서 론

기후변화와 인구증가로 인류는 끊임없이 식량 위기 를 겪어 왔으며 이를 극복하기 위한 하나의 대안으로 현 대 생명공학을 이용한 유전자변형생물체 (Living modified organisms; LMO)가 개발되었다. 최근 LM 작물의 재배 면 적과 생산량은 꾸준한 증가 추세에 있으며, 주요 4대 작물 인 옥수수, 콩, 카놀라, 면화의 LM 작물 재배 면적은 전 세계 29개국에 걸쳐 약 1억 9천만 ha에 이른다 (ISAAA 2019). 특 히, LM 면화 (Gossypium hirsutum)의 재배 면적은 총 면화 재 배 면적의 약 79%를 차지하고 있으며 우리나라는 축산농가 에서 면실 (면화의 종자) 사료 이용의 증가로 매년 사료용 LM 면화의 수입이 증가하고 있다 (KBCH 2021). 최근 농업 생명공학 응용을 위한 국제 서비스 (International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications; ISAAA)의 보 고에 따르면 면화의 주요 재배국의 LM 면화 채택률은 미 국이 98%로 가장 높고 중국 (95%), 인도 (94%), 아르헨티나 (90.5%), 브라질 (84%)이 뒤를 잇고 있으며 그 규모는 매년 증가하고 있다 (ISAAA 2019).

LM 면화 GHB811은 Pseudomonas fluorescens 유래 hppdPF W336 유전자와 옥수수 유래 제초제 저항성 유전자인 zm-2mepeps 유전자를 발현시켜 글리포세이트 제초제에 저항 성을 갖도록 개발되었다. 토양미생물인 Bacillus thuringiensis 유래 Cry51Aa2 단백질을 발현시킨 MON88702는 반시 목 면화 해충에 독성을 갖는 이벤트로 최근 면화 해충인 Orius majusculus, Frankliniella fusca, Tetranychus urticae, Lygus lineolaris에 대한 위해성 연구가 진행되었다 (Cervantes et al. 2019;Huseth et al. 2020;Kim et al. 2021). LM 면화 COT67B 와 MON757 이벤트는 신젠타와 몬산토에서 개발한 B. thuringiensis 유래 Cry1Ab 단백질을 발현시키며 인시류 해 충에 대한 저항성을 갖는다.

다수의 시료 분석 시험에서 분석 시간과 비용, 노동력을 절감할 수 있는 방법으로 다양한 분자진단 분야에서 PCR 기반의 동시검출법이 활용되고 있다 (Ali et al. 2014). LMO 를 검정하기 위한 검출법에서도 동시검출법 개발이 활발하 게 이뤄지고 있으며 국내에서는 주로 자연생태계에 비의도 적으로 유출된 LMO의 이벤트 검정에 동시검출법이 활용 되고 있다. 환경부와 국립생태원의 LMO 동시검출법 개발 은 최근 국내 승인된 5개 작물인 옥수수, 콩, 면화, 카놀라, 알팔파를 대상으로 개발 중에 있다 (NIE 2020a). LM 면화 에 대한 국립생태원 개발 현황은 MON88701, DAS-81910- 7, COT102, T304-40을 포함하는 4개 이벤트 동시검출법 (Eum et al. 2019)을 개발하였으며, MON531, MON15985, MON88913, GHB614, LLCOTTON25, MON1445 6개 이벤 트 동시검출법 ( Jo et al. 2016)을 개발하고 여기에 GHB119, 281-3006를 추가하여 8개 이벤트를 1회 PCR 반응으로 검 정할 수 있는 고효율의 동시검출법 (Kim et al. 2019)을 개발 하여 LMO 자연환경 모니터링에 활용하고 있다.

본 연구에서는 국내 승인된 LM 면화 4종 이벤트 (MON 757, MON88702, COT67B, GHB811)에 대한 이벤트 특이 적인 동시검출법을 개발하였으며 특이도 확인 및 무작위 표준물질 (Reference material; RM) 혼합시료 분석, 검출한 계 (Limit of Detection; LOD) 분석을 통해 동시검출법 성능 을 검증하였다. 이번에 개발된 LM 면화 동시검출법은 환경 부 및 국립생태원 LMO 자연환경 모니터링 및 사후관리 연 구에 활용될 것이며 식물 검역 및 식품 성분 검사에도 활용 될 수 있을 것으로 사료된다.

재료 및 방법

1. 표준물질 및 DNA 추출

본 연구에서 사용된 LM 면화 RM GHB811, MON88702, COT67B는 ‘유전자변형생물체 국가간 이동 등에 관한 법 률’ (이하 LMO법) 통합고시 제6-29조에 따라 LMO 안전관 리 담당 정부 부처로부터 제공받아 연구에 활용하였다. 유 럽과 미국의 RM 생산기관 및 LMO 개발사에서 RM 생산 이 중단된 MON757은 도입유전자 카세트 염기서열과 면 화 게놈 유전자 주변 염기서열을 확보하여 plasmid 형태 의 RM인 synbiocon을 확보하였다. 종자 형태의 면화 RM 은 마쇄 후 Libex NP968 (Tianlong, China)을 사용하여 게 놈 DNA (genomic DNA; gDNA)를 추출하였다. 추출 실험 절차는 Tianlong 사의 식물 gDNA 추출 표준 프로토콜에 따 라 수행하였다. 그 외 실험에 사용된 비변형 (non-LM) 면화 및 LM 면화 RM은 국립생태원에 보유 중인 RM으로부터 추출하여 사용하였다. 추출된 gDNA는 Nano-drop ND2000 (Thermo scientific, USA)으로 정량 후 50 ng μL^-1 농도로 희 석한 뒤 PCR 반응 전까지 -20°C에 보관하였다.

2. 프라이머 설계

NCBI GenBank에서 동시검출 PCR 양성대조군으로 사 용될 면화 내재유전자 Alcohol Dehydrogenase C (Adh C, GenBank accession no. AF403365) 염기서열을 확보하여 primer를 제작하였다. 각각의 LM 면화 도입유전자 카세트 와 게놈 유전자에 특이적인 증폭 primer 설계를 위하여 유 럽위원회 공동연구센터 ( Joint Research Centre-European Commission; JRC-EC)와 농림축산검역본부 예규 ‘실험실 정밀검역 운영요령’에 제시된 LMO PCR 검사법의 primer 정보를 참고하였다. 모든 primer는 ㈜바이오팩트 (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였으며 10 pmole μL^-1로 희석한 뒤 사용하였다 (Table 1).

3. Polymerase chain reaction

동시검출 PCR 반응액 조성은 BioFACT^TM 2×Lamp Taq PCR Pre-Mix (Biofact, Korea) 15 μL에 100 ng의 gDNA, 각각 의 primer는 최종 농도 0.33 μM이 되도록 첨가 후 최종 30 μL 부피가 되도록 3차 증류수를 첨가하였다. Synbiocon 형 태의 MON757 plasmid RM은 면화 게놈 크기를 반영하여 0.0002 ng μL^-1 농도로 사용하였다. PCR 조건은 95°C 5분 변성 (denaturation) 1회, 33 cycle의 95°C 30초 변성, 59°C 30초 결합 (annealing), 72°C 30초 신장 (elongation) 주기로 유전자 증폭 후 최종 신장을 72°C 10분간 1회 수행하였다 (Proplex PCR system, Applied Biosystems, USA). PCR 반응 물은 2.5% 아가로즈겔에서 135 V 25분 조건으로 전기영동 한 후 Chemi-Doc^TM XRS⁺ (BioRad, USA)로 이미지를 촬영 하였다. 동시검출 PCR로 증폭된 각각의 밴드는 ㈜바이오 팩트 (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 염기서열 분석을 통해 증폭 결과를 확인하였다 (data not shown).

4. 특이도 및 검출한계 검증

개발된 LM 면화 동시검출법의 특이도 검증을 위하여 3 종의 non-LM 면화 RM과 11종의 LM 면화 RM을 이용하 여 동시검출 PCR 실험을 수행하였다. 또한 단일 (4종) 및 가 상의 후대교배종 (11종) 조합을 4종의 LM 면화 RM을 이용 하여 제조 후 동시검출 PCR 증폭 실험을 수행하였다. PCR 반응의 최종 주형 DNA 함량은 400 ng으로 부족한 양의 주 형 DNA는 non-LM 면화 gDNA를 첨가하였다. 신규로 개발 한 동시검출법의 검출한계 (Limit of Detection; LOD) 분석 을 위하여 4종의 RM DNA를 혼합한 시료를 100 ng μL^-1 농 도부터 순차적으로 1/2씩 멸균된 증류수로 희석하여 준비 하고 각각의 농도별로 1 μL씩 주형으로 사용하여 동시검출 PCR 반응을 수행하였다.

결과 및 고찰

1. LM 면화 4종 표준물질 확보

PCR 기반의 LMO 정성 및 정량 분석법 개발의 가장 핵 심 요소는 주형 DNA를 추출할 RM의 확보이다 (Wu et al. 2019). LMO의 RM은 크게 powder 형태와 DNA 형태로 구 분되며 각각의 RM은 유럽의 표준물질측정연구소 (Institute for Reference Material and Measurement; IRMM)와 미국유 지화학회 (American Oil Chemists’ Society; AOCS) 같은 표 준물질 생산기관에서 인증표준물질 (Certified Reference Materials)을 개발하여 공급하며 LMO 개발사에서는 수입 및 이용을 위한 LMO 승인 심사 의뢰 시 LMO법에 따라 RM을 용도별 주관 심사기관에 제출하고 있다. 본 연구에서 는 환경부 LMO 정성분석법 개발의 일환으로 추진되었으 며 검출법 개발에 필요한 RM은 생산기관 및 LMO 관계부 처의 협조로 확보하였다. 또한 상업화가 중단된 MON757 이벤트는 기존에 알려진 도입유전자와 옥수수 게놈 주 변 염기서열을 이용한 plasmid 형태의 synbiocon으로 합 성하여 사용하였다. 최근 IRMM에서는 3종의 LM 옥수수 MON810, DP-98140-6, NK603과 LM 콩 DP-356043-5 이벤 트에 대한 plasmid DNA를 개발하여 RM으로 제공하고 있 다. 본 연구에서는 plasmid DNA로 제작된 MON757 DNA (약 4 Kbp)의 농도를 전체 면화 게놈 크기 (약 2.5 Gbp)를 고 려하여 다른 3종의 powder 형태의 RM 첨가량 (100 ng μL^-1) 에 비례하도록 0.0002 ng μL^-1를 주형 DNA로 사용하였 다. 동시검출법 개발에서 가장 중요한 요소인 RM은 동일 한 농도 및 함량을 사용하여 PCR 실험을 수행하는 것이 핵 심이며 RM의 함량을 고려하여 동일한 농도의 주형 DNA 를 이용하여 분석을 하여야 유사한 증폭 강도의 밴드를 얻 을 수 있다. 본 연구에서도 gDNA RM과 synbiocon 형태의 plasmid DNA RM을 혼합하여 사용하였으며 각각의 분자 량을 고려하여 사용량을 조절한 결과 유사한 증폭 강도를 확인할 수 있었다. 또한 본 연구에서 사용된 비변형 LM 면 화 3종 및 LM 면화 11종을 IRMM 및 AOCS로부터 확보하 여 개발된 동시검출법의 특이도 검증에 활용하였다.

2. LM 면화 4종 동시검출법 개발 프라이머 설계

LMO 동시검출법은 다수의 시료 분석에 시간 및 비용을 절감할 수 있는 방법으로 국립생태원에서는 주요 수입 LM 작물인 옥수수, 면화, 콩, 카놀라, 알팔파를 대상으로 개발해 왔다 ( Jo et al. 2016;Shin et al. 2016;Eum et al. 2019;Kim et al. 2019;Choi et al. 2020;Kim et al. 2020;Park et al. 2020). 이번 연구에서는 LM 면화 4종에 대한 유전정보를 조사하 여 도입유전자 및 주변 염기서열을 확보하였으며 이를 바 탕으로 여러 조합의 이벤트 특이적 primer를 설계하였다 (Fig. 1). 각각의 primer는 LM 동시검출법 개발을 위한 단일 검출 시험에서 특이적으로 증폭되는 것을 확인하였다 (NIE 2019, 2020a). 단일검출 PCR뿐만 아니라 동시검출 PCR 분 석법 개발에서 primer dimer의 방지는 비특이적 PCR 생성 물의 증폭을 방지하기 위해 프라이머 설계단계에서 반드시 고려되어야 하며 고농도의 primer 사용, cold start PCR, 저 효율의 PCR 효소 사용은 primer dimer을 유발한다 (Brownie et al. 1997). 본 연구에서는 primer 상호 간 dimer가 형성되 는지 여부를 조사하기 위해 ㈜ThermoFisher에서 제공하는 Multiple Primer Analyzer를 이용하여 여러 조합의 primer 를 분석하고 전기영동으로 PCR 증폭 밴드의 크기 차이가 100 bp 내외인 조합의 primer 세트를 선정하였으며 이를 이 용하여 동시검출 PCR 시험을 수행하였다. 또한 원하는 양 의 증폭 이후에는 과증폭이 일어나지 않도록 최소 농도의 primer를 사용하여 비특이적 증폭을 방지하였다.

3. LM 면화 4종 동시검출 PCR 개발

최적의 조합으로 선정된 프라이머 세트로 LM 면화 4종 의 동시검출 PCR 실험 결과 2.5% 아가로즈겔 전기영동에 서 MON757 (151 bp), MON88702 (239 bp), COT67B (334 bp), GHB811 (429 bp) 이벤트 특이적 증폭이 검출하였다 (lanes 1~5 in Fig. 2). 각각의 증폭된 PCR 밴드는 ㈜바이오 팩트에 의뢰하여 염기서열을 분석한 결과 해당 이벤트의 서열임을 확인하였다 (data not shown). 개발된 동시검출법 의 PCR 증폭 밴드 크기는 최소 151 bp에서 최대 429 bp로 각 이벤트별 증폭 밴드의 크기 차이는 100 bp 내외로 2.5% 아가로즈겔에서 충분히 구별이 가능하였다. 일반적인 동 시검출 PCR 실험의 primer 농도는 0.1~0.5 μM이며 DNA copy 수나 구조적 복잡함의 정도에 따라 농도는 조절하여 사용한다 (Markoulatos et al. 2002). 또한 이전 국립생태원 LM 면화 동시검출 개발 사례에서 증폭 효율을 얻기 위해 primer 농도를 달리하여 PCR 조건을 확립하였다 ( Jo et al. 2016). 하지만 다양한 농도의 primer는 동시검출 효율을 높 일 수 있는 반면 실험 수행을 번거롭게 하여 동시검출 PCR 활용을 오히려 저해하는 요소였다. 본 연구에서는 이러 한 동시검출 실험의 취약점을 보완하고자 동일 농도 (0.33 μM)의 primer를 이용하여 유사한 증폭 강도의 효율을 갖 는 동시검출법을 개발하였다.

4. 특이도 검증 및 무작위 RM 조합 분석

개발된 동시검출법은 국립생태원 LMO 자연환경 모니 터링에서 수집된 LMO 의심개체 정성분석에 활용될 것이 다. 신규로 개발된 LM 면화 동시검출법이 여러 이벤트의 도입유전자 카세트와 게놈 유전자에 특이적으로 증폭되는 지 확인하기 위하여 국립생태원에 보유 중인 RM을 이용하 여 특이도 검증 실험을 수행하였다. 그 결과 3종의 non-LM 면화와 11종의 LM 면화 이벤트의 gDNA를 이용한 동시검 출 PCR에서 양성대조군인 내재유전자 (Adh C)만 증폭되 고 나머지 모든 RM에서 증폭되는 밴드를 관찰할 수 없었 다 (lanes 6~19 in Fig. 2). 따라서 이번에 개발한 LM 면화 동 시검출 PCR 방법은 4종의 LM 면화에 특이적으로 반응함 을 확인하였다.

개발된 4종 LM 면화 동시검출법이 다양한 가상의 후대 교배종 조합에서도 분석이 가능한지 검증하기 위해 15종 의 RM DNA 조합 (random mix)을 이용하여 시험하였다. 6 종의 2개 RM 혼합물, 4종의 3개 RM 혼합물 분석에서 각각 의 특이적인 이벤트 증폭 밴드를 확인할 수 있었다 (Fig. 3). 국내 수입되는 LMO 이벤트의 최근 동향을 분석했을 때 대 부분 후대교배종으로 수입되고, 유통이 활발해짐에 따라 국내 생태계로 유출되는 LMO 또한 증가하고 있다 (NIE 2020b). 이번 LM 면화 동시검출 PCR 분석법은 자연생태 계에 비의도적으로 유출된 LM 면화의 이벤트 분석에 사용 될 것이며, 이러한 가상의 후대교배종 조합을 활용한 동시 검출 PCR 분석법의 효율 검증은 향후 여러 유전자 카세트 가 혼합된 유출 LMO의 분석에 활용 가능성을 높여준다.

5. 검출한계 검증

LMO 자연환경 모니터링 시료분석 및 검역 등 다양한 용 도에서 활용하게 될 LM 면화 동시검출법의 분석대상은 시 료의 양과 종류, 상태에 따라 극미량의 DNA로도 PCR 분 석이 가능해야 한다 (Eum et al. 2019). 개발된 LM 면화 동 시검출 PCR법의 LOD 분석을 위해 4개 이벤트의 RM을 균 일희석법 (serial dilution)으로 100, 50, 25, 12.5, 6.6, 3.1, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2 ng μL^-1 농도로 희석하였다. 희석된 주형 DNA 를 이용하여 동시검출 PCR을 수행한 결과 아가로즈겔 전 기영동에서 25 ng μL^-1 농도까지 검출이 가능하였다 (Fig. 4). PCR 기반의 LMO 검출기술은 시료의 상태와 양에 관 계없이 높은 정확도를 보장하기 때문에 다양한 LM 작물의 검출기술에 활용되고 있다. 이번에 개발된 LM 면화 4종에 대한 동시검출법은 높은 민감도와 극미량의 DNA 시료에 서도 각각의 이벤트를 검출할 수 있는 기술로 향후 LMO 자연환경 모니터링 및 수입 농산물 검역, 식품 성분 분석에 도 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

적 요

면화는 중요한 섬유 작물로 종자는 가축의 사료로 사용 된다. 작물 생명공학은 농업 분야에서 농업적 형질과 질 을 향상시키기 위해 활용되어져 왔다. 국내 식품, 사료, 가 공 제품에 유전자변형 (LM) 면화의 사용이 증가함에 따라 환경으로의 LM 면화의 비의도적 유출 또한 증가하고 있다. LMO 모니터링 사업에서 수집된 LM 면화를 검정하기 위하 여 국내 수입 승인된 LM 면화의 검출법 개발이 필요하다. 본 연구에서는 LM 면화 MON757, MON88792, COT67B, GHB811 4종을 대상으로 동시검출법을 개발하였다. 이벤 트에 대한 유전 정보는 유럽 JRC와 농림축산검역본부에서 확보하였다. LM 면화의 동시검출법 개발을 위해 이벤트 특 이적인 프라이머를 설계하였으며 특이적인 증폭을 확인하 였다. 특이도 검정, 무작위 표준물질 혼합물 분석, 검출한계 분석을 통하여 동시검출법의 정확도와 특이도를 검증하였 다. 그 결과 본 동시검출법은 각각의 이벤트를 검출할 수 있 으며 LM 표준물질을 활용하여 특이도를 검정하였다. 또한 무작위 표준물질 조합도 정확하게 검출할 수 있다. 검출한 계 분석에서는 25 ng의 미량의 주형 DNA로 단회 분석으로 검출이 가능하다. 결론적으로 4종의 LM 면화 동시검출법을 개발하였으며 LM 면화 자생체 분석에 활용될 것으로 사료 된다.