서 론

토마토반점위조바이러스 (Tomato spotted wilt virus, TSWV)는 Orthotospovirus속의 바이러스로서, 구조는 막 (Ribonucleocapsid core)으로 둘러싸인 80~120 nm 직경 의 구형 입자로 구성되어 있으며, 바이러스의 유전자는 L segment (8.9 kb), M segment (4.8 kb)와 S segment (2.9 kb) 의 세개의 분절 (segment)로 구성되어 있다 (Adkins 2000). L segment는 바이러스복제효소 (RNA-dependent RNA polymerase)를 발현한다 (de Haan et al. 1991). M segment 는 이동단백질 (movement protein)인 NSm 유전자를 발현 하며, 2개의 당단백질 (glycoprotein) Gn과 Gc를 생성한다 (Storms et al. 1995;Adkins 2000). S segment는 침묵억제인 자 (gene silencing suppressor) 기능을 하는 NSs 유전자와 외피단백질 (coat protein)을 합성하는 N유전자를 발현한 다 (Adkins 2000). TSWV는 고추, 토마토 등 가지과 작물을 포함하여 약 1,000여 종의 식물에 감염하는 것으로 알려져 있고 작물에 경제적으로 큰 피해를 주는 바이러스 중의 하 나이다 (Parrella et al. 2003;Pappu et al. 2009). 국내에서는 2003년 충남 예산지역 파프리카 재배농가에서 처음으로 확인된 후 (Kim et al. 2004), 현재 고추, 토마토 등의 작물에 서 전국적으로 발생하고 있으며 (Kwon et al. 2017; Kim et al. 2020), 2018년 기준으로 총 32종의 작물에 감염이 보고되 었다 (Kwak 2019). TSWV의 피해증상은 작물의 잎과 과일 에 원형반점, 괴사반점, 황화 및 모자이크 증상이 나타나며 심한 경우 식물체 전체가 고사된다. TSWV는 즙액을 활용 한 전염이 가능하지만, 주로 꽃노랑총채벌레 (Frankliniella occidentalis)를 포함한 10여 종의 총채벌레에 의해 전염하 는 것으로 알려져 있다 (Morse and Hoddle 2006). TSWV 의 넓은 기주범위와 매개충인 총채벌레 방제의 어려움 및 TSWV의 효과적인 치료제가 없기 때문에, 능동적 방제를 위한 저항성 품종을 사용하는 것이 TSWV를 예방하는 가 장 효과적인 수단이 될 수 있다.

TSWV 저항성 자원에 관한 연구는 고추 유전자원 (Capsicum chinense PI 159236, PI 152225)에서 단일 우성 유전 자인 Tsw가 보고되었다 (Boiteux and Avila 1994;Boiteux 1995). 또한 토마토 야생종 (Lycopersicon peruvianum)에서 유래한 TSWV 저항성 유전자 Sw5가 보고되었다 (Stevens et al. 1991). 이러한 저항성 유전자는 저항성 품종 개발에 활 용되어 농가에 보급되고 있다. 그러나 최근에는 고온에서 TSWV에 대한 저항성이 깨지는 현상이 나타나고 (Roggero et al. 1996;Moury et al. 1998), Tsw와 Sw5 저항성을 극복 하는 새로운 TSWV 변이 균주 (TSWV resistance breaking strain, TSWV-RB)가 보고되고 있다 (Roggero et al. 2002; Aramburu and Mart 2003; Thomas-Carroll and Jones 2003;Margaria et al. 2004;Lopez et al. 2011;Batuman et al. 2017;Ferrand et al. 2019). 최근 국내에서도 TSWV 내병성 고추 품종에 병을 일으키는 새로운 TSWV 변이 균주가 보고되 었다 (Kwon et al. 2021;Yoon et al. 2021).

이와 같이 TSWV에 대한 저항성 계통의 유지기간이 짧 기 때문에 새로운 품종 육성을 위해 저항성 자원을 지속적 으로 발굴하고자 노력하고 있다 (Han et al. 2012;Yang et al. 2012). 또한, 저항성 품종을 선발하기 위한 생물검정 체계 의 표준화를 위하여 TWSV 분리주의 특성 분석을 통한 표 준균주 선발 및 고효율·저비용의 접종법 개발이 필요하다. 또한 이러한 표준화된 생물검정법을 통해 유전자원의 감 수성·저항성 평가 방법을 확립할 필요가 있다.

이 논문에서는 토마토에서 분리된 TSWV 분리주 (SWTO2) 의 유전학적, 생물학적 특성을 구명하고, 최근에 농업 현장에서 발생하여 보고된 구기자, 머위 및 당귀에서 분리 된 TSWV 분리주와 특성을 비교하였다 (Kwak et al. 2020, 2021a, 2021b). 또한 TSWV 저항성 품종 선발을 위한 표준 화된 생물검정법을 확립하고, 시판되고 있는 고추와 토마 토 품종을 대상으로 이들 4종의 TSWV 분리주에 대한 저 항성을 검증하였다.

재료 및 방법

1. 바이러스 진단

2019년 수원 토마토 재배농가에서 괴사반점과 줄기 괴 사 등 바이러스 증상을 보이는 토마토 잎을 수집하였다. 감염 바이러스의 정밀진단을 위해 total RNA를 추출하고 (Plant RNA Prep Kit; Biocubesystem, Korea), 토마토 감염 주요 바이러스 10종에 대해 진단프라이머 (Supplementary Table 1)를 이용하여 역전사중합효소 PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하였다. RT-PCR 반응은 one-step RT-PCR premix (Genetbio, Korea) 를 이용하여 제조사의 권장 방법대로 수행하였다. RT-PCR 반응을 위한 온도 조건은 다음과 같다: 50°C에서 30분간 RT 반응을 수행한 후 95°C에서 10분 변성 후, 95°C 30초 변 성, 55°C 30초 annealing, 72°C 1분 extension을 35회 수행 후 마지막으로 72°C에서 5분 extension 후 완료하였다.

2. 바이러스 분리 및 병원성 검정

감염된 토마토 잎 조직에 10배 (W/V)의 0.01 M의 인산 완충액을 첨가하여 마쇄한 뒤 담배 (Nicotiana tabacum cv. Samsun)에 즙액접종하여 3차례에 걸쳐 단일병반을 순수 분리하고 (single local isolation), 담배 야생종 (N. rustica)에 서 증식하여 접종원으로 사용하였다. 기주범위와 병원성을 검정하기 위하여 5과 28종의 지표식물에 3반복으로 접종 하고 4주간 접종엽과 상엽의 병징을 관찰하고, TSWV 특이 프라이머를 이용한 RT-PCR 진단으로 감염 여부를 최종 확 인하였다 (Kwak et al. 2020, 2021b).

3. 바이러스 전체 염기서열 분석

TSWV 분리주 (SW-TO)의 전체 유전자 염기서열 분석 을 위하여 이전에 보고된 TSWV 특이 프라이머를 사용하 여 RT-PCR과 클로닝을 수행하였고 (Lee et al. 2011;Kwak et al. 2020), Bionics사 (Bionics, Daejeon, Korea)에 의뢰하 여 전체 염기서열을 얻었다. DNA Star v. 5.02 (Lasergene, Madison, USA)의 SeqMan 프로그램을 사용하여 DNA assembly를 수행하여 최종적으로 염기서열을 결정하였 고, National Center for Biotechnology Information (NCBI) 의 GenBank에 등록하였다. L, M, S segment의 전체 염기서 열을 기반으로 한 계통분석을 수행하였다. NCBI GenBank 에 등록되어 있는 TSWV 25개 분리주를 이용하여 각각 segment의 전체 염기서열을 Geneious Pro 10 software를 이 용하여 alignment를 수행하였고 염기서열 상동성을 분석 하였다. 계통분석 (phylogenetic tree)은 MEGA 7프로그램 의 Maximum likelihood method를 사용하였고 (Kumar et al. 2016), 계통수의 가지에 대한 통계적 유의성은 bootstrap 1,000반복을 수행하는 방법으로 분석하였다.

4. TSWV 저항성 판별 생물검정법 설정 및 평가

TSWV 저항성 판별을 위한 표준화된 생물검정법을 확립 하기 위하여 대상작물 준비 (토마토, 고추 품종 및 유전자 원 등), 검정장소 (온실, 식물생장상), 생장온도 (20~28°C), 접종방법 (즙액접종), 접종시기 (본엽 전개시기), 접종원 (TSWV 표준균주) 준비 및 병 조사방법 (병징 육안조사, RT-PCR) 등을 설정하고, 시판 토마토, 고추 품종을 대상으 로 저항성·감수성을 평가하였다.

결과 및 고찰

1. 토마토반점위조바이러스 분리 및 생물학적 특성 분석

2019년 수원 토마토 재배농가에서 수집한 토마토 잎 에서 괴사반점과 줄기 괴사 증상 등 바이러스 의심증상 을 보여 진단한 결과 TSWV 감염을 확인하였다. 담배 (N. tabacum cv. Samsun)에서 3차례에 걸쳐 단일병반 (single local lesion)을 순수분리하여 담배 야생종 (N. rustica)에 증 식하였다. 분리한 TSWV 분리주 (SW-TO2)의 생물학적 특 성을 구명하기 위하여 토마토를 포함한 5과 28종의 지표 식물에 접종하여 기주범위와 병원성을 확인하였다 (Table 1). 생물검정 결과, 토마토 서광과 텐텐 품종에서는 접종 엽에 모자이크와 괴사 증상을 보이고 상엽에서는 원형반 점과 모자이크 증상을 보였다. 담배 9종 중 N. tabacum cv. Samsun을 제외한 8종에서는 괴사, 원형반점 및 모자이크 등의 전신 감염을 보여주었고, 고추에서도 같은 증상을 보 였다. 최근에 농업현장에서 발생하여 보고된 구기자 (CYLC), 머위 (NS-BB20) 및 당귀 (NS-AG28) TSWV 분리주 와 특성을 비교하였다 (Table 1;Kwak et al. 2020, 2021a, 2021b). TSWV에 취약한 작물인 고추와 토마토의 경우, 고 추에서는 TSWV 4개 분리주 모두 접종엽과 상엽에서 원형 반점과 모자이크 증상을 보인 반면, 토마토의 경우 상엽에 서는 유사한 증상을 보였으나, 접종엽에서는 토마토 분리 주 SW-TO2만 괴사, 모자이크 증상을 보였다. 담배에서는 주로 접종엽에는 원형반점과 괴사 증상을 보였고, 상엽에 서 괴사 증상과 모자이크 증상을 보였다. 그러나 SW-TO2 분리주는 N. tabacum cv. Samsun에서, NS-AG28 분리주는 N. tabacum cv. Xanthi에서 전신감염을 확인할 수 없었다. 이들 4개의 분리주는 저항성 품종을 탐색하기 위한 표준균주로 사용하였다.

2. 토마토반점위조바이러스 분리주의 유전학적 특성 분석

TSWV SW-TO2 분리주의 전체 유전자 염기서열 분석 을 위하여 이전에 보고된 TSWV 특이 프라이머 (Lee et al. 2011;Kwak et al. 2020)를 사용하여 최종적으로 L (8,914 bp), M (4,772 bp) 및 S (2,974 bp)의 염기서열을 결정하였 고, NCBI의 GenBank에 등록하였다 (Table 2). 기존에 보고 한 구기자, 머위 및 당귀 분리주를 포함한 NCBI GenBank 에 보고되어 있는 TSWV 25개 분리주를 이용하여 각각 segment의 전체 염기서열을 Geneious Pro 10 software를 이용하여 염기서열 상동성을 분석하였다. MEGA 7프로 그램의 Maximum likelihood method에 의한 계통분석 결 과 (Fig. 1), TSWV는 크게 4개의 그룹으로 나뉘었고, 토마 토 TSWV 분리주 SW-TO2는 세 개의 segment에서 각각 국내 고추에서 분리한 분리주들과 98% 이상의 높은 상동 성을 보여 같은 그룹에 속함을 알 수 있었다. 특히 구기자 TSWV 분리주 (CY-LC, CY-G1-2)와도 같은 그룹에 속하였 다. 구기자 TSWV 분리주는 청양 고추재배 주산지에서 분 리되어 고추와 구기자 간의 상호전염 기주로서의 가능성 이 제기되었다 (Kwak et al. 2020). 논산지역의 머위에서 분 리된 TSWV NS-BB20 분리주와 당귀에서 분리된 TSWV NS-AG28은 같은 그룹으로 99%의 높은 염기서열 상동성 을 보였고, 세 개의 segment에서 스페인의 토마토에서 분 리된 TSWV_LL-N.05 (wild type; Debreczeni et al. 2015) 분 리주와도 98~99%의 높은 상동성을 보였다. 특히 NS-BB20 과 NS-AG28은 L segment에서 토마토 RB strain Pujol1TL3 (Debreczeni et al. 2015)와 S segment에서 고추 TSWV RB strain PVR (Debreczeni et al. 2015)과 P1 (Yoon et al. 2021) 분리주와도 96~98%의 상동성으로 크게는 같은 그룹에 속 하였지만, RB strain의 저항성을 극복하는 데 중요한 역할 을 하는 것으로 알려진 NSm (C118Y, T12ON; Lopez et al. 2011)과 NSs (T104A; Almási et al. 2017)에서의 아미노산 변이는 나타나지 않았다. 본 연구에서 사용한 4개의 TSWV 분리주는 모두 유전학적으로 TSWV RB strain은 아닌 것으 로 확인되었다.

3. TSWV 저항성 판별을 위한 생물검정법 구축

TSWV 저항성 품종을 효율적으로 판별하기 위해 간편하 고 표준화된 생물검정법이 필요하다. 이 논문에서는 국내 에서 TSWV가 가장 피해를 주고 있는 가지과 작물인 고추 와 토마토 품종을 대상으로 저항성 판별을 위한 생물검정 법을 확립하였다. 저항성 판별을 위한 대상작물은 최소 5 개체 이상을 준비하고 TSWV 저항성/감수성 판별기주 또 는 시판품종을 대조구로 사용한다. 생물검정은 충매 등 바 이러스 전염을 차단할 수 있는 온실 (실내) 또는 식물생장 상에서 실시하고, 생장온도는 20~28°C를 유지하였다. 접 종방법은 식물바이러스의 즙액접종 (sap transmission) 방 법 중 간단하고 정확하게 접종할 수 있는 미세상처를 통 한 기계적 접종법 (mechanical transmission)을 사용하였 다. 접종시기는 고추 또는 토마토 본엽 3~4엽이 전개된 후 에 본엽 1~2엽에 접종하였다. 접종원은 TSWV 감염 표준 시료 1 g에 인산완충액 (0.01 M Sodium phosphate buffer, pH 7.0) 10 mL (1 : 10 w/v)를 넣어 마쇄한 후 사용하였다. Carborundum (600 mesh; Fisher Scientific, USA)을 접종 할 잎 (본엽 1~2잎) 표면에 뿌려주고 마쇄한 TSWV 감염 즙액을 문질러 접종하였다. 접종 후 접종엽에 남아있는 Carborundum은 물로 씻어주었다. 병 조사방법은 접종 후 7~21일 동안에 1차 육안조사를 통해 접종엽과 상엽의 병 징을 관찰하였으며, 상엽을 대상으로 RT-PCR 진단을 통해 바이러스 감염 여부를 확인하였다. TSWV 저항성 평가는 Table 3과 같이 첫째, 접종엽에 괴사반점 증상이 나타나거 나 병징이 없는 경우, 둘째, 상엽에 병징이 없는 경우, 셋째, 상엽을 RT-PCR 진단한 결과 음성이 나왔을 경우 등 3가지 조건이 다 충족될 때 저항성으로 평가하였다 (Table 3).

4. 시판 TSWV 저항성 품종 대상 생물검정 평가

TSWV 토마토 분리주 (SW-TO2)를 포함하여 4개의 분 리주를 사용하여 시판되는 토마토 10품종 (TY달코미, 코 모도, 토리, TY하이큐, TS럭키, TY센스큐, 데프콘, 해피니 스, 서광 및 텐텐)과 고추 9품종 (TS챔프, GT-7, GT-5, 불칼 라, 칼탄패스, 칼라퍼펙트, PR킹카, 꽈리 및 슈퍼마니따)을 대상으로 3개체씩 3반복으로 구축된 생물검정법을 적용 하여 저항성 여부를 검정하였다. 토마토 품종 중 TSWV 접 종하였을 때 상엽에서 병징이 없고, RT-PCR 결과 음성으 로 확인되어 저항성으로 평가된 품종은 6품종 (TY달코미, 코모도, 토리, TY하이큐, TS럭키 및 TY센스큐)이었고, 데 프콘은 NS-BB20를 제외한 TSWV 3개 분리주에 대해서 감 수성을 보였으며, 해피니스, 서광, 텐텐의 경우 모든 분리 주에서 감수성을 나타냈다 (Table 4, Fig. 2). 고추 품종에서 는 TSWV 4개 분리주에 대해 저항성을 보인 품종은 6품종 (TS챔프, GT-7, GT-5, 불칼라, 칼탄패스 및 칼라퍼펙트)이 었고, PR킹카, 꽈리, 슈퍼마니따는 모든 TSWV 분리주에서 감수성을 보였다 (Table 5, Fig. 3).

이 논문에서 사용한 생물검정법은 다양한 작물에서 분 리한 4개의 TSWV 균주에 대해서 유사한 저항성 평가 결 과를 보여주어 저항성 판별을 위한 생물검정법으로 적합 한 것으로 판단하였다. 기존에 TSWV 저항성 품종 평가 및 저항성 유전자원을 선발하기 위한 다양한 평가방법들 이 보고되었다 (Yang et al. 2012;Choi et al. 2016). Choi et al. (2016)은 토마토를 대상으로 1차 유묘검정과 2차 성체 검정을 통해 저항성을 내병성, 중간내병성, 감수성으로 평 가하였고, Yang et al. (2012)은 증상등급을 6등급으로 나누 고, 증상등급에서 병징이 나타나지 않는 유전자원을 저항 성으로 보았다. 또한 고온에서 저항성 유전자 발현이 불안 정하기 때문에 유묘기에 고온 (35°C)에서 저항성 검정을 하는 것이 시간과 노력 등에서 효율적이라고 판단하였다. TSWV 저항성 품종 또는 유전자원을 선발하기위해 본 연 구에서 사용한 저항성 평가기준과 기존의 방법들과 상호 비교를 통해 표준화할 필요가 있을 것으로 사료된다.

적 요

토마토반점위조바이러스 (TSWV)는 고추, 토마토 등 경 제적으로 중요한 작물에 심각한 피해를 주는 바이러스들 중 한 종이다. TSWV의 넓은 기주범위, 매개충인 총채벌 레 방제의 어려움 및 TSWV의 효과적인 치료제가 없기 때 문에, 저항성 품종을 사용하는 것이 TSWV를 예방하는 가 장 효과적인 수단이 될 수 있다. 본 연구에서는 토마토에서 분리된 TSWV 분리주 (SW-TO2)의 유전학적·생물학적 특 성을 구명하고, 최근에 국내에서 분리된 구기자, 머위, 당 귀 TSWV 분리주와 비교하였다. 순수분리된 SW-TO2는 28 종의 지표식물 중 토마토를 포함한 17종에서 원형반점, 모 자이크 증상 등 전신감염 증상을 보였다. SW-TO2의 유전 자 계통분석 결과 국내에서 분리된 고추, 구기자 TSWV 분 리주와 98~99%의 상동성을 보이며 같은 그룹에 속하였 다. TSWV 저항성 평가를 위한 생물검정법을 확립하고, 시 판되고 있는 고추와 토마토 품종을 대상으로 4종의 TSWV 분리주에 대한 저항성 평가를 검정하였다. TSWV 저항성 평가는 첫째, 접종엽에 괴사반점 증상이 나타나거나 병징 이 없는 경우, 둘째, 상엽에 병징이 없는 경우, 셋째, 상엽을 RT-PCR 진단한 결과 음성이 나왔을 경우 등 3가지 조건이 다 충족될 때 저항성으로 평가하였다.