서 론

전복 (abalone)은 연체동물, 복족류, 원시복족목, 전복과 에 속하는 패류로 우리나라에서 널리 식용되는 산업적 가 치가 있는 중요한 수산생물이다. 우리나라에 서식하는 주 요 전복은 참전복 (북방전복, Haliotis discus hannai), 말전복 (H. gigantea), 까막전복 (H. discus), 시볼트전복 (H. sieboldii), 오분자기 (H. diversicolor aquatilis) 및 둥근전복 (H. discus) 등 6종이 있는바, 시중에 유통되고 있는 전복의 대부분은 양식산 참전복이다 (Kim et al. 2017;Cho et al. 2018).

이러한 전복류 (Haliotis spp.)의 세계 양식 총생산량은 2000년에는 2,540톤에 불과하였으나, 2015년에는 139,594 톤으로 약 55배 증가하였으며 (FAO 2017), 2016년 국내 전복류 양식 생산량은 약 12,000톤으로서 이러한 국내·외 전복 양식 생산량의 증가 추세는 앞으로도 지속될 것으로 예상되고 있기 때문에, 전복을 대상으로 한 다양한 연구가 수행되고 있다 (NFFC 2000;Kim et al. 2017).

유동세포분석기 (flowcytometry)는 유액 상태의 패류 세 포 집단을 대상으로 세포 크기, 세포 내부 조성 정도, 세포 주기 분석 및 세포기능 인지 등과 같은 한 세포가 갖는 여 러 특징을 분석 가능하다 (Vanparys et al. 2006). 이러한 유 동세포분석은 이매패류에서 혈구세포 집단의 분리나 확 인으로부터 이매패류의 면역학과 병리학 연구 분야로 그 영역이 확대되고 있으며, DNA 함량과 세포주기 측정은 유 동세포분석의 주요 기능이 되고 있다 (Ashton-Alcox et al. 2001;Da Silva et al. 2004;Park 2019, 2020a, 2020b). 최근 기기 발전, 환산방법 개선과 향상된 시약기능 등으로 유동 세포분석기는 DNA 함량 분석에 그 사용 효과의 장래성을 보이고 있다 (Estevam et al. 2011;Park 2019).

본 연구는 이러한 유동세포분석에 의해서 DNA 함량 조 사는 패류 진화의 유전적 기작을 예측하게끔 하여 종분화 를 파악할 수 있다는 관점의 일환으로, 신속한 DNA 함량 파악을 위하여 참전복의 미고정 (nonfixation)된 아가미, 근 육 및 외투막 조직을 사용하여 참전복의 DNA 함량을 조 사하였으며, 아울러 DNA 함량 조사에 사용된 참전복 조직 들을 대상으로 참전복 DNA 함량 조사에 적절하고 효과적 인 조직을 구명하고자 조직학적 조사를 실시하였다.

재료 및 방법

본 연구에 사용된 참전복 (H. discus hannai)은 2019년 5 월에 부산광역시 (한국)의 수산시장에서 구입하였으며, 한 국해양대학교 수산유전육종학 사육실 (한국)에서 3개의 100 L 사각수조에 수조당 각 50마리씩 수용 후, 20°C 수온 에서 공기공급하며 사육하였다. 실험에 사용된 참전복의 평균 각장은 13.7±0.26 cm, 평균 각폭은 7.2±0.48 cm, 평 균 무게는 220.1±13.9 g이었다.

무작위로 표본된 30마리의 전복을 20°C의 수온에 서 200 ppm의 염산리도카인 (Chinwhoa chemical Co, Korea)/1,000 ppm NaHCO₃ (Sigma, USA)로 마취하였다. 마취된 각 전복 표본으로 부터 아가미, 근육 및 외투막조직 을 추출하여 petri dish에서 면도날로 세절하였다. 세절된 각 조직에 200 μL의 extraction buffer (Cystain UV Precise T Kit; Partec, Görlitz, Germany)을 첨가 후 핵막을 제거하 기 위하여 30초간 pipetting하였다. 연속으로 30 μm 여과 주사기로 여과 후 각 표본들을 시험관에 수집하였다. 수집 된 각 세포들은 Cystain UV Precise T Kit (Partec, Görlitz, Germany)를 사용하여 상온에서 15분간 염색하였다. 상 대적인 DNA 함량을 측정하기 위하여 각 조직세포들을 Park (2019, 2020a, 2020b)의 방법에 의거 유동세포분석 기 (Partec PA-II flowcytometry, Germany)를 사용하여 분 석하였다. DNA 함량이 2.8 pg DNA nucleus^-1인 미꾸라지 (Misgurnus mizolepis) 적혈구를 standard reference로 사용 하였다 (Park et al. 1999).

전복 각 조직세포들의 DNA 함량을 분석하였으며, 전복 DNA 함량 분석에 안정적이고 적절한 조직 파악을 위하 여 본 연구에 사용된 전복 아가미조직을 대상으로 조직학 적 연구를 실시하였다. 전복 아가미조직을 추출 후 10% 중 성포르말린용액 (100 mL formalin, 6.5 g Na₂HPO₄·12H₂O, 4.5 g KH₂PO₄ and 900 mL DW: Sigma, USA)으로 24시간 고정하였다. 고정된 전복 아가미조직은 기존의 조직학적 방법에 의거 ethanol (Sigma, USA)로 탈수, xylene (Sigma, USA)으로 투명화시켰고 paraffine으로 포매하였다. 이후 전복 아가미조직 표본은 6 μm로 연속절편하여 Mayer’s hematoxyline과 eosin Y-phloxine B로 염색하여 생물현미경 (Carl Zeiss, Jena, Germany) 하에서 관찰하고 사진촬영 하 였다. 각 실험에 사용된 전복 개체수는 30마리였으며, 전 체 3반복 실험을 실시하였고, SPSS (SPSS 9.0, SPSS Inc., Chicago, lL, USA)로 Student’s t-test (p<0.05)를 실시하여 유의성 검정을 하였다.

결과 및 고찰

Figure 1의 대표적인 diagram에 나타난 바와 같이 참전 복 (H. discus hannai)의 flowcytometry channel의 수는 아가 미는 68 (Fig. 1a), 근육은 83 (Fig. 1b), 외투막은 84 (Fig. 1c) 그리고 standard reference인 미꾸라지 (M. mizolepis)는 74 (Fig. 1d) 이었다. 3 반복 실험한 각 조직의 DNA diagram 결과를 대상으로 standard reference로 사용한 미꾸라지 DNA 함량인 2.81 pg nucleus^-1 (Park et al. 1999) 기준한 상 대 DNA 함량으로 계산한 결과는 Table 1과 같다. 계산된 참전복의 각 조직에서의 DNA 함량은 아가미가 2.5±0.08 pg nucleus^-1, 근육이 3.2±0.02 pg nucleus^-1 그리고 외투막 이 3.2±0.02 pg nucleus^-1이었다 (Table 1). 참전복의 DNA 함량에 있어 근육과 외투막은 3.2±0.02 pg nucleus^-1로 동 일한 반면, 아가미는 유의하게 낮았다 (p<0.05). An et al. (2007)이 보고한 부화 후 4년생 전복의 고정된 외투막 DNA 함량 (3.36 pg nucleus^-1)과 비교 시, 본 연구 결과는 참전복의 DNA 함량에 있어 유사한 결과치를 보여주고 있 다.

Hinegardner (1974)는 더욱 일반화된 연체동물은 더 욱 특화된 종보다 높은 DNA 함량을 가진다고 하였으나 González-Tizón et al. (2000)은 이러한 가정은 보편성이 없 다고 하였다. 패류를 대상으로 한 종간 분류 및 배수화 판 별 시 3가지 영역의 기법이 대체적으로 사용되는 바, 첫 째는 coulter counter로 적혈구 핵 크기 판별 (Thorgaard et al. 1982), 둘째는 생물현미경 하에서의 염색체 조사나 적 혈구 핵 크기 판별 (Wolters et al. 1982), 셋째는 초 당 100 개 이상의 세포들을 연속적으로 분석하여 다양한 변이 (즉, 형태와 세포 활성)를 측정할 수 있는 유동세포분석 법 (Estevam et al. 2011;Park 2019, 2020a, 2020b)이 있다. Coulter counter로의 적혈구 핵 크기 판별이나 생물현미경 으로의 적혈구 핵 크기, 염색체 조사 (비록 수산생물 유생 시기에 chopping method로 염색체 제작이 있을 수 있으 나, 염색체 결과 도출에서 성체시기에서의 신장조직으로 부터의 염색체 제작에 비해 어려움이 있음)에 비하여 유 동세포분석법은 수산생물 유생조직으로 부터도 신속하고 정확하게 DNA 함량을 분석할 수 있어, 실험적 연구나 부 화장에서 종묘생산에 월등하고 우수한 도움을 줄 수 있을 것이다. 이전의 연구들 (An et al. 2007;Jee and Chang 2012) 인 경우, 참전복 DNA 함량 측정시 최소 4~24시간이 소 요된 바와 비교 시 본 연구에서는 비교적 짧은 시간인 최 대 30분 이내에 DNA 함량 측정이 가능하고 DNA 함량 측 정에서 유동세포분석으로 인하여 더욱 정확함이 도출되 었다.

참전복의 아가미조직을 조직학적으로 조사한 결과 (Fig. 2), 여타의 protobranch 종과 마찬가지로 참전복은 bipectinate 아가미로서 gill filament에 잘 발달된 cilia와 microvilli가 확인되었다 (Fig. 2a). Gill filament의 상피층은 단순한 입방상피세포들과 점액세포들로 구성되었으며, 원 생생물들이 다수 관찰되었다 (Fig. 2b), 본 연구 결과 참전 복 DNA 함량에서 아가미조직이 근육조직 및 외투막조직 에 비하여 낮은 원인은, Fig. 2에서 보는 바와 같은 점액세 포 내에 존재하는 다수의 원생생물에 의해 DNA 함량 측 정에 영향을 받은 것으로 판단된다. 고정 (fixation) 과정 을 거치지 않은 참전복 아가미조직과 외투막조직의 DNA 함량을 조사한 본 연구 결과를 아가미조직과 외투막조직 에서 동일한 DNA 함량을 보인 고정 과정을 거친 An et al. (2009)의 보고와 비교 시, 본 연구에서는 미고정으로 인해 원생생물에 오염된 아가미는 정확한 전복 DNA 함량 측정 이 불가 하였다는 것으로 사료된다. 미고정에 의한 참전복 조직에서의 유동세포분석법은 참전복의 일부 조직만 사 용하므로 참전복 초기 유생에서도 DNA 함량 측정이 가능 함과 더불어 미고정으로 인하여 고정 과정을 거치는 DNA 함량 측정방법에 비하여 비교적 신속하게 DNA 함량 측정 이 가능은 하지만, 아가미와 같은 원생생물에 오염된 조직 에서는 DNA 함량 측정이 불가한 것으로 결론 지어진다. 본 연구 결과를 고려 시, 참전복에서 고정 없이 유동세포 분석에 적절한 조직은 근육과 외투막으로 나타났으며 본 연구에 적용된 유동세포분석법은 참전복을 위시한 여과 섭이를 하는 여타 패류에서의 DNA 함량 분석 시 정확하 고, 신속한 방법임이 판명되었고 차후, 적용 가능하리라 사 료된다.

적 요

DNA 함량 조사는 진화의 유전적 기작을 예측하여 종 분화를 파악하게 한다. 본 연구의 목적은 참전복 (Haliotis discus hannai)의 DNA 함량을 측정하고 유세포분석기 (flowcytometry)로 고정 (fixation) 없이 DNA 함량 측정 에 최적인 조직들을 파악하는 것이다. DNA 함량 (pg nucleus^-1)에 있어, 원생생물에 오염된 아가미조직 (2.5± 0.08)은 3.2±0.02 pg nucleus^-1의 DNA 함량을 보인 근육 조직과 외투막조직에 비하여 유의하게 낮았고 (p<0.05) standard reference보다도 낮은 반면, 근육조직과 외투막조 직은 standard reference보다 높았다. 본 연구 결과들을 고 려 시, 참전복에서 고정 없이 유동세포분석에 적절한 조직 은 근육과 외투막이며 본 연구에 적용된 고정 과정이 없는 유세포분석법은 참전복 DNA 함량 분석 시 정확하고, 신속 한 방법임이 판명되었다.