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서 론
아질산은 수중생물의 질소대사과정 후 배설물에 의해 발생되는 암모니아에 의해 생성되는 중간산물이다. 일반 적인 자연 환경 내에서 아질산은 산소가 충분한 경우 아질 산 산화세균에 의해 질산으로 산화되고, 수중 생물에게 영 향을 미치지 않는다 ( Jung et al. 2016;Lee et al. 2017). 하지 만, 아질산은 일부 고밀도로 양성되고 있는 양식장이나, 사 육수의 교환이 거의 없는 순환여과식이나 바이오플락과 같은 폐쇄식 시스템에서는 초기 질산화 사이클이 안정되 기 전까지는 단기간에 높은 수준의 농도로 존재할 수 있다 (Kim et al. 2018).
어류에서 높은 수준의 아질산 노출은 혈액, 아가미, 간, 뇌 및 근육조직에서의 아질산 축적을 유발할 수 있으며, 이는 산-염기 조절, 가스교환 및 배설 기능을 감소시킨다 ( Jia et al. 2016). 아질산 이온 (NO2-)은 염화물 이온 (Cl-) 을 대신하여 혈장의 젖산염, 질산염 및 중탄산염의 증가를 유도하여 아가미의 이온교환에도 영향을 미친다 (Jensen 2003). 또한 만성적인 아질산 노출은 어류의 산소-결합-기 능장애뿐만 아니라, 상피세포 비대, 괴사 및 과형성과 같 은 다양한 생리기능장애를 유발하여 독성으로 작용한다 (Kroupova et al. 2010).
혈액학적 성상의 변화는 다양한 스트레스 요인에 노 출된 생물의 건강상태를 확인하기 위한 지표 중 하나이 다 (Kim et al. 2017). 아질산 노출은 어류의 Cl- 흡수 메커 니즘을 통해 혈액에 축적되고 적혈구로 유입되어, 혈중 hemoglobin (Hb)를 met-hemoglobin (Met-Hb)으로 전환시 켜 산소 운반 능력의 상실로 인한 저산소증 및 질식을 유 발한다 (Tilak et al. 2007). 혈중 Met-Hb의 증가는 저산소 증에 의한 골수 및 조혈 세포의 손상을 유발하고, 이는 혈 액 성상인 Hb와 hematocrit (Hct)의 감소를 유발한다 (Das et al. 2004b). 따라서 혈액 성상의 변화는 아질산의 생리적 독성을 평가하기 위한 주요한 지표가 될 것이다.
대왕범바리는 대왕바리 (Epinephelus lanceolatus) 수컷 과 범바리 (E. fuscoguttatus) 암컷의 교잡종이며 대왕바리 의 성장속도, 범바리의 내병성이라는 두 종 간의 장점을 고루 갖춘 바리과 품종으로써 주목을 받고 있다 (Sun et al. 2016). 바리과 어종은 아열대성 어종이며, 고수온에 대 한 적응력이 25~35°C로 높다 (De et al. 2016). 수온은 변 온동물인 어류를 비롯한 양식 대상 수중동물들에게 신진 대사작용을 증감시킴으로써 생존과 성장에 큰 영향을 주 는 요인이다 (Cheng et al. 2017). 또한 수온은 다른 스트레 스 요인에도 영향을 미치는데, 수온이 증가함에 따른 대 사활동의 증가로 아질산 독성이 더욱 높아진다는 결과가 common carp, Cyprinus carpio 및 Astacus asctacus, European crayfish에서 나타난 바 있다 ( Jeberg et al. 1994;Kroupova et al. 2006). 우리나라는 온난화현상으로 인해 해수온은 꾸 준히 상승하고 있으며 (Kim et al. 2018), 여름철 일부 해역 의 수온은 28~30°C에 이르러 고수온 주의보 및 경보가 발 령되는 경우가 잦아지고 있다 (KMA 2018;Yoo et al. 2018). 국내 주력 양식 대상종 넙치와 조피볼락의 적정수온은 20~25°C이며 (Kim et al. 2001), 최근 고수온기 대량폐사와 같은 피해가 발생하여, 양식어가에서는 고수온기 대체 품 종 요구가 높아지고 있다. 대왕범바리의 높은 고수온 내성 한계는 여름철 대체품종으로써 높은 가능성을 보여준다. 그러나 고수온에서 더욱 치명적일 수 있는 아질산에 대한 대왕범바리의 노출실험 결과는 거의 없다. 따라서 본 연구 의 목적은 대체 품종인 대왕범바리에 대한 아질산 급성 노 출에 따른 반수치사농도, 혈액 성상 및 혈장 성분의 변화 를 통해, 아질산 내성 한계 및 기준을 적립하는 데 있다.
재료 및 방법
1. 실험어 및 실험환경
본 실험에 이용된 대왕범바리 (평균 무게 27.3±3.8 g; 평 균 전장 11.6±0.7 cm)는 경남고성의 종묘생산장에서 분양 받아 실험에 이용하였다. 실험은 사육해수에서 10일간 순 치 후 실시하였다. 실험은 100 L 원형수조를 이용하였으며, 수조당 6마리 6개 농도구간 총 36마리를 입식 하여 진행 하였다. 실험 기간 중 수질 (수온, 용존산소, 염분, pH)은 휴 대용 수질 분석기 (YSI-Professnal plus, YSI Inc., USA)를 이 용하여 매일 측정하였다 (Table 1). 아질산노출은 NaNO2 (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 표준원 액 40,000 mg L-1를 만들어, 각 수조별 0, 100, 200, 400, 800, 1600 mg L-1의 농도로 96시간 노출실험을 진행하였다. 각 노출 실험 수조의 실제 아질산 농도는 아질산 분석용 키트 (Merck & Co., Inc., USA)를 이용하여 측정하였다 (Table 2). 노출 96시간 후 살아있는 개체의 혈액을 sampling하여 분 석하였다.
2. 혈액학적 성상
혈액학적 분석은 아질산 노출 96시간 후 살아있는 개 체를 MS-222 (Sigma Aldrich, USA)를 150 mg L-1의 농 도로 용해한 사육수에 60초간 마취시킨 후 채혈을 실시 하고 이를 이용하였다. 채혈은 헤파린 (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) 처리된 주사기를 하였으며, 채혈직 후 적혈구용적 (Hematocrit)과 헤모글로빈 (Hemoglobin) 을 측정하였다. Hematocrit는 모세관 내로 혈액을 넣어, Microhematocrit centrifuge (VS-12000, Korea)에서 12,000 rpm, 10분간 원심분리 후 Micro-hematocrit reader를 이 용하여 측정하였다. Hemoglobin 수치는 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd, Korea)를 이용하여 Cyan-methemoglobin 법으로 측정하였다.
3. 혈장성분 분석
아질산 노출에 따른 혈장성분의 변화를 분석하기 위 해 채취한 혈액을 4°C에서 3000 rpm으로 15분간 원심분 리 후 혈장을 분리하였다. 혈장 무기성분으로 마그네슘 (Magnesium)을 측정하였다. 마그네슘은 Xylidyl blue-I 법 에 따라 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd, Korea)를 이용하 여 515 nm에서 흡광광도기를 통해 측정하였다. 혈장 유기 성분으로 혈당 (Glucose), 콜레스테롤 (Cholesterol) 및 총 단백질 (Total protein)을 측정하였다. 혈당은 GOD/POD 법을 통해 500 nm에서 측정, 콜레스테롤은 비색법을 통 해 500 nm에서 측정하였다. 총 단백질은 Biuret법에 의해 시판되고 있는 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd, Korea) 를 이용하여 540 nm에서 측정하였으며, 혈장 효소활성으 로 GPT (glutamic pyruvate transaminase) 및 ALP (Alkaline phosphatase)를 측정하였다. GPT 및 ALP는 King-King법 을 이용한 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd, Korea)로 분석 후 각각 505, 500 nm에서 측정하였다. 사용한 흡광광도기 는 Spectramax i3 (Molecular device, USA)를 통해 분석을 실시하였다.
4. 통계분석 방법
독성실험을 위한 반수치사농도는 probit 모델을 이용하 여 SPSS 통계 프로그램 (SPSS Inc.)으로 확인하였다. 본 실 험분석은 노출물질별 농도에 따른 각 6마리를 분석에 이 용하였고, 모든 실험은 3반복으로 이루어졌다. 실험 분 석 결과에 대한 통계학적 유의성은 SPSS 통계 프로그램 (SPSS Inc.)을 이용하여 ANOVA test를 실시하여 Tukey’s multiple range test를 통해 p<0.05일 때 유의성이 있는 것 으로 간주하였다.
결 과
1. 혈액학적 성상
아질산 96시간 노출에 의한 대왕범바리 혈액성상의 변 화는 Fig. 1에 나타내었다. 아질산 노출에 의한 대왕범바리 hematocrit 수치는 아질산 노출 100 mg L-1 이상의 농도에 서 유의적 감소를 나타내었다 (p<0.05). Hemoglobin 농도 는 아질산 노출 400 mg L-1 이상의 농도에서 유의적 감소 를 나타내었다 (p<0.05).
2. 혈장성분
아질산 노출에 따른 대왕범바리의 혈장성분의 변화는 Fig. 2에 나타내었다. 아질산 노출에 의한 대왕범바리 혈 장 magnesium의 유의적 변화는 나타나지 않았다. 혈장 glucose는 아질산 노출 200과 400 mg L-1의 노출에 의해 유 의적 증가를 나타내었다 (p<0.05). 하지만, 더 높은 아질 산 농도인 800 mg L-1에서는 다시 감소를 나타내었다. 혈 장 cholesterol은 아질산 노출 400 mg L-1 이상의 농도에서 유의적 감소를 나타내었다 (p<0.05). 혈장 total protein의 경유 아질산 노출에 의한 유의적 변화는 나타나지 않았 다. 혈장 GPT는 아질산 노출 200과 400 mg L-1에 의해 유 의적 증가를 나타내었지만 (p<0.05), 더 높은 농도인 800 mg L-1에서는 다시 감소를 나타내었다. 혈장 ALP는 아 질산 노출 800 mg L-1에 의해 유의적 증가를 나타내었다 (p<0.05).
고 찰
아질산 노출은 수중 생물의 혈액에 유입되어 Met-Hb 혈 증을 유발하고, 혈액학적 성상의 변화를 유발한다 (Jensen 2003). 아질산 노출은 olive flounder, Paralichthys olivaceus (Kim et al. 2018)와 common carp, C. Carpio (Jensen and Knudsen 1997)의 혈액 Hct 및 Hb 유의적 감소를 유발하였 다. 본 연구에서 아질산 노출은 대왕범바리의 Hct 수치 및 Hb 농도를 유의적으로 감소시켰으며, 이는 아질산 노출에 따른 적혈구 용해 및 사멸에 의한 조혈 세포의 손상으로 판단된다.
혈장 성분 중 주요 이온의 변화는 체내 이온 교란을 판단하는 주요한 지표이며, 삼투 조절 장애를 유발한다 (Medeiros et al. 2016). 혈장 magnesium은 어류 체내 이 온 균형 유지를 위해 필수적인 요소이며, 독성 노출에 의 한 생리적 변화를 판단하는 주요한 지표이다 (Bijvelds et al. 1998). 본 실험에서 아질산 노출에 대한 대왕범바 리의 혈장 마그네슘은 유의미한 변화를 보이지 않았 다. 하지만, Chen and Lee (1997)는 아질산 노출에 의 한 giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, 혈액 magnesium이 2 mg L-1에서는 유의미한 변화가 없었으나, 5 mg L-1 이상에서 유의적 감소를 보고했으며, Stormer et al. (1996) 역시 아질산 노출이 rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, 0.2 mg L-1의 아급성 아질산 노출에서는 유의적 변 화가 없었으나, 1 mg L-1 급성 아질산 노출에서 magnesium 의 유의적 증가를 보고했다. 아질산 노출에 의한 영향은 실험조건과 생물 종에 따른 차이가 크며 (Das et al. 2004c), 본 실험에서 적용한 아질산 농도가 대왕범바리에게 영향 을 미치지 못하는 수준의 농도로 판단된다.
혈장 glucose는 어류 스트레스 반응을 평가하는 주 요 지표이다. 어류는 스트레스 상황에서 간과 근육에서 glycogen 생성을 통해 대사에너지를 확보하고, glycogen 은 부신 조직으로부터 생성된 glucocorticoids와 catchecolamines에 의해 glucose로 전환되어, hyperglycemia를 유발 한다 (Sachar et al. 2014). Das et al. (2004c)는 아질산 노출 이 mrigal carp, Cirrhinus mrigala의 혈장 glucose를 유의적 으로 증가시킨다고 보고했다. 본 실험에서 대왕범바리의 혈장 glucose는 아질산 노출에 의해 유의적 증가했다. 하 지만, 아질산 800 mg L-1의 농도에서는 다시 감소를 나타 내었다. 이러한 변화는 초기 glycogen 분해에 따른 증가에 의해 상승하였으나, 농도와 노출 기간에 따른 탄수화물의 과도한 소진으로 인해 다시 감소로 이어진 것으로 판단된 다. 이와 같은 glucose 증가 후 감소는 초기 경보, 저항, 그 리고 고갈, 소진의 3단계 스트레스 단계 반응을 통해 입증 된 바 있으며, 질산염에 노출된 Hybrid striped bass, Morone saxatilis ♀×M. chrysops ♂이 스트레스로 인한 소진으로 glucose 및 cortisol 감소된 바를 보고하였으며 (Hrubec et al. 1996), Ahn et al. (2013) 역시 크롬 노출에 의한 Flathead grey mullet, Mugil cephalus 체내 glucose의 유의적 증가 후 감소를 보고한 바 있다.
혈장 cholesterol은 세포막의 필수 구조 성분이며, 모든 스테로이드 호르몬의 전구체이다 (Firat and Kargin 2010). 혈장 cholesterol은 스트레스 요인에 의해 간과 신장기 능에 영향을 주어 혈액으로 방출되며, 스트레스 지표로 이용된다 (Oner et al. 2008). 환경 스트레스 요인인 아연 (Zn)과 구리 (Cu) 노출은 Nile tilapia, Oreochromis niloticus 의 cholesterol를 유의적으로 감소시키며 (Firat and Kargin 2010), 유기인계 물질인 monocrotophos의 노출 또한 spotted snakehead, Channa punctatus의 cholesterol을 유의적으 로 감소시킨다고 보고되었다 (Agrahari et al. 2007). 본 실험 에서 대왕범바리의 cholesterol은 아질산 노출에 의해 유의 적 감소를 나타내었으며, 이는 독성스트레스에 의한 세포 의 손상이 esterified cholesterol이 free cholesterol으로 전환 되는 것을 억제한 것으로 판단된다.
혈장 total protein (Tp)는 세포의 주 구성물질이자 에 너지원 생성 등 신진대사에 중요한 역할을 하며, 독성 노 출에 의한 신진대사 장애 등의 영향으로 변화될 수 있다 (David et al. 2004;Kim et al. 2019). Das et al. (2004c)은 아 질산 노출에 의해 mrigal carp, C. Mrigala의 total protein이 유의적으로 감소한다고 보고했다. 하지만, 본 실험에서 대 왕범바리의 혈장 total protein은 아질산 노출에 의한 유 의적 변화는 나타나지 않았다. Red-tailed Brycon, Brycon cephalus를 0.6 mg L-1 아질산에 노출시킨 결과 유의적 변 화는 보이지 않았다 (Avilez et al. 2004). Barramundi, Lates calcarifer는 30~50 mg L-1의 아질산 농도에서는 혈장 total protein의 유의미한 변화가 없었으나, 80 mg L-1 농도에 서는 유의미하게 감소하는 경향을 확인했다 (Woo et al. 1997).
혈장 GPT (glutamic pyruvate transaminase)는 탄수화 물과 단백질의 상호 전환에서 아미노기 (amino group) 를 alpha-keto acids으로, aspartic acid을 α-ketoglutaric acid 로 이동시키는 촉매 작용을 하며, 독성 노출에 따른 어류 의 건강 상태와 간 손상 평가지표로써 사용된다 (Ramesh et al. 2018). 본 실험에서 대왕범바리의 혈장 GPT는 아 질산 노출 200과 400 mg L-1에 의해 유의적 증가를 나타 내었지만, 800 mg L-1의 농도에서는 감소를 나타내었다. Malarvizhi et al. (2012)은 common carp, C. Carpio, GPT는 Carbamazepine 노출에 의해 유의적으로 증가하였으며, 더 높은 농도에서 오히려 감소함을 보고했으며, Le Ruyet et al. (1998) 역시 암모니아 노출에 의한 Turbot, Scophthalmus maximus 및 Gilthead seabream, Sparus aurata의 유의적 증 가와 더 높은 농도에서 감소를 보고했다. 아질산의 체내 축적은 간 세포 손상을 유발하여 GPT 효소의 분비를 증가 시켰을 것으로 판단되며, 더 높은 농도에서의 감소는 한계 이상의 농도에서 효소 및 세포 교란 및 파괴로 인한 활성 의 감소로 판단된다 (Sathya et al. 2012).
혈장 ALP (Alkaline phosphatase)는 어류의 골격 형성 및 세포막 수송 활동에 관여하며, 어류의 정상적 대사기 능여부를 확인하는 수단으로 사용되고 있다 (Molina et al. 2005). Das et al. (2004c)는 아질산 노출에 의한 Cypriniformes 3종 (Indian Carp, Catla catla; Rohu, Labeo rohita; Mrigal carp, C. mrigala) ALP의 유의적 증가를 보고했다. 본 실험에서 아질산 노출은 대왕범바리 혈장 ALP의 유의적 증가를 유발했으며, 이와 같은 결과는 세포막 투과성 증가 에 의한 아질산 증가로 간과 신장의 손상에 의한 것으로 판단된다 (Kavitha et al. 2012).
적 요
본 실험에서 아질산 급성노출은 대왕범바리의 혈액학 적 성상 및 혈장성분에 유의적 변화를 나타내었다. 혈액학 적 성상인 Hct와 Hb는 아질산 노출에 의한 유의적 감소를 확인하였다. 혈장 성분인 glucose, cholesterol, GPT 및 ALP 는 아질산 노출에 의해 유의적으로 변화를 나타냄을 확인 하였다. 본 실험의 결과 아질산 노출 100 mg L-1 이상의 농 도는 대왕범바리의 혈액 성상 및 혈장 성분의 유의적 영향 을 미치며, 800 mg L-1의 아질산 급성 노출은 대량 폐사를 유발할 수 있으나, 기존 국내 양식 대상종인 Olive flounder, P. Olivaceus는 171.043 mg L-1 (Kim et al. 2018), Yellow tail, Seriola quinqueradiata는 147 mg L-1 (Sugiyama et al. 1991) 에 비해 상대적으로 높은 값을 보여 아질산 내성이 상대적 으로 강함을 확인할 수 있었다.
