서 론

2019년 통계청 어류양식동향조사 결과에 따라 국내 넙 치 (Paralichthys olivaceus) 양식 산업은 전체 양식 산업 생산 량의 약 51% 이상을 차지하는 중요한 산업이다.

그중 지속적인 바이러스성 질병에 의한 대량 폐사로 양 식 산업이 큰 피해를 받고 있다 (Park et al. 2015: Park et al. 2016). 국내 넙치의 대량 폐사를 발생시키는 주요 바이 러스는 viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV)로 보고 되고 있다. VHSV는 국내외 약 90여 종의 담수 및 해수어 류를 감염시키며 세계동물보건기구의 지정질병 (World Organization for Animal Health Office International des Epizooties (OIE) notifiable disease)으로 지정되었으며 (OIE 2017), 최근에도 다양한 어종에서 감염된 사례가 보고되 고 있다 (Guðmundsdóttir et al. 2019).

국내에서는 2000년대부터 동해안 넙치양식장에서 처음 발병된 이후, 저수온 시기인 겨울에서 봄까지 많은 폐사를 유발하여 경제적 손실을 발생시켰다. 수산생물질병관리법 에서도 법정전염병으로 관리하고 있는 질병이다 (Kim et al. 2003;Skall et al. 2005).

VHSV는 Rhabdoviridae과 Novirhabdovirus속에 속하 는 RNA 바이러스이며, 바이러스 입자의 크기는 직경 70 nm, 길이 180 nm의 탄환형 모양이다. Whole genome은 약 11,000 bp이며, nucleocapsid protein (N), phosphoprotein (P), matrix protein (M), glycoprotein (G), non-virion protein (NV), polymerase (L) 6개의 유전자를 순서대로 암호화하 고 있는 Negative-sense, single-stranded RNA genome 바이 러스이다 (Trdo et al. 2005).

N 유전자와 G 유전자의 염기서열 분석을 통해 계통분석 학적으로 4개의 유전자형 (I-IV)으로 나누어지며, 이러한 유전자형은 지리적분포에 따라 구분된다 (Einer-Jensen et al. 2004;Skall et al. 2005). Genotype I은 주로 유럽의 담수 와 해수에서 분리되었으며, Ia-Ie까지의 서브그룹을 가진 다. Genotype II는 발트해 및 핀란드에서 발견된 집단이며 (Einer-Jensen et al. 2004;Gadd et al. 2011), Genotype III는 북대서양 및 북해에서 발견되었다 (Einer-Jensen et al. 2004;Duesund et al. 2010). 그리고 Genotype IV는 세 개의 서브 그룹으로 나누어지며, Genotype IVa는 한국을 비롯한 동 북아시아 지역 및 동북태평양 지역의 해양환경에서 발견 되었으며 (Bernard et al. 1992;Traxler et al. 1999;Hedrick et al. 2003;Lee et al. 2007;Ahn et al. 2013; Garver et al. 2013), Genotype IVb는 북아메리카 오대호의 담수 지역에서 발 견되었다 (Elsayed et al. 2006;Thompson et al. 2011). 그리고, Genotype IVc는 캐나다 동해안 하구환경에서 발견되었다 (Gagné et al. 2007;Pierce et al. 2012).

VHSV 진단 방법은 OIE에 지정한 VHS 국제표준진단법 에 따라 세포배양법, 면역혈청학적 진단과 Real-time PCR, RT-PCR 및 염기서열 분석을 이용한 분자생물학적 진단 을 실시하고 있으며 (Ariel et al. 2001;Soliman et al. 2006;Garver et al. 2011; Jonstrup et al. 2013; OIE 2017), 국내에서 도 VHS를 ^「수산생물질병관리법_」 제10조 제1항·제3항·제 6항에 따라 수산생물 병성감정 실시방법에 필요한 세부사 항을 규정한 수산생물병성감정지침서에 의거한 분자생물 학적 분석을 통해 신장과 비장의 핵산을 이용하여 확정진 단을 실시하고 있다.

이러한 국내외 분자생물학적 진단법에 따르면 시료채 취를 위한 최적 기관 및 조직으로 신장을 포함한 내장기관 을 채취하여 정밀검사를 진행하고 있으나 (Mackaym 2004;Bland et al. 2012;Jonstrup et al. 2013;Kim et al. 2014), 넙치 의 바이러스 감염 후 각 조직별 바이러스의 정량적 분석은 아직 밝혀진 것이 없다.

이번 연구에서는 정량적 분석이 가능한 real time PCR 기기를 이용하여, 수산생물전염병의 방역조치 대상인 VHSV 감염 넙치의 다양한 조직 (아가미, 간, 신장, 비장, 근 육)에서 VHSV를 정량분석하여, 신속 정확한 질병진단 및 방역체계 확립에 대한 기초자료를 제공하고자 한다.

재료 및 방법

1. 바이러스 배양

넙치에서 분리된 VHSV (ADC-VHS2014-5)을 사용하였 다. 사용된 어류주화세포는 Epithelioma papulosumcyprini (EPC) cell line (ATCC NO. CRL-2872)에 10% fetal bovine serum (FBS)를 첨가한 Minimal essential medium (MEM; Invitrogen, CA), 1% antibiotic-antimycotic (Gibco BRL, USA)를 사용하여 20°C에서 배양하였다 (Winton 2007;Hwang et al. 2017). Tissue culture infective dose50 (TCID₅₀) 은 Reed and Muench (1983)법에 따라 96-well plate에 EPC cell line을 1×10⁴ cells well^-1로 분주하고 24시간 후 10 fold 로 단계희석한 VHSV 배양액을 100 μL씩 접종하고, 2% FBS를 첨가한 MEM 배지를 첨가한 후, 15°C에서 7일간 세 포변성효과 (Cytopathic effects; CPE)를 관찰하여 TCID₅₀ 을 측정하였다.

2. VHSV 넙치 인위 감염 실험 및 시료 채취

VHS 감염 이력이 없는 건강한 넙치 (평균 체장 18.7 cm, 평균 체중 50.42 g)를 선별하여 인위 감염실험을 진행하 였다. 넙치는 300 L 용량의 실험용 수조 22개에 10미씩 옮 겨, 실험 수온 13°C에 적응할 수 있도록 1주 동안 순차적 으로 온도를 낮추었으며, 실험기간 동안 13°C를 유지하였 다. VHSV 병원성 실험은 실험구 넙치 200미에 3.0E+07 TCID₅₀ per 0.1 mL per fish로 복강 주사하였다. 대조구 넙치 20미는 1×Phosphate buffered saline (PBS) (Gibco, USA) 0.1 mL을 복강 주사하였다. 폐사율은 실험구 수조 2 개의 넙치 20미를 16일간 조사하였다. VHSV 정량실험은 실험구 수조 18개의 넙치 180미를 시간경과에 따라 0시 간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일에 각각의 수조에 서 임의로 3미씩 선택하여 아가미, 간, 신장, 비장, 근육 시 료를 채취하였다. RNA isolation은 조직 마쇄액 100 μL를 RNA isolation kit AccuPrep^® Universal RNA Extraction Kit (Cat.K-3140; Bioneer, Korea)와 DNase treatment RNase- Free-DNase Set (Cat.79254; Qiagen, Germany)를 사용하여, RNA 50 μL를 얻었다.

cDNA 합성은 RNA isolation 후 얻은 RNA concentration 1 μg에 RT Rxn 20 μL/rxn RT premix AccuPower^® Rocketscript^TM Cycle RT Premix (Cat.K-2201; Bioneer, Korea)와 Primer Oligo dT (20 mer)를 사용하여 RT condition (37°C 30 sec, 48°C 4 min, 55°C 30 sec)×12 cycles, 95°C 10 min에 서 PCR machine은 MyGenie^TM 96 Gradient Thermal Block (Cat.A-2040-1; Bioneer, Korea)을 사용하여 합성하였다. 합 성된 시료를 -70°C에서 보관하였다.

3. Real-time PCR (Relative quantification)

Real-time PCR은 VHSV 유전자와 넙치의 Reference 유 전자인 EF1a 유전자를 비교하여 상대정량하였다. 실험 에 사용된 Primer로 VHSV (GenBank accession number Z93412.2)를 표적으로 하는 Forward primer: 5ʹ-ATGAGG- CAG-GTG-TCG-GAG-G-3ʹ; Reverse primer: 5ʹ-TGTAGT- AGG-ACT-CTC-CCA-GCA-TCC-3ʹ를 사용하였으 며, Paralichthys olivaceus Reference gene인 EF1a (Genbank accession number AB915949)을 표적으로 하는 Forward primer: 5ʹ-CAT-GGT-CGT-GAC-CTT-CGC-TC-3ʹ; Reverse primer: 5ʹ-CTC-GGG-CAT-AGA-CTC-GTG-GT-3ʹ을 사용 하였다.

실험에 사용된 시료는 합성된 Template cDNA 10 μL와 PCR Premix AccuPower^® 2X GreenStar Master Mix (Cat. K-6253; Bioneer, Korea)를 혼합하여 사용하였으며, Realtime PCR 기계는 Exicycler^TM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (Cat.A-2060; Bioneer, Korea)을 사용하였다. PCR 조건은 다음과 같이 Step 1: 95°C 10 min, Step 2: (95°C 15 sec, 60°C 1 min)×45 cycles scan^-1, Step 3: 65°C 5 min, Step 4: melting curve analysis 65°C~95°C (1°C sec^-1)으로 설정하였다.

Real time PCR을 통해 얻은 RAW 데이터를 분석하기 위 한 방법으로 Exicycler analysis를 사용하였다. 분석된 Ct값 을 상대정량법인 2-ddCt 방법을 이용하여 fold change를 계 산하여 log값으로 환산하였다 (Livak et al. 2001). 분석된 결 과들은 SPSS 프로그램 (SPSS, Chicago, IL, USA)을 사용하 여 통계적으로 분석되었으며, One-way analysis of variance (ANOVA) test에서 사후검정은 Duncan test를 통해 실시하 였다 (p<0.05).

결과 및 고찰

국내 넙치 양식 산업 생산량은 전체 양식 산업 생산량의 약 51% 이상을 차지하는 중요한 산업으로 성장하였다. 하 지만 지속적인 바이러스성 질병에 의한 대량 폐사로 양식 산업이 큰 피해를 받고 있음에도 아직 VHS 질병발생 예방 및 치료에 대한 조직별 바이러스 정량 분석에 대한 연구는 부족한 상황이다. 이에 본 연구에서는 수산생물전염병의 방역조치 대상인 VHSV 감염 넙치를 real time PCR 법을 이용하여 다양한 조직 (아가미, 간, 신장, 비장, 근육)에서의 VHSV를 정량분석하여, 신속 정확한 질병 진단 및 방역체 계 확립에 대한 기초자료로 활용하고자 하였다.

ADH-VHS2014-5 (3.0E+07 TCID₅₀ per 0.1 mL per fish) 을 복강 주사한 결과, ADC-VHS2104-5 바이러스 시험구 에서 공격실험 5일차부터 16일차 동안에 90%의 누적 폐 사율이 관찰되었다 (Fig. 1). Hwang et al. (2017)은 국내 넙 치 유래 VHSV를 사용하여 넙치 치어에 대한 병원성을 조 사한 결과 ADH-VHS2014-5을 복강 주사하여 90%의 누 적 폐사율이 관찰되었다고 보고하였다. 본 연구에서는 3.0E+07 TCID₅₀ per 0.1 mL per fish 농도로 감염 실험을 실시했음에도 90%의 누적 폐사율이 관찰되었는데, 바이 러스 배양 후에도 VHSV IVa (ADH-VHS2014-5)는 여전히 넙치에서 높은 폐사율을 가지는 고병원성 바이러스의 특 성을 유지하는 것으로 나타났다. Fig. 2A, B는 공격실험 5 일차 넙치의 사진이며, 개체에 따라 조금의 차이가 있으나 VHSV 감염의 주요증상인 지느러미 발적, 근육출혈 및 복 부팽만 등의 외부증상을 나타났으며, 내부증상으로 복수 및 장기 출혈이 육안으로 관찰되었다 (Fig. 2A, B).

시간에 따른 어체 내 바이러스 변화량을 Real-time PCR 상대정량 분석을 위해, 수온 13°C 환경에서 ADCVHS2014- 5 (3.0E+07 TCID₅₀ per 0.1 mL per fish)을 넙치 치어에 복강 주사하여 0시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일 시간순서로 무작위 선별된 넙치개체의 아가미, 간, 신장, 비장, 근육을 샘플링하여 RNA isolation 후 cDNA 합성하여 N-gene의 부분적인 서열과 house-keeping gene 인 EF1a-gene 대한 real-time PCR을 통해 Ct값을 측정하 였다. Exicycler analysis 프로그램을 통해 측정된 Ct값은 상 대정량법인 2-ddCt 방법을 이용하여 fold change를 분석 하였다. 분석결과, 4개의 조직 (아가미, 간, 신장, 비장)에 서 복강주사 후 2일차부터 VHSV 발현량이 증가하기 시작 하여, 5일차에 비장 (7.84±8.07 Fold charge (log10)), 아가 미 (7.02±7.22 Fold charge (log10)), 신장 (6.51±6.73 Fold charge (log10)), 그리고 간 (6.33±6.56 Fold charge (log10)) 조직의 Fold charge가 정점에 이른 후 감소하는 패턴이 나 타났다. 반면 근육 조직에서의 VHSV 발현패턴은 복강주 사 후 5일차에 17.3±20.0 Fold charge로 증가한 후, 유지되 는 패턴이 나타났다 (Fig. 3).

Kim et al. (2014)은 FYeosu05 (1.0E+5.8 TCID₅₀ per 0.1 mL per fish)를 넙치의 근육에 주사한 후 1, 3, 5, 7, 14, 21 일째 각 개체의 신장과 비장 조직을 pooling된 샘플을 TICD50 및 real time PCR 절대 정량결과를 비교 분석하였 다. TICD50 및 절대 정량결과 모두 3일차에 바이러스 발현 량이 급격히 증가하여 7일차까지 유지된 후 14일차부터 실험이 종료되는 21일차까지 바이러스 발현량이 감소하 는 패턴이 나타났다.

Kim et al. (2020)은 수온 20°C 환경에서 VHSV (1.0E+ 6.0 plaque forming unit (PFU) per 1 mL per fish)를 넙치 치 어에 복강 주사하여, 0일, 3일, 7일째 10개의 조직 (아가미, 뇌, 비장, 간, 두신, 신장, 식도, 위, 장, 근육)을 절대 정량하 였다. 그 결과, 3일차부터 7일차까지 VHSV 발현량이 급격 히 증가하는 패턴이 나타났으며, 7일차 비장, 근육, 아가미, 근육조직에서 VHSV 발현량 증가폭이 높게 나타났다.

본 연구의 결과는 Kim et al. (2014)과 Kim et al. (2020)이 보고한 결과들과는 다르게 5일차에서 VHSV 발현량이 가 장 높았다. 근육조직에서 VHSV 발현량을 비교하였을 때, 본 실험결과에서는 미미한 수준의 VHSV 발현량이 관찰 되었으나, Kim et al. (2020)이 보고한 결과에서는 7일차의 VHSV 발현량이 비장, 아가미 다음으로 높게 발현되는 것 으로 나타났다. 이렇게 상반되게 나타난 이유는 VHSV 분 리주, 실험기간, 수온, 실험어의 로트 및 분석방법의 차이 와 관련이 있을 것으로 추정되며, 향후 다양한 조건을 고 려한 감염 실험검토가 필요하다.

이번 연구결과, VHSV 감수성 어종인 넙치의 분자생물 학적 진단분석의 적정조직으로 사용되는 비장과 신장 중 에서 비장조직이 VHSV 진단분석의 적정시료로 사용되는 것에 문제가 없음을 시사한다. 반면 근육 조직은 본 연구 의 결과와 Kim et al. (2020)의 결과가 상반되어 확정진단 을 위한 적정조직으로 사용되기엔 부적절해 보이며, 추가 적인 검토가 필요할 것으로 보인다.

본 연구에서 수행된 VHSV 감염 넙치의 다양한 조직 (아 가미, 간, 신장, 비장, 근육)에서 VHSV를 정량분석을 하여, 국내에서 발생하는 법정전염병인 VHSV 진단 및 방역체 계 확립에 대한 자료로 이용 가능할 것이다.

적 요

국내외에서 80여 종이 넘는 담수 및 해산어류를 감염시 켜 대량폐사를 발생시키는 바이러스성 출혈성 패혈증 바 이러스 (VHSV) 진단검사를 위해 넙치의 여러 조직의 바 이러스 발현량에 대한 정량적 데이터를 시간순서에 따라 분석하였다. 무작위 선별된 넙치에 3.0E+07 TCID₅₀ per 0.1 mL per fish의 VHSV를 복강 주사하여 시간순서 (0시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일)에 따라 조직 (아가 미, 간, 신장, 비장, 근육)을 채취하였다. Real-time PCR 법 을 통해 상대 정량한 결과 5일차 아가미, 간, 신장, 비장에 서 바이러스의 발현량이 가장 높게 나타났다. 이번 연구를 통해 감염 초기단계에서 비장이 VHSV 확정진단을 위한 적정조직임을 입증하였으며, 국내 법정전염병 진단에 중 요한 정보를 제공할 것이다.