 나타난다. 옅은 청록색 을 띠며, 대부분 큰 과립이 흩어져 있지만, 드물게 세포간 격벽 부분에 모여 있기도 하다. 정단의 끝세포는 둥글고, 칼립트라 (calyptra)가 존재하지 않는다. 여러 겹의 틸라코 이드가 세포 내 측면에 둥글게 배열되어 다발을 이룬다.
Ecology: 담수, 습한 토양 및 수피 등 다양한 환경에 분포 하는 종이다 (Machado-de-Lima et al. 2017). 본 연구에서는 건조한 암벽에 분포하는 기중성 종으로 나타났다.
Distribution: 남극 (Mataloni and Pose 2001;Mataloni and Tell 2002), 브라질 (Machado-de-Lima et al. 2017)
Site of collection: 전라북도 군산시 옥서면 난산길 33 (35°53ʹ21.2″N/126°37ʹ41.8″E)
Date of collection: 2019년 02월 21일
Specimen Locality: ACKU581, ACKU582
2. 염기서열 특성 및 분자계통
본 연구에서 남세균 Wilmottia murrayi (Coleofasciculaceae, Oscillatoriales)의 배양주 2개의 16S rDNA 염기서 열을 규명하였다 (Table 1). 이들은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에서 등록된 W. murrayi 4개 배양주 염기서열 (30P, KY288995; 29PC, KY288994; 27PC, KY288992; 26PC, KY288991)과 각각 99.9% 이상 높은 유사도를 보였다.
남세균 Wilmottia속의 16S rDNA 염기서열 (W. murrayi 18개와 W. stricta 2개)을 이용하여 ML tree 분석을 실시하 였다 (Fig. 2). 동일한 데이터를 이용한 Bayesian 분석에서 유사한 branch 양상을 보였다. 모든 W. murrayi는 W. stricta 와 뚜렷하게 분리되었으며, W. murrayi는 종내에서 4개의 clades를 형성하였다 (Machado-de-Lima et al. 2017). 우리나 라에서 분리한 2개의 배양주는 브라질에서 분리된 5개 배 양주와 같은 clade를 형성하였다.
추가적인 염기서열 유사도와 유전거리 분석에서 우리 나라 배양주는 W. murrayi 12개 배양주와 99% 이상 유사 도를 가졌고, 3개의 배양주와 98.3% 이상으로 파악되었다 (Table 2). 그러나 이들은 W. stricta와는 97.5% 이하의 유사 도를 보여 뚜렷한 차이를 나타냈다.
본 연구에서 실시한 BLAST 검색, 분자계통분석, 유전거 리 분석은 우리나라 Wilmottia 배양주가 W. murrayi라는 것 을 분자적으로 제시하였다.
3. TEM의 ultrastructure
세포내 틸라코이드는 여러 겹으로 세포막 주변에 분 포하였다. 이와 같은 틸라코이드의 세포내 분포 형태는 Coleofasciculaceae과가 가지는 특징이다 (Komárek et al. 2014). 카르복시좀으로 사료되는 비교적 큰 단일 과립이 존재하였고, 작은 과립들은 세포간 격벽 부근에 분포하였 다 (Fig. 3).
적 요
국내 금강수계의 하구역에 위치한 하제항 암벽으로부 터 기중성 남세균이 채집되어, 단조류 배양되었다. 2개의 남세균 배양주로부터 형태적 형질과 TEM에 의한 세포 미 세구조 특징을 관찰하였다. 또한 16S rDNA 염기서열을 규 명하여 BLAST 검색, 염기서열 유사도, 유전거리 및 계통 분석을 실시하였다. 국내 배양주는 Wilmottia murrayi와 계 통학적으로 동일한 clade를 형성하였고, 99% 이상의 유사 도를 나타냈다. TEM을 통한 세포 미세구조는 틸라코이드 가 여러겹으로 세포막 주변에 분포하는 특징을 나타냄으 로써 Coleofasciculaceae과의 특징과 일치하였다. 이상의 결과를 통해 W. murrayi를 국내 미기록속 및 미기록종으로 보고하였다.
