서 론
녹조현상이라 부르는 유해 미세조류의 대발생 (Harmful algal bloom)은 Microcystis sp.나 Anabaena sp.와 같은 남조 류 (Cyanobacteria)가 수중 생태계에서 급격하게 증식하 는 현상을 말한다 (Paerl et al. 2001;Fahnenstiel et al. 2008). 최근 지구온난화로 인한 수온상승, 점/비점오염원으로부 터 유입되는 과도한 양의 영양염류 (nutrients)로 인한 수 계의 부영양화 (eutrophication), 그리고 인위적인 수역변 화로 인하여 이러한 녹조현상의 발생의 빈도와 정도가 심 화되면서 수자원의 안정성이 위협받고 있다. 유해 남조류 의 대규모 증식은 수변환경의 미관을 해치고 악취를 유 발시키는 등 1차적인 피해와 더불어 수계 내 산소 고갈로 인한 어류의 폐사, 먹이사슬 교란과 같은 환경 문제를 발 생시킬 수 있다 (Kim et al. 2018). 뿐만 아니라 남조류는 microcystins (MCs)이나 cylindrospermopsin (CYL)과 같은 인간과 동물에 치명적인 조류독성물질 (cyanotoxins)을 수 계에 배출시킬 수 있다 (León and Peñuela 2019). 담수환경 에서 녹조를 유발하는 주요 남조류인 Microcystis aeruginosa 로부터 배출되는 MCs는 간손상을 유발시키는 간독성물질 (hepatotoxin)로 녹조 발생 시 검출되는 대표적인 조류독성 물질이다. 그 중, microcystin-LR (MC-LR)은 가장 독성이 강한 MCs의 형태로 보고되고 있기 때문에 세계보건기구 (World Health Organization; WHO)에서는 MC-LR의 독성 (LD50=60 μg kg-1) 등을 고려하여 식수 내 MC-LR의 기준 치를 1.0 μg L-1 이하로 설정하고 있다 (Merel et al. 2013;Li et al. 2017;Dixit et al. 2019).
Chorus et al. (2000)에 따르면 미국, 브라질 등의 국가에 서 유해 미세조류가 대규모 증식한 수자원의 흡입 및 접 촉에 의한 다양한 실제 피해사례가 보고되고 있다. 따라 서 이러한 피해를 최소화하고 안전한 수자원을 확보하기 위하여 주요 수자원에 발생한 유해 미세조류를 초음파처 리 (ultra-sonication), UV 조사 (UV irradiation), 폭기/순환 (aeration/circulation), 여과 (filtration), 황토를 활용한 응집 (coagulation) 및 과산화수소 (hydrogen peroxide), 살조제 (algaecides) 살포, 항균성 펩타이드 (algicidal peptides) 적용 같은 다양한 물리, 화학적 방법이 적용 및 개발되고 있다 (Kim et al. 2016, 2018;Han et al. 2018). 하지만, 이러한 방 법은 수생태계에 영향을 줄 수 있는 2차 부산물의 형성, 고 비용의 시설투자 및 운용비 등의 문제가 있다 (Guan et al. 2014). 또한, 유해 미세조류의 처리과정 시 세포구조의 파 괴를 동반하기 때문에 미세조류 세포 내에 존재하는 조류 독성물질의 배출을 촉진시킬 위험이 있다 (Kim et al. 2018). 따라서, 보다 환경영향성이 적은 유해조류 처리 기술의 개 발이 요구된다.
흡착 (adsorption)은 흡착소재 (활성탄, 이온교환수지, 생 체흡착소재 등)를 사용하여 수계 내 존재하는 중금속이 나 염료 등의 이온성 오염물질을 효과적으로 제거할 수 있 는 기술이다 (Kim et al. 2015). 바이오폴리머 (키토산, 알지 네이트 등), 해조류, 농업 부산물, 바이오산업 폐기물 (박테 리아 및 미세조류), 활성슬러지 등의 다양한 바이오매스 는 표면에는 하이드록실기 (-OH)나 카르복실기 (-COOH) 와 같은 음이온성 작용기 및 아민기 (-NH2)와 같은 양이 온성 작용기를 가지고 있다고 보고되고 있기 때문에, 양 이온성 또는 음이온성 오염물질의 제거를 위한 생체흡 착소재 (biosorbents)로서 활용할 수 있다 (Volesky 2007;Vijayaraghavan and Yun 2008). Won and Yun (2008)은 발 효산업 폐기물인 Corynebacterium glutamium을 생체흡착소 재로 사용하여 음이온성 염료인 Reactive Yellow 2 (RY2)를 흡착/제거하는 경향을 보고한 바 있다. 또한, Ramrakhiani et al. (2011)은 균사체 (fungal biomass)인 Termitomyces clypeatus를 6가 크롬 (Cr(IV))의 제거를 위한 흡착소재로 개발하였다. 흡착에 사용되는 흡착소재의 표면에 존재하 는 흡착작용기의 종류와 양은 타겟 오염물질에 대한 흡 착소재의 제거효율을 결정하는 중요한 요소 중 하나이다 (Won et al. 2013). 흡착작용기와 타겟 오염물질의 특성에 따라 이온교환 (ion-exchange), 정전기적 인력 (electrostatic interaction), 킬레이션 (chelation) 등 다양한 흡착 메커니 즘을 통하여 오염물질의 흡착/제거가 이루어진다. 따라 서, 수계 내 오염물질의 전하특성을 고려하여 흡착소재의 표면을 다양한 물리/화학적으로 개질 (modification)함으 로써 흡착성능을 개선할 수 있다 (Vijayaraghavan and Yun 2007;Akar et al. 2013). 특히, polyethylenimine (PEI)나 poly (acrylic acid) (PAA)와 같은 이온성 고분자를 사용한 경우, 이온성 오염물질에 대한 흡착성능 개선 효과가 탁월하다 고 보고되고 있다 (Deng and Ting 2005;Yan et al. 2012;Mao et al. 2013).
유해 미세조류, M. aeruginosa는 세포 표면에 카르복실기 (pKa=3.9), 인산기 (pKa=7.1), 그리고 아민기 (pKa=9.0) 를 가지고 있고, 이러한 작용기들의 pKa 특성으로 인하여 수중생태계에서 세포의 표면은 전체적으로 음전하를 띤다 고 보고되고 있다 (Hadjoudja et al. 2010). 음전하를 띠는 M. aeruginosa는 흡착소재가 가지고 있는 아민기와 같은 양전 하를 띠는 흡착작용기에 정전기적 인력으로 흡착될 수 있 다. 따라서, 이러한 가정을 기반으로 본 연구에서는 유해 미 세조류 M. aeruginosa 제거하기 위한 양이온성 흡착소재 개 발 및 이를 이용한 M. aeruginosa 제거 효율을 평가하였다. 흡착소재의 원료로서 아미노산 생산 공정에서 대량 발생 하고 있는 C. glutamicum을 사용하였다. 흡착과정 후 간단 하고 효과적인 흡착소재 분리, 회수를 위하여 C. glutamicum 바이오매스를 생체고분자인 알지네이트 (alginate)와 혼합 하여 섬유형태 (alginate/biomass composite fiber; AlgBF) 로 고형화하였다. 또한, 양이온성 작용기인 아민기를 다량 함유하고 있는 PEI를 소재 표면에 코팅하여 PEI-modified AlgBF (PEI-AlgBF)를 제조하여 M. aeruginosa의 제거효율 을 평가하였다.
재료 및 방법
1. 재료
본 연구에서 사용한 흡착소재의 원료인 바이오매스 폐기물 (C. glutamicum)은 아미노산 생산공정에서 발생 한 것으로 (주)대상 (Daesang Co., Gunsan, Korea)에서 사 멸처리 후 건조된 분말 형태로 제공받았다. 소재의 고정 화와 표면개질을 위해서, sodium alginate (Alg, >98%, Junsei Chemical Co., Japan, Japan), PEI (branched form, 50% in H2O, M.W.~750,000; Sigma-Aldrich, MO, USA), Glutaraldehyde (GA, 25 wt.%; Junsei Chemical Co., Japan), Calcium chloride (CaCl2; MP Biomedicals, CA, USA)를 사 용했다. 섬유형태의 흡착소재 제조에는 방사용 니들 (Taeha Co., Seoul, Korea)이 이용되었다. 자세한 제조방법은 “2.2 흡착소재의 제조”에서 설명하였다.
타겟 오염물질인 M. aeruginosa (M. aeruginosa KW) 균주 는 왕송저수지에서 동정된 것으로 한국생명공학연구원 (Korea Institute of Bioscience and Biotechnology; KRIBB)의 안치용 박사님이 분양해 준 것을 사용하였다. M. aeruginosa 배양에는 BG11 배지가 사용되었으며, 배지의 조성은 Table 1에 표시하였다.
2. 흡착소재의 제조
흡착소재를 제조하기 위하여 먼저 Alg을 증류수에 용 해시켜 3% wt의 Alg 용액을 준비하였다. 준비된 Alg 용액 에 분말 상태의 C. glutamicum 바이오매스 (<50 μm) 분말 을 혼합하여 Alg/biomass 혼합용액 (Alg : biomass=3 : 7 in suspension)을 제조하고 바이오매스가 균일하게 분산할 수 있도록 12시간 동안 교반하였다. 준비된 Alg/biomass 혼합 용액을 방사용 니들을 통해 3% w/v의 CaCl2 용액에 방사 하여 섬유형태의 AlgBF를 제조하였다. 제조된 AlgBF는 잔 류하고 있는 CaCl2 용액을 제거하기 위하여 증류수를 사용 하여 3회 세척하여 주었다. 세척이 완료된 AlgBF를 1 L의 PEI 용액 (2% w/v)에 넣고 6시간 동안 반응시켰다. PEI 개 질 후, AlgBF를 용액으로부터 분리하고 잔류하고 있는 PEI 용액을 제거하기 위하여 증류수를 사용하여 1회 세척하고 1 L의 GA 용액 (0.6 mL L-1)에 넣어주어 4시간 동안 가교반 응을 진행하였다. 가교반응이 완료된 후, PEI-AlgBF를 용액 과 분리하고 증류수를 사용하여 3회 세척해 주었다. 제조된 PEI-AlgBF는 24시간 동안 동결건조를 진행하였고 건조된 흡착소재는 실험이 진행되는 동안 데시케이터에 보관하여 사용하였다.
3. 흡착소재의 표면분석
제조된 AlgBF와 PEI-AlgBF의 표면 작용기특성을 Fourier transfer infrared spectrometer (FT-IR) (Cary 630 FT-IR, Agilent, USA)를 사용하여 분석하였다. FT-IR 분석은 650~ 4000 cm-1의 파장 영역에서 진행되었으며 Attenuated total reflectance (ATR) 방식을 사용하였다. M. aeruginosa의 처리 전과 후의 흡착소재 표면은 Field emission scanning electron microscope (FE-SEM)을 사용하여 관찰하였다. 동결건조 된 M. aeruginosa 처리 전·후의 PEI-AlgBF는 진공상태에서 60초간 백금코팅 (4 nm)을 진행한 후, FE-SEM (Quanta 250 FEG, FEI, USA)기기를 사용하여 소재의 표면을 관찰하였 다.
4. M. aeruginosa 흡착 제거 평가
흡착을 통한 M. aeruginosa의 제거 평가를 위하여 먼 저 BG11 배지에서 0.15 L min-1의 공기주입속도, 50 μmol m-2의 광량 및 25°C의 조건에서 M. aeruginosa를 배양하 였다. 우선 배양된 M. aeruginosa는 원심분리를 통하여 배 지에서 분리하여 주었다. 그 후, 150 mL 증류수와 혼합 하여 M. aeruginosa의 초기 세포밀도를 녹조 경계단계 ((50.0±5.7)×104 cells mL-1) 또는 대발생 단계 ((200.0± 11.9)×104 cells mL-1)로 조정해 주었다. 그 후, PEI-AlgBF 0.3 g을 M. aeruginosa 용액에 투입시켰으며 우선배양의 조 건과 동일한 공기주입속도, 광량 및 온도의 조건에서 배양 해 주었다. 흡착 제거 평가 시, 흡착소재를 넣지 않은 샘플 을 대조군 (control)으로 설정하였으며 정해진 시간 간격 으로 샘플링을 진행하여 용액 내 존재하는 M. aeruginosa 세포의 수를 hemacytometer를 이용하여 측정하였다. 모든 흡착 제거 평가는 3회 반복 실험을 진행하여 주었다.
결과 및 고찰
1. 흡착소재의 표면 작용기 특성
PEI를 사용하여 개질된 PEI-AlgBF의 표면 작용기 변화 를 관찰하기 위하여 AlgBF와 PEI-AlgBF의 FT-IR 분석결과 를 비교하였다. 650~1800 cm-1의 파장에서 보인 AlgBF와 PEI-AlgBF의 FT-IR 스펙트럼은 Fig. 1에 도시하였다. AlgBF 에서 보이는 1,031 cm-1에서 보이는 피크는 C-O stretch를 나타낸다 (Chung et al. 2004). 1,081 cm-1에서 볼 수 있는 peak는 흡착소재 내부에 혼합되어 있는 C. glutamicum의 표면에 존재하는 인산기에서 비롯된 P-OH stretching을 의 미한다 (Kim et al. 2015). 1,410과 1,617 cm-1 부근에서 보이 는 두개의 피크는 AlgBF에 존재하는 이온화된 카르복실기 (-COO-)를 뜻한다 (Chung et al. 2004). 동시에 1,540 cm-1 에서 발견할 수 있는 넓고 약한 IR 피크는 C-N stretching 에서 비롯된 것이다 (Choi and Yun 2006;Liu et al. 2009). PEI-AlgBF의 결과에서는 PEI로 개질된 흡착소재 표면과 관련된 IR 피크의 변화를 관찰할 수 있었다. 먼저 PEI 개 질 후, PEI-AlgBF의 IR 스펙트럼에서는 polyethylene 구조 의 CH2 scissoring vibration을 나타내는 1,451 cm-1 피크 의 강화를 발견할 수 있었다 (Zieba-Palus 2017). 또한, C-N stretching을 나타내는 1,541 cm-1 피크가 AlgBF에 비하여 증가하였다. 이러한 피크의 변화는 AlgBF의 표면이 PEI의 분자로 코팅이 되었다는 것을 의미할 수 있다. 또한, AlgBF 에서 보이던 1,617 cm-1의 피크가 1,632 cm-1로 이동함과 동시에 더욱 날카롭게 변하였다. 이는 GA 가교반응으로 인하여 생성된 이민기 (imine, =N-)를 나타내는 IR 피크 (1,650 cm-1)가 1,617 cm-1 부근의 피크와 겹쳐서 나타났기 때문으로 보인다 (Ghoul et al. 2003). 또한, PEI가 AlgBF의 표면에 개질될 때 AlgBF의 카르복실기와 PEI 분자의 아민 기가 서로 정전기적 인력에 의하여 결합됨에 따라 이온화 된 카르복실기 (-COO-)를 의미하는 1,601 cm-1 부근의 피 크의 감소되었기 때문일 것이다. 그 강도가 감소함과 동시 에 피크의 이동이 관찰된 1,405 cm-1의 피크 역시 이온화 된 카르복실기의 감소를 뜻한다. 본 FT-IR 결과를 통하여 PEI-AlgBF의 표면에 양이온성 고분자인 PEI가 잘 코팅되 어 있고 그에 따라 M. aeruginosa를 흡착할 수 있는 양이온 성 작용기인 아민기가 상대적으로 증가했음을 예상할 수 있다. 실제 PEI-AlgBF의 M. aeruginosa에 대한 제거 효과를 확인하기 위하여 PEI-AlgBF와 함께 M. aeruginosa 배양하 면서 흡착성능을 평가해 보았다.
2. 흡착소재를 이용한 M. aeruginosa 제거 효과
녹조현상 발생 시 우점종인 M. aeruginosa와 같은 남조 류의 농도에 따라 녹조 경보 단계를 달리하고 있다. 이러 한 녹조 발생 단계에 따라 흡착소재의 적용 가능성을 평가 하기 위하여 다른 녹조 발생 단계 (경계와 대발생 단계)에 해당하는 M. aeruginosa 세포양이 존재하는 조건에서 PEIAlgBF의 M. aeruginosa 제어 가능성을 평가하였다. Fig. 2 는 50×104 cells mL-1 (경계단계)와 200×104 cells mL-1 (대 발생 단계)의 조건에서 얻어진 M. aeruginosa의 세포 수 의 변화를 관찰한 결과이다. 흡착소재를 적용하지 않은 control 샘플의 경우, 24시간 동안 초기 M. aeruginosa의 세 포 수를 유지하거나 오히려 증가하는 경향을 보였다. 하 지만, PEI-AlgBF를 적용한 경우, 모든 녹조 발생 단계 조 건에서 M. aeruginosa 세포 수의 감소를 관찰할 수 있었다. 경계단계의 경우, PEI-AlgBF를 적용한 지 24시간 이후의 M. aeruginosa의 세포 수는 (18±3.58)×104 cells mL-1로 초 기농도 대비 67.3%의 M. aeruginosa 세포의 감소율을 보였 다. 대발생 단계에 적용한 경우에는 24시간 이후 52.25% 의 M. aeruginosa를 PEI-AlgBF로 제거할 수 있었다. 이러 한 PEI-AlgBF의 M. aeruginosa가 제거는 음전하를 띠는 M. aeruginosa와 PEI-AlgBF가 가지는 양이온성 작용기인 아민 기와 정전기적 인력으로 인한 것으로 보인다. FT-IR 분석 결과에서 양이온성 작용기인 아민기를 다량함유하고 있 는 PEI 분자가 PEI-AlgBF에 코팅되어 있다는 사실을 알았 다. M. aeruginosa의 흡착이 이루어지는 샘플의 pH는 6~6.4 로 M. aeruginosa의 표면에 존재하는 카르복실기 또는 하이 드록실기는 그들의 pKa 특성에 따라 탈수소화반응을 거쳐 음이온화 되기 때문에, M. aeruginosa 세포 표면은 전체적으 로 음전하를 띠게 된다. 반면, PEI-AlgBF에 코팅된 양이온 성 고분자인 PEI는 1차, 2차, 그리고 3차 아민기를 가지고 있고 그 pKa 값은 각각 4.6, 6.7, 그리고 11.6으로 보고되고 있다 (Willner et al. 1993). 따라서, 흡착이 이루어지는 pH 조건에서 일부 아민기가 양이온을 잃을 수 있지만 여전히 양전하를 띠고 있기 때문에, 음전하를 띠는 M. aeruginosa 세포를 정전기적 인력으로 흡착소재 표면에 흡착시킬 수 있는 것으로 보인다. PEI를 표면에 코팅한 흡착소재를 사 용한 기존 연구결과 (Kim et al. 2018)에서도 본 연구에서 얻은 결과와 비슷한 M. aeruginosa의 감소경향을 보인 바 있으며 이 경우도 M. aeruginosa와 소재표면에 코팅된 PEI 가 제공한 양전하를 띠는 아민기 사이의 정전기적 인력을 주요 흡착기작으로 설명하고 있다.
또한, M. aeruginosa를 흡착한 후의 PEI-AlgBF의 FE-SEM 관찰결과 (Fig. 3)를 살펴보면 흡착소재 표면에 흡착된 구 형의 M. aeruginosa 세포를 관찰할 수 있었다. 이러한 결과 는 PEI-AlgBF를 사용한 M. aeruginosa의 제거과정에서 세 포의 파괴가 유발되지 않는다는 것을 의미하며 이는 곧 M. aeruginosa의 제거과정에서 조류독성물질의 배출이 일어 나지 않는다는 것을 의미할 수 있다.
3. M. aeruginosa 제거에 대한 흡착소재 표면적의 영향
본 연구에서 제조한 섬유형태의 흡착소재는 방사 니들 의 조건에 따라서 소재의 두께를 조절할 수 있다. Table 2에 서 명시한 바와 같이 방사구의 내부 지름의 차이에 따라 제 조된 PEI-AlgBF는 다른 두께를 가지는 것을 확인할 수 있 었다. PEI-AlgBF의 두께는 18 G>20 G>22 G>25 G의 니 들 조건 순서에 따라 감소하였다. 각 소재의 표면적을 비교 하기 위하여 모든 소재가 동일한 부피를 갖는다고 가정하 였고 현미경 관찰을 통하여 얻어진 각 PEI-AlgBF의 두께를 고려하여 다음의 원통의 부피식을 통하여 각 소재가 가질 수 있는 소재의 길이 (L)와 표면적 (S)를 계산하였다.
여기서 V는 임의로 결정된 소재의 부피로 본 연구에서 는 1 mm3로 설정하였다. r은 각 소재가 가지는 반지름이다 (mm). 위 식을 사용하여 계산된 소재의 길이는 3.65 mm (18 G), 6.55 mm (20 G), 12.05 mm (22 G), 그리고 310.85 mm (25 G)이며 흡착소재가 가지는 표면적은 각각 7.32 mm2 (18 G), 9.38 mm2 (20 G), 12.47 mm2 (22 G), 그리고 62.51 mm2 (25 G)로 계산되었다. 소재의 두께가 얇을수록 소재의 길이와 표면적이 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 소재의 표면적이 증가할수록 M. aeruginosa의 제거 효과도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Fig. 4는 소 재의 표면적에 따라 M. aeruginosa의 제거 효과를 비교한 결과를 도시한 것이다. 소재의 표면적이 가장 낮은 18 G 니 들 조건에서 제조된 PEI-AlgBF는 흡착소재 적용 후 24시 간이 경과했음에도 불구하고 초기 세포 수 대비 16.6%의 감소율만 보였으며 표면적이 가장 넓은 25 G의 니들을 사 용하여 제조된 PEI-AlgBF는 같은 처리 시간 동안 18 G와 대비하여 3.3배 높은 M. aeruginosa 제거율 (55.5%)을 기록 했으며 두 결과에 대한 p 값은 0.01이었다. 이는 소재의 표 면적이 넓을수록 PEI로 개질되는 흡착소재의 면적이 증가 하여 두꺼운 소재에 비하여 더 높은 양전하를 띨 수 있기 때문으로 보인다. 이와 마찬가지 관점으로, 넓은 표면적을 가지는 소재는 음전하를 띠는 M. aeruginosa 세포와 반응할 수 있는 확률이 높아지기 때문에 보다 제거 효율이 높은 것으로 판단되어진다.
적 요
본 연구에서는 바이오매스 폐기물인 Corynebacterium glutamium을 Alg를 이용한 고정화와 PEI 표면개질 과정을 통하여 유해 미세조류인 Microcystis aeruginosa를 제거할 수 있는 흡착소재인 PEI-AlgBF를 개발하였다. 녹조의 발생단 계에 상관없이 PEI-AlgBF는 수계로부터 M. aeruginosa를 성공적으로 제거할 수 있었으며 유해조류 제거과정에서 M. aeruginosa 세포의 파괴를 유발하지 않았다. 흡착소재의 표면적은 M. aeruginosa의 제거효율에 매우 큰 영향을 주 는 주요인자로 확인할 수 있었다. PEI-AlgBF를 사용한 M. aeruginosa 흡착/제거 방식은 기존 기술에 비하여 환경영 향성이 낮기 때문에 보다 안전하고 안정적인 유해조류의 제어 방식이 될 것이다.