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서 론
해양 환경 내에서 암석 및 인공물질 표면에 부착하여 성 장하는 미생물, 해조류 및 저서 생물들과 같은 부착생물은 유기물질로 인해 형성된 유기막 (Organic surface)에 최초로 부착하여, 생체막 (Biofilm)을 형성하면서 천이에 따라 거대 생물 종 (홍합 유생, 따개비 등)이 부착하게 된다 (Amara et al. 2018). 해양생물의 부착은 선박의 속도 저하 및 무게 증 가로 연료 소비가 증가하고 부식을 유발한다 (Soroldoni et al. 2017). 특히 선박의 선체 표면에 1 mm의 생물이 부착하 면 연료 효율이 10% 감소하기 시작하여 평균연료 소모량 이 최대 40%까지 증가하며, 전 세계적으로 유조선 및 컨테 이너선의 연료비 손실이 연간 20억 달러에 가깝다 (Yee et al. 2016).
생물 부착으로 발생되는 피해를 방지하기 위해 방도 료가 개발되었고 방오능이 우수한 유기주석 화합물인 Tributyltin (TBT)이 1960년대부터 광범위하게 사용되었 다 (Darbre 2015). 하지만 TBT의 무분별한 사용으로 인해 해양생태계 및 해양생물 체내 고농도로 축적되기 시작하 였고 해양생물의 호르몬 불균형 및 imposex 현상을 유발 하였다 (Rodriguez-Grimon et al. 2020;He et al. 2021). TBT 의 강한 독성영향으로 2008년 국제해사기구 (International Maritime Organization)에 의한 Antifouling system 협약 이 체결되어 TBT는 전 세계적으로 사용이 금지되었으나 (Amara et al. 2018;Hwang et al. 2018), 해양환경에 유입된 방오물질은 해양환경 내 잔류하며 해양생물에게 독성영향 을 미칠 것으로 우려된다 (Lee et al. 2019).
TBT를 대체하기 위해서 구리화합물 (copper oxide)이 사용되었으나 TBT에 비해 낮은 방오능력으로 인해 chlorothalonil, diuron, irgarol, DCOIT, ziram, zinc pyrithione 등 의 다양한 신방오물질을 추가하여 부족한 방오능력을 보 완하였고 ( Jung et al. 2017), 신방오물질은 부착생물의 회 피, 기피 기작을 유도하거나, 운동성 저하 및 사멸 등 강 한 방오효과를 나타냈다 (Zhao et al. 2015). 신방오물질 중 에서 chlorothalonil은 농작물을 보호하기 위해서 사용되 는 살충제 및 살균제이다 (DeLorenzo and Fulton 2012). Chlorothalonil은 TBT보다 독성이 낮아 광범위하게 사용 되고 있지만, 환경 내에서 분해되어 2,4,5-trichloro-6- hydroxy-isophthalonitrile (SDS-3701), chlorothalonil sulfonic acid (R417888)와 같은 독성이 강한 분해 산물을 생성 한다 (Zhang et al. 2016). 이러한 분해산물은 미세조류와 알 테미아 (artemia) 유충의 생존율 및 개체군 성장률을 감소 시키며, 다양한 비표적 해양생물에게 강한 독성영향을 나 타낸다 ( Jung et al. 2017;Amara et al. 2018).
본 연구에서는 해양생태계 내에서 1차 소비자인 동물 성 플랑크톤이며, 어류 치어기 먹이생물로 어류 양식산업 에 중요한 역할을 담당하고 있는 해산 로티퍼 (Brachionus plicatilis)의 생존 및 개체군 성장률을 이용하여, 신방오물질 인 chlorothalonil의 생물독성을 평가하였으며, 무영향농도 (NOEC, No Observed Effective Concentration), 최소영향농 도 (LOEC, Lowest Observed Effective Concentration)와 반 수영향농도 (EC50, 50% Effective Concentration)를 산출하였 다. 이러한 연구결과는 chlorothalonil에 대한 생태안전성 평 가를 위한 기준 연구의 기초자료로 활용될 수 있으며, 직접 적인 생물영향 평가 결과를 통해 다른 신방오물질 간의 독 성영향을 비교할 수 있는 유용한 자료로 사용이 기대된다.
재료 및 방법
1. 시험 생물
시험생물은 서해수산연구소 자원환경과 해양생태위 해평가센터에서 3개월 이상 계대배양한 해산 로티퍼 (Brachionus plicatilis)를 사용하였다. B. plicatilis는 US EPA (EPA 1999) 및 국내 해양생물공정시험기준 (MOF 2018)에 서 지정한 지표 생물로, 25.0±0.5°C 항온 사육실에서 해산 클로렐라 (Chlorella vulgaris)를 먹이생물로 하루에 한 번 공 급하여 배양하였다. 해양생물공정시험기준을 준용하여 부 화 후 2시간 이내의 크기가 유사하고 운동성이 활발한 신 생개체를 선별하여 시험에 사용하였다 (Fig. 1).
2. Chlorothalonil 농도 조성
Chlorothalonil 농도는 DMSO (Dimethylsulfoxide, sigmaaldrich, USA)를 carrier solution으로 사용하여 10,000 mg L-1 stock solution을 제조한 뒤 멸균된 자연해수로 희석하 여 농도를 조성하였다. Chlorothalonil의 시험 농도는 사전 예비시험을 통하여 생존율 시험은 0.010~0.156 mg L-1, 개 체군 성장률 시험은 0.078~1.250 mg L-1으로 대조구를 포 함한 6개 농도구를 설정하였다. Carrier solution의 최종 함 유량은 전 시험구간에서 0.1%로 동일하게 조정하였다.
3. 생존율
생존율 시험은 24 well plate에 시험용액을 1 mL씩 6 반 복으로 분주하였다. 신생개체를 시험구가 분주된 24 well plate에 1 well당 5 개체를 넣고 25°C±1°C 항온항습기에서 24 h 암 배양하였다 (Table 1). 24 h 노출 후, 해부 현미경을 이용하여 각 well당 생존한 B. plicatilis의 개체수를 계수하 여 아래와 같은 방법으로 결과값을 산출하였다. 시험 중 먹 이공급은 하지 않았고 B. plicatilis의 생존 여부는 섬모관, 미 부 및 턱 관절의 움직임을 관찰하여 판단하였다.
생존율=생존 개체수/최초 투입 개체수×100
4. 개체군 성장률
개체군 성장률 측정 시험에서는 생존율과 마찬가지로 농도를 조성한 chlorothalonil을 24 well plate에 시험구당 1 mL씩 6 반복으로 분주한 뒤, 부화 2시간 이내의 신생개체 를 1 well당 5개체씩 넣었다. 1 well당 2,000,000개의 해산 클로렐라 (C. vulgaris)를 시험 직전에 먹이생물로 공급하였 으며, 72 h 노출시킨 이후 각 well에 있는 모든 B. plicatilis 개 체를 해부 현미경을 사용하여 계수한 후, 아래와 같은 방법 으로 개체군 성장률을 산출하였다.
개체군 성장률=(lnNd -lnNo)/d
(Nd=날짜 d에서의 개체 수, No=초기 개체 수, d=배양일)
5. 통계 분석
대조군과 시험군의 유의성 검정은 IBM SPSS statistics version 20 (IBM Co., New York, USA)의 일원분산분석 (ANOVA)의 다중 비교를 위한 Tukey test를 이용하여 비 교하였으며, 유의수준은 p<0.05로 설정하였다. 생존율과 개체군 성장률에 대한 무영향농도 (NOEC, No Observed Effect Concentration)와 최소영향농도 (LOEC, Lowest Observed Effect Concentration)는 Toxicalc 5.0 (Tidepool Scientific Software, California, USA)의 Dunnett’s test로 산출하 였고, 반수 영향농도 (EC50, Effective Concentration)와 95% 신뢰구간 (95% Cl, 95% Confidence Limit)은 probit test를 이용하여 분석하였다.
결 과
1. 생존율 변동
신방오물질인 chlorothalonil에 노출된 B. plicatilis의 생존 율 변화를 Fig. 2에 나타냈다. 대조구의 생존율은 90% 이상 으로 나타나 시험조건에 적합하였다. 0.020 mg L-1 농도까 지는 생존율의 유의미한 변화가 관찰되지 않았다. 하지만 0.039 mg L-1에서부터 생존율이 감소하기 시작하여 0.078 mg L-1에서 생존율이 급격하게 감소하였으며, 최고 시험농 도인 0.156 mg L-1에서는 모두 사멸하여 농도의존적인 결 과를 나타냈다.
2. 개체군 성장률 변동
B. plicatilis의 개체군 성장률 변화를 Fig. 3에 나타냈다. 대조구의 개체군 성장률이 0.5 이상으로 나타나 시험조 건에 적합하였다. 개체군 성장률도 생존율과 유사하게 chlorothalonil의 농도가 증가할수록 감소하는 농도의존적 인 결과를 나타냈다. 0.156 mg L-1 농도까지는 대조구와 비 교해 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 0.313 mg L-1부터 개체군 성장률이 감소하기 시작하여, 농도가 증가할수록 개체군 성장률이 급격하게 감소하였으며, 실험 최고농도인 1.250 mg L-1에서는 개체군이 증가하지 않았다.
3. 생존율 및 개체군 성장률을 이용한 독성평가
Chlorothalonil이 B. plicatilis의 생존율과 개체군 성장률 에 미치는 영향을 독성치로 나타냈다 (Table 2). NOEC는 각각 0.020 mg L-1, 0.156 mg L-1로 나타났고, LOEC는 각각 0.039 mg L-1, 0.313 mg L-1로 나타났다. EC50은 각각 0.057 mg L-1, 0.506 mg L-1로 나타났다.
고 찰
과거에 널리 사용되었던 TBT와 같은 유기주석화합물 은 어패류 등의 해양생물에게 imposex, DNA 손상 및 기 형 현상을 유발하는 것으로 알려지면서, TBT를 대체할 신 방오물질이 만들어져 사용되고 있다 (Almeida et al. 2017). 하지만, 신방오물질의 사용이 점차 증가하여 해양 환경 내 잔류 농도에 기인하는 비표적 독성영향이 있다 (Oliveira et al. 2017). 본 연구결과에서도 chlorothalonil에 노출된 B. plicatilis의 생존율 및 개체군 성장률은 농도의존적으로 감 소하는 경향을 나타냈고, 독성영향은 표준독성 반응인 sigmoid 곡선 형태를 나타내, B. plicatilis는 chlorothalonil 농 도가 증가할수록 개체군 성장률이 감소하고 사망률이 증 가할 것으로 판단된다. 하지만 노출시간이 증가할수록 독 성이 증가하는 일반적인 경향과는 다르게 chlorothalonil 에 노출된 로티퍼는 24시간 생존율의 독성이 더 높게 나타 났다. 이러한 결과는 chlorothalonil, DCOIT, dichlorluanid 와 같은 살충제 (pesticide) 기원의 방오물질에서 나타났으 며 (Park 2020), 먹이생물로 공급되는 녹조류 C. vulgaris가 chlorothalonil과 같은 살충제 성분을 흡수 및 농축하기 때 문에 chlorothalonil의 농도변화에 따라 로티퍼 개체군성장 률의 독성영향이 낮게 나타난 것으로 판단된다 (Hussein et al. 2017). 현재 미국을 비롯한 선진국에서는 다양한 종류의 지표 생물을 이용해 신방오물질의 생태독성평가가 수행 되어 왔지만 (Fernández-Alba et al. 2002;Devilla et al. 2005;Jung et al. 2017), 국내에서는 신방오물질의 해양 내 잔류가 확인되었음에도 불구하고 지표 생물을 이용한 생태독성평 가는 미흡한 실정이다 (Lee et al. 2011;Hwang et al. 2018).
Chlorothalonil은 일반적으로 신경계에 작용하여 뉴런 말단의 GABA-A receptor의 NA+ 흡수를 차단하는 메커 니즘을 사용하여 방오능을 발휘하는 것으로 알려져 있다 (Arora et al. 2013). 따라서, B. plicatilis의 신경세포체 말단 에 chlorothalonil이 작용하여 신경전달물질의 흡수를 방해 해 정상적인 생리활동을 저해하는 것으로 판단된다. 또한, chlorothalonil의 탄소 고리에 결합된 염소 이온 (Cl-)이 B. plicatilis의 세포막 인지질 (Phospholipid)과 결합하여 염화 인지질 (Chlorinated phospholipid)을 생성해, 생체 내 염증 반응을 통해 독성영향을 일으킬 것으로 판단된다 (Arora et al. 2013).
Chlorothalonil은 다양한 해양생물에게 독성영향을 미치 는 것으로 보고되고 있다 ( Jung 2012;Amara et al. 2018). 물 벼룩 (Daphnia magna)의 생식작용을 저해하며 (EC50: 28 μg L-1), 유령멍게 (Ciona intestimalis)의 난모세포 기형에 관여 (EC50: 42 μg L-1)하는 것으로 나타났으며 (Ernst et al. 1991;Bellas 2006), 바다 송사리 (Oryzias melastigma)의 치어발생 을 저해 (LC50: 110 μg L-1)하는 것으로 나타났다 (Bao et al. 2011). 또한, 일반적으로 chlorothalonil에 가장 민감하게 반 응하는 생물은 로티퍼로 알려져 있으며 (de Campos et al. 2021), chlorothalonil은 다른 살충제 기원의 방오물질과 비 교하여 로티퍼 및 플랑크톤 갑각류 (planktonic crustaceans) 에서 가장 강한 독성영향을 나타내는 방오물질 중 하나였 다 (Table 3).
주요 해운 선진국의 통계 (2000~2019)에 따르면 대한민 국은 세계 5위 수준의 선대를 운용하는 것으로 나타났다 (Kim et al. 2014). 많은 선박이 운용됨에 따라 선박의 유지, 보수 및 물리적인 충격으로 인해 탈락된 신방오물질은 해 양환경에 잔류하여 지속적으로 방오물질의 방출이 예상된 다 (Kim et al. 2014). 특히 chlorothalonil은 국내 전 해역에 서 다른 방오물질에 비해 잔류농도가 높게 검출되어 (Lee et al. 2011), 생태학적으로 양식산업 방면에서 중요한 역할 을 담당하는 로티퍼와 같은 해양생물에게 독성영향을 나 타낼 것으로 예측된다. 따라서 지속적인 모니터링 연구를 통해 chlorothalonil의 잔류농도 및 거동 분석이 필요하며, 장기적으로 방오도료 물질로서 chlorothalonil의 사용을 제 한 및 규제하기 위한 방안이 필요하다고 판단된다. 본 연구 결과는 chlorothalonil에 대한 B. plicatilis 생존율과 개체군 성장률을 이용한 생태독성 시험결과를 바탕으로 해양환경 내 chlorothalonil의 독성을 평가하기 위한 기초연구자료를 제시하고 다른 방오물질의 독성 세기를 비교할 수 있는 유 용한 자료로 활용될 수 있을 것이다.
적 요
어류 치어기의 주요 먹이로 생물로 사용되는 해산 로티 퍼 (Brachionus plicatilis)의 생존율 및 개체군 성장률을 이 용하여, 국내 연안에 잔류하고 있는 것으로 알려진 신방 오물질인 chlorothalonil의 독성을 평가하고자 하였다. B. plicatilis의 생존율은 0.039 mg L-1에서 유의하게 감소하기 시작하여, chlorothalonil의 농도가 증가할수록 감소하는 농도의존성을 나타냈다. 생존율의 무영향농도는 0.020 mg L-1, 최소영향농도는 0.039 mg L-1, 반수영향농도는 0.057 mg L-1로 나타났다. 개체군 성장률 또한 생존율과 마찬가 지로 0.313 mg L-1에서부터 농도의존적으로 감소하는 경향 을 나타냈다. 개체군 성장률의 무영향농도는 0.156 mg L-1, 최소영향농도는 0.313 mg L-1, 반수영향농도는 0.506 mg L-1 로 나타났다. 본 연구 결과, 해양 생태계 내에서 신방오물질 인 chlorothalonil의 잔류 농도가 0.039 mg L-1 이상일 경우 B. plicatilis에게 독성영향을 줄 것으로 예상되며, 본 연구의 생태독성 시험결과를 바탕으로 해양환경 내 chlorothalonil 의 독성을 평가하기 위한 기초연구자료 및 다른 방오물질 과의 독성영향을 비교평가할 수 있는 자료로 활용될 수 있 을 것이다.
