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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean J. Environ. Biol. Vol.39 No.4 pp.452-462
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2021.39.4.452

Molecular physiological inhibitory effects of chloroacetanilide herbicide pretilachlor on marine dinoflagellate Prorocentrum minimum

Hansol Kim, Jang-Seu Ki*
Department of Biotechnology, Sangmyung University, Seoul 03016, Republic of Korea
*Corresponding author Jang-Seu Ki Tel. 02-2287-5449 E-mail.
kijs@smu.ac.kr
05/11/2021 15/11/2021 16/11/2021

Abstract


Pretilachlor (PRE) is a common acetanilide herbicide used worldwide. However, its effects on aquatic organisms, particularly marine photosynthetic life, are not sufficiently known. Herein, we evaluated the toxic effects of PRE by physiological and molecular parameters in the photosynthetic dinoflagellate Prorocentrum minimum. The cell density, pigment content, and photosynthetic parameters (Fv/Fm and PIABS) were considerably decreased with increased PRE exposure time and doses. In addition, photosynthesis-related genes, PmpsbA, PmpsaA, and PmatpB, were significantly upregulated when exposed to 1.0 mg L-1 of PRE for 24 h (p<0.001). In 72 h treatment, the relative gene expression was significantly increased (0.1 and 0.5 mg L-1; p<0.01). In contrast, PmrbcL was decreased or little changed compared to the controls. Reactive oxygen species (ROS) increased after 24 h exposure (p<0.001). However, the transcriptional fold-changes in glutathione S-transferase (GST ) were significantly increased (0.5 and 1.0 mg L-1; p<0.001) at 72 h. These findings suggested that the PmGST might be involved in PRE detoxification in P. minimum. In addition, PRE may affect the photosystem function in phytoplankton similar to other acetanilides, causing severe damage or cell death.


Prorocentrum minimum , pretilachlor (PRE) , photosystem , genes response , reactive oxygen species (ROS)

해양 와편모조류 Prorocentrum minimum 에 대한 아세트아닐라이드계 제초제 프레틸라클로르의 분자 생물학적 저해 효과

김한솔, 기장서*
상명대학교 생명공학과

초록

    서 론

    아세트아닐라이드계 제초제는 한해살이 식물과 활엽 식 물의 초기 성장을 방해하는 제초제로, 전 세계적으로 널리 사용되고 있다 (Martin and Worthing 1974;Cummins et al. 2013). 이들은 주로 논 제초제로 사용되며, 콩, 오이, 땅콩, 옥수수 등 밭 작물의 광엽 잡초 제초에 쓰인다 (EFSA 2008;Jursik et al. 2011). 아세트아닐라이드계 제초제는 K3 그룹 에 속하며, 세포 내 매우 긴 사슬 지방산 (very long chain fatty acid, VLCFA) 합성, 지베렐린 전구체와 플라보노이드 의 대사를 저해하는 것으로 알려져 있다 (Wilkinson 1981, 1982;Götz and Böger 2004). 게다가, 이들은 식물의 광합성 과 RNA 합성에 영향을 미치는 것으로 보고되었다 (Ashton et al. 1977;Sloan and Camper 1986). 그러나, 대상 제초제의 작용 메커니즘 및 농작물과 잡초에 미치는 생리적 영향은 잘 파악되었음에도 불구하고, 비표적 생물인 수생식물 및 미세조류에 대한 연구는 아직 부족하다.

    대표적인 아세트아닐라이드계 제초제는 alachlor, acetochlor, metolachlor, butachlor, pretilachlor (PRE) 등이 있으 며, 환경에서 잘 분해되지 않고 광분해 시 그 독성이 유사 하거나 더 증가하는 것으로 보고되었다 (Souissi et al. 2013). 그중, alachlor와 heptachlor는 세계자연기금 (World Wide Fund for Nature, WWF)과 미국 환경 보호국 (The United States Environmental Protection Agency, USEPA)에서 내분 비계 장애물질로 규정하고 있다. 이에 따라 alachlor는 정책 적으로 음용수 잔류 수치가 0.1 μg L-1 이하가 되도록 모니 터링한다 (EU 2007). 현장 조사에 따르면 아세트아닐라이 드계 제초제는 농업 유출수로 하천과 강을 통해 바다로 유 입되고 있다 (Wauchope 1978;Skaggs et al. 1980;Almeida et al. 2007;Tyohemba et al. 2020). 특히, alachlor는 스페인 만 을 비롯한 해안가의 퇴적물에서 검출되기도 하였다 (Rial et al. 2017). 이들 아세트아닐라이드계 제초제가 유해물질로 지정되어 수출입이 제한되면서, 최근 PRE 등 대체 제초제 의 사용이 증가하고 있다.

    PRE는 중등도 (moderate toxicity)의 독성을 갖지만, 수생 생물에게는 독성이 강해서 장기적으로 수생태계에 악영향 을 미칠 수 있다 (ChemBlink CAS# 51218-49-6). 따라서 한 국 정부는 농산물에 대한 PRE의 잔류허용기준을 0.05~1.0 mg kg-1으로 정하고 있다 (MFDS 2018). 국내에서 조사한 바에 따르면, 토양에 살포된 PRE의 최소 83.9%는 잔류하 고 최대 8.2%는 용출되었고 (Lee et al. 1998), 사질식 양토 (sandy clay soil)의 내부 10 cm까지 침투하는 것으로 보고 되었다 (Moon et al. 1987). 또한, 토양에 잔류하는 PRE는 자연적으로 제거되지 않으며 (Wei et al. 2011), 벼 흡수율은 상대적으로 낮기 때문에 농업 폐수에 의해 수계로 노출될 가능성이 높다 (Lee et al. 1998). 현재까지 연구는 주로 농지 에 잔류하는 PRE 검출과 미생물 분해에 의한 잔류 물질 전 환에 집중되었으며 (Posecion et al. 2006;Tsuda et al. 2009;Van Toan et al. 2013;Nykiel-Szymańska et al. 2020), 수계로 유출되어 담수 및 해양 생물에 미치는 영향은 거의 파악되 지 않았다. 특히, 광합성 미세조류를 비롯한 비표적 생물에 대한 환경적 위험 및 유전 독성이 연구된 바는 거의 없다 (Kaushik et al. 2010). 따라서, 수생태계의 비표적 생물에 대 한 PRE의 독성과 그 메커니즘에 대한 이해가 필요하다.

    광합성 와편모조류 Prorocentrum minimum은 해양의 중 요한 1차 생산자이며 전 세계 수역에 분포한다 (Heil et al. 2005). 이 종은 실험실에서 배양이 용이하고 오염 물질과 환경 변화에 민감하기 때문에, 다양한 물질을 대상으로 독 성 평가에 사용되어왔다 (Okumura et al. 2003; de Kuhn et al. 2006; Guo et al. 2012;Ebenezer and Ki 2013a;Wang et al. 2019). 실제, 한국에서 분리된 P. minimum 배양주 D-127은 배양 조건, 중금속, 환경호르몬, 유기오염물 등에 민감하게 반응하는 것으로 파악되었다. P. minimum D-127은 영양염 (Abassi and Ki 2021), 중금속 CuSO4 (Guo and Ki 2013), 살 조제 NaOCl (Ebenezer and Ki 2013a), 살충제 endosulfan (Ebenezer and Ki 2012), 제초제 alachlor (Kim et al. 2020), metazachlor (Kim et al. 2021), metolachlor (Ebenezer and Ki 2013b), 내분비 교란 물질 polychlorinated biphenyls (Ponmani et al. 2015), bisphenol A (Ebenezer and Ki 2016)에 민 감하게 반응하였다. 이러한 결과는 P. minimum이 화학 물질 및 물리적 스트레스에 대한 독성 영향을 평가하기에 적합 함을 보여준다.

    본 연구는 아세트아닐라이드계 제초제 PRE가 해양 와 편모조류 P. minimum에 미치는 독성을 평가하여, 해양 생 태계에 미칠 수 있는 영향을 파악하고자 하였다. 세포의 성장 변화를 파악하고, 이를 바탕으로 반수영향농도 (50% effective concentration, EC50)를 산출하였다. 또한 광합성과 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 축적 변화를 분 석하여 PRE가 해양 광합성 생물에 작용하는 메커니즘을 파악하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1. 미세조류 배양 및 제초제 처리

    해양 와편모조류 Prorocentrum minimum (D-127)은 한 국해양미세조류은행 (Korea Marine Microalgae Culture Center, Pukyong National University, Busan, Korea)에서 분 양받았다. 자연 해수를 Whatman GF/C로 여과 후 멸균 (121°C, 15분)하여 f/2 배지를 제조하고 (Guillard 1975), 배 양주는 20±0.5°C, 광량 60 μmol photons m-2 s-1, 명암 주 기 12L : 12D 조건에서 배양하였다. PRE가 P. minimum에 미치는 독성 영향을 파악하기 위해, 지수기 (12일차)의 세 포에 다양한 농도의 PRE를 처리하였다. 시험에 사용된 PRE (C17H26ClNO2, Cas No. 51218-49-6)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. Dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich)를 이용하여 표준 용액을 제작하 고, 최종 농도가 0.0 (대조군), 0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 50.0 mg L-1 가 되도록 농도구배를 두었다. 이때 모든 실험군에 제공된 DMSO의 최종 농도는 0.1% 이하가 되도록 조성하였다. 유 전자 발현 실험의 경우, 0.01, 0.1, 0.5, 1.0 mg L-1의 PRE를 처리하였다. 모든 실험은 3회 반복 실험군으로 진행되었다.

    2. 세포 계수 및 색소 분석

    세포 성장에 미치는 영향을 파악하기 위해, 지수기 (12일 차)의 배양주에 서로 다른 농도의 PRE를 처리하고 시간경 과 (0, 24, 48, 72시간)에 따라 시료를 확보하였다. 세포 계수 는 플랑크톤 계수기 (HMA-S6117; Matsunami Glass, Osaka, Japan)에 0.2~1.0 mL의 시료를 분주하여 (세포 밀도에 근 거), 광학현미경 하에서 개체 수를 계수하였다.

    미세조류의 색소 chlorophyll a (Chl a)와 carotenoids (CARs)는 분광광도계 DU730 Life Science UV/Vis spectrophotometer (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)를 사용 하여 분석하였다. P. minimum에 서로 다른 농도의 PRE를 처리하고 72시간 뒤에 20 mL의 샘플을 Whatman GF/C 필 터지에 여과하였다. 여과된 샘플은 90% 아세톤을 용매로 암실 (4°C)에서 24시간 동안 정치 후, 원심분리하여 정제하 였다. 90% 아세톤을 Blank로 설정하고 2 mL의 샘플을 분광 광도계로 분석 후, Parsons et al. (1984)에 따라 색소 농도를 계산하였다. 세포 계수와 색소 분석 모두 3회 반복으로 진 행하였다.

    3. 광합성 지표 분석

    PRE가 P. minimum의 광계에 미치는 영향을 파악하기 위 해 Handy Plant Efficiency Analyser fluorometer (Hansatech Instruments Ltd, Norfolk, UK)를 사용하였다. 샘플 2 mL 를 각 유리병에 분주한 뒤, 20°C에서 20분간 암실에 방치 하였다. PRE 농도 0.0, 0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 50.0 mg L-1으로 처리한 샘플을 24시간마다 형광값을 측정하였다. 각 시료 의 최소 형광값 (Minimum Fluorescence, F0)과 최대 형광값 (Maximum Fluorescence, Fm)을 분석하였고, 이를 통해 광 계 II의 광합성 효율 지표 Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm와 식물의 활 성 지표인 PIABS (Performance index on absorption basis)를 결정하였다 (Strasser et al. 2000;Oukarroum et al. 2007).

    4. RNA 추출, cDNA 합성 및 qRT-PCR 분석

    PRE가 광합성 단백질 및 항산화 단백질을 암호화하 는 유전자의 발현에 미치는 영향을 파악하기 위해 실 시간 정량적 중합효소연쇄반응 (Quantitative real time- PCR, qRT-PCR)을 실시하였다. 선행연구에서 발굴 한 P. minimum의 광합성 관련 유전자 (PmpsbA, PmpsaA, PmatpB, PmrbcL)와 항산화 유전자 (PmGST, PmKatG)를 선정하였고, 각 유전자에 특이적인 프라이머 (PmpsbA-F, 5′-TGGATGGGAAGAGAGTGGGAG-3′; PmpsbA-R, 5′-TGCTGATGCTGCTACTATAGGTGC-3′; PmatpB-F, 5′-CAGCAGACGACCTAACGGATC-3′; PmatpB-R, 5′-CCTTTGCTTGCCAGGTTCCTG-3′; PmpsaA-F, 5′-CTTAGGAGCACACGCATTTGGC-3′; PmpsaA-R, 5′-TGGCTTCATTGCTACTGCATTG-3′; PmrbcL-F, 5′-AGTTGTGGAAGGCAGGCACCTACG-3′; PmrbcL-R, 5′-GCGTCTTCGCGTACTCGACGAC-3′; PmKatG-F1, 5′-ATGAGGAGTGGGAGCAAGTCGC-3′; PmKatG-R1, 5′-TGTTTCGCTAACGCCAGGTACG-3′; PmGST-F1, 5′-TCCACCAATGAGCACCACCGA G-3′; PmGST-R1, 5′-AATGCGAGTCCGTTGACGACAC-3′; PmTUA-F, 5′-GCGTGCTGCATGATGTATCGTG-3′; PmTUA-R, 5′-ATCCGGTAGGGCACCAATCAAC-3′)를 이용하여 상 대적 유전자 발현량을 분석하였다 (Guo and Ki 2012, 2013; Guo et al. 2014, 2017).

    PRE를 24 및 72시간 처리 후, 200 mL의 P. minimum을 수확하고 상층액을 제거하였다. 각 시료에 1 mL의 TRIzol 용액 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)과 0.1 mm zirconium bead를 첨가하였다. 시료는 즉시 액체 질소로 냉각하여 RNA 추출 전까지 -80°C에 보관하였다. Mini-Bead beater (BioSpec Inc., Bartlesville, OK, USA)로 세포를 파쇄 (3000 rpm, 1분)하였다. RNA는 TRIzol 매뉴얼에 따라 추출하였 으며, 추출된 RNA는 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)로 정제하였다. 정제된 RNA는 TOPscriptTM cDNA Synthesis Kit (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 사용 하여 complementary DNA (cDNA)를 합성하였다.

    각 유전자의 상대적 발현율 분석은 CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 수 행하였다. qRT-PCR 반응액은 TOPrealTM qPCR 2X PreMIX SYBR Green Kit (Enzynomics) 10 μL, 희석된 cDNA 2 μL, 프라이머 각각 0.5 μL를 포함하여 총량 20 μL가 되도록 멸 균 증류수를 첨가하였다. qRT-PCR 조건은 50°C에서 5분, 95°C에서 10분 동안 열을 가한 후, 95°C 10초, 60°C 15초, 72°C 15초 동안 40회 반복하여 반응시켰다. 증폭 특이성 확인을 위해, 샘플을 65°C에서 95°C로 점진적으로 가열하 여 각 유전자의 용융곡선 (Melt curve)을 확인하였다. Cycle threshold (Ct) 값은 BioRad CFX 소프트웨어에서 얻었고, 각 유전자의 상대적 발현 값은 Alpha tubulin (TUA) 유전자 를 이용하여 표준화하였다 (Pfaffl 2001;Guo and Ki 2012). 모든 반응은 3회 반복하였다.

    5. 활성산소종 (ROS) 측정

    세포 내 축적된 ROS을 분석하기 위해 Dihydroxyrhodamine- 123 (DHR-123, Sigma-Aldrich)을 사용하였다. DHR- 123는 전하를 띠지 않는 비형광 염료지만, ROS에 의해 산 화될 때 초록색으로 발광한다 (Qin et al. 2008). P. minimum 배양액에 0.5 및 1.0 mg L-1의 PRE를 24시간 동안 처리 후, 각 시료를 50 mL씩 수확하였다. f/2 배지를 제거해 농축 한 시료에 DHR-123의 최종 농도가 10 μM이 되도록 처리 후, 1시간 동안 암실 (20°C)에 정치하였다. 그 후, 각 시료를 신선한 f/2 배지로 2회 세척하고, 형광 현미경으로 관찰하 였다. 촬영한 형광 이미지를 기반으로 ImageJ 소프트웨어 (NIH, Bethesda, MD, USA)에서 세포당 ROS 수준을 분석 하였다.

    6. 데이터 통계 분석

    모든 실험 결과 수치는 3회 반복 실험의 평균값으로 표 시하였다. 실험의 대조군 (0.0 mg L-1)과 실험군 간의 비교 는 one-way analysis of variance (ANOVA)를 이용한 Tukey’s HSD을 사용하여 유의성을 분석하였다. 통계 프로그램은 SPSS software (version 20, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하였으며, p<0.05는 유의한 결과로 규정하였다.

    결과 및 고찰

    1. 세포 성장 및 색소에 미치는 생리적 영향

    PRE에 노출된 P. minimum의 개체 밀도와 색소를 관찰 하였다 (Fig. 1). 대조군 (0.0 mg L-1)은 72시간 배양 과정에 서 개체 밀도가 정상적으로 증가하였다. 0.01 mg L-1 처리군 은 노출 24시간 후 세포수가 감소하고 48시간에서 세포 성 장을 회복하였다. 0.1~50.0 mg L-1 처리군은 노출 농도 및 시간 의존적으로 세포 수가 감소하는 경향을 보였다. 72시 간의 PRE 노출 후, P. minimum의 색소 Chl a와 CARs는 농 도 의존적으로 감소했으며 대조군 대비 각각 최대 66.6% (50.0 mg L-1)와 39.4% (50.0 mg L-1) 감소하였다.

    세포 밀도를 기반으로 계산된 P. minimum에 대한 PRE의 EC50 값은 5.302 mg L-1로 계산되었다 (Table 1). EC50 비교 결과, 해양 와편모조류 P. minimum의 EC50는 담수 식물 Lemna minor (0.004~0.009 mg L-1), 담수 녹조류 Desmodes- mus subspicatus (0.062 mg L-1), Scenedesmus vaculatus (0.004 mg L-1), Selenastrum subcapitata (0.001~0.002 mg L-1)보다 높은 반면, 담수 규조류 Achnanthidium minutissimum (5 mg L-1)와 유사하고, 규조류 Nitzchia palea (15 mg L-1)보다 낮 았다. Chlorella sp.를 제외한 담수 녹조류가 PRE에 더 민감하 고, 남조류, 규조류, 와편모조류에 덜 민감한 경향을 보였다.

    EC50는 분석 지표 (세포 성장률, 색소, 엽상체 수 또는 면적), 배양 시간 (3~7일), 성장 조건 (온도, 빛, 염분, 영양 분)에 따라 달리 계산되며, 같은 종이라도 배양주에 따라 EC50가 다르다 (Kasai et al. 1993). 특히, 해수의 특성은 제 초제 성분 및 독성에 영향을 미칠 수 있다 (Sverdrup et al. 2001). 또한, 선행연구에서 alachlor와 metazachlor에 대한 P. minimum의 EC50는 각각 0.3 mg L-1와 0.6 mg L-1로 PRE보 다 낮았으나, 아세트아닐라이드계 제초제가 공통적으로 P. minimum의 성장을 저해하고 색소 감소를 유도한다 (Kim et al. 2020, 2021). 본 연구 결과는 담수 녹조류, 규조류, 남조 류와 해수 와편모조류를 포함한 광영양생물에게 독성 영 향이 있고, 다양한 해양 생물에게 유해한 영향을 미칠 수 있음을 시사한다 (Mohr et al. 2007, 2008).

    2. 광합성 지표 변화

    아세트아닐라이드계 제초제는 식물의 틸라코이드막을 포함한 세포막 지방산 합성 억제 및 광합성 저해 등 광계 에 다양한 영향을 미치는 것으로 보고되었다 (Trenkamp et al. 2004;Kim et al. 2020, 2021). 마찬가지로, PRE는 P. minimum의 광계 II 최대 양자수득률 (Fv/Fm), 최대 형광값 (Fm), 광계 II 광화학 성능지수 (PIABS)를 유의하게 감소시 켰다 (Fig. 2). Fv/Fm과 Fm은 0.01~1.0 mg L-1에서 대조군과 유사했으나, 10.0~50.0 mg L-1에서 유의하게 감소하였다 (p<0.001). 특히, PIABS의 경우 0.1 mg L-1부터 유의하게 감 소하고 (p<0.01), 10.0~50.0 mg L-1에서 검출되지 않았다 (p<0.001). 일반적으로 Fv/Fm은 광반응에서의 형광 수율 을 의미하며 (Strasser et al. 2000), PIABS는 에너지 전환 효 율에 근거한 식물의 활성을 판단 지표로 사용되고 있다 (Oukarroum et al. 2007). 이러한 결과는 고농도 (10.0~50.0 mg L-1)의 PRE 노출이 P. minimum의 광계 II 양자수득과 에 너지 전환을 저해하고, 저농도 (0.1 mg L-1)에서도 광계 II의 활성에 영향을 미친다는 것을 보여준다.

    아세트아닐라이드계 제초제는 고등 식물의 광합성에 영 향을 미치는 것으로 알려졌으며 (Ashton et al. 1977;Sloan and Camper 1986), 이는 제초제가 식물플랑크톤과 같은 비 표적 광영양생물의 광합성을 저해할 가능성을 제시한다. 실제로, 선행연구에서 metazachlor에 노출된 P. minimum은 다양한 광합성 지표가 감소하였고, 주사전자현미경 관찰 을 통해 세포 내 엽록체의 비분리 및 틸라코이드 막 와해가 관찰되었다 (Kim et al. 2021). 아세트아닐라이드계 제초제 가 세포막의 구성 요소인 VLCFA의 합성을 억제해 틸리아 코이드 막을 붕괴시킬 가능성이 있으며 (Wilkinson 1982;Götz and Böger 2004), 결과적으로 엽록체와 틸라코이드 구조의 기형은 세포의 광합성 저해로 이어진다 (Campbell et al. 2006). 따라서, 본 연구결과는 PRE 또한 광영양생물의 광합성 기관의 기형을 유도하고, 결과적으로 광합성을 감 소시킴을 제시한다.

    3. 상대적 유전자 발현 변화

    선행연구에서 아세트아닐라이드계 제초제가 광영양생 물에 미치는 생리적 영향에 대해 보고했으나 (Ashton et al. 1977;Wilkinson 1982;Sloan and Camper 1986;Götz and Böger 2004;Kim et al. 2020, 2021), PRE 노출에 의한 분자 생물학적 영향에 대한 연구는 아직 수행되지 않았다. 분자 생물학적 영향을 파악하기 위해, P. minimum에 서로 다 른 농도 (0.0, 0.01, 0.1, 0.5, 1.0 mg L-1)의 PRE를 24시간 및 72시간 처리 후, 광합성 관련 유전자 PmpsbA, PmpsaA, PmatpB, PmrbcL과 항산화 단백질 유전자 PmKatG, PmGST 의 상대적 발현율을 분석하였다 (Fig. 3).

    본 연구에 사용한 4개의 광합성 관련 유전자는 각각 광 계 II (PmpsbA), 광계 I (PmpsaA), ATP 합성 효소 (PmatpB), 루비스코 (PmrbcL) 단백질의 소단위체를 암호화하는 유전 자이며, 오염 물질을 포함한 환경 스트레스에 대한 바이오 마커로 알려져 있다 (Shapira et al. 1997;Levitan et al. 2010). 특히, psbA는 광계 II의 D1 단백질을 암호화하는데, 스트레 스에 의해 D1 단백질이 손상되었을 때 교체를 위해 psbA 발 현이 조절된다 (Qian et al. 2011;Sakurai et al. 2012;Guo et al. 2017). PRE 노출 결과, P. minimum의 PmrbcL의 유전자 발 현에는 유의한 변화가 없었으나, 24시간 노출 시 0.01~0.5 mg L-1 처리군에서 감소했다 (p<0.01). 반면 PmpsbA, PmpsaA, PmatpB는 24시간의 1.0 mg L-1 (p<0.001), 72 시간의 0.1 mg L-1 (p<0.001), 0.5 mg L-1 (p<0.05) 처 리군에서 발현율이 유의하게 증가했다. 이는 PRE 노출 (1.0 mg L-1) 24시간 후 틸라코이드 막의 광합성 단백 질에 영향을 미치지만, 루비스코가 관여하는 탄소 고정 에는 영향이 없음을 제시한다. 유사한 사례로 광합성을 억 제하는 제초제 atrazine은 고등 식물 Arabidopsis의 psbA 발 현과 D1 단백질을 증가시켰다 (Sulmon et al. 2004). 또한, 선행연구에서 살조 효과가 높은 염소와 CuSO4, alachlor, metazachlor에 노출된 P. minimum의 psbA 발현율이 유의하 게 증가하였다 (Guo et al. 2017;Kim et al. 2020, 2021). 게 다가, 광합성 지표 Fv/Fm은 10.0 mg L-1부터 감소한 반면, PmpsbA, PmpsaA의 상대적 유전자 발현율은 1.0 mg L-1부 터 발현율이 3배 이상 증가하였다 (p<0.001). 이는 PRE가 광영양생물의 광합성 단백질을 손상시키며, 노출 24시간부 터 영향을 미친다는 것을 보여준다.

    대부분의 생물은 다양한 항산화 효소로 다양한 형태의 ROS로부터 세포를 보호한다 (Urso and Clarkson 2003). 그 중 glutathione S-transferase (GST)와 catalase-peroxidase (KatG)는 해양 와편모조류 P. minimum에서 주로 연구된 대표적인 항산화 단백질이다 (Guo and Ki 2013;Guo et al. 2014). 그리고 GST는 외래 물질과 glutathione (GSH)의 결 합을 촉매하여 해독하는 활성을 가졌다 (Hayes and Pulford 1995). GST와 KatG는 ROS, 오염 물질 등 다양한 스트레 스에 의해 유도될 수 있기 때문에, 이를 암호화하는 유전자 는 산화 및 독성 물질에 대한 바이오 마커로 사용되고 있다 (Guo et al. 2014;Kim et al. 2021). 실험 결과, PRE 노출에서 PmKatG의 발현율에 변화가 없었으나, PmGST의 발현율 은 노출 72시간 후 0.1~1.0 mg L-1 처리군에서 최대 6배 이 상 증가했다 (p<0.001). 이는 P. minimum의 세포 내 항산화 단백질 GST 합성이 PRE에 의해 증가했으며, 오염 물질의 무독화 과정에서 유도되었을 가능성이 더 높음을 보여준 다. GST의 과발현은 제초제에 대한 내성을 향상시키는 것 으로 알려졌으며 (Milligan et al. 2001;Benekos et al. 2010), 선행연구에서 아세트아닐라이드계 제초제 acetochlor와 metolachlor는 Arabidopsis의 GST에 의해 GSH 결합되어 액포에 격리되는 것으로 보고하였다 (Mezzari et al. 2005). 이러한 메커니즘은 alachlor, metazachlor에 노출된 P. minimum에서도 동일하게 확인되었고 (Kim et al. 2020, 2021), PRE 또한 GST에 의해 해독되지만 유전자의 발현 시기와 농도는 제초제에 따라 다름을 제시한다.

    4. 활성산소 Pretilachlor에 의한 ROS 축적

    PmGST와 PmKatG 유전자 발현과 관련하여, PRE가 P. minimum의 세포 내 ROS 축적을 유도하는지 DHR-123 형 광 이미지를 통해 확인하였다 (Fig. 4). 0.5 및 1.0 mg L-1 의 PRE를 24시간 노출한 결과, 1.0 mg L-1를 처리한 P. minimum의 액포 크기가 거대해졌으며, 이는 아세트아닐라 이드계 제초제에 노출된 Arabidopsis에서도 동일한 경향이 확인되었다 (Mezzari et al. 2005). 또한, P. minimum에 축적 된 ROS는 대조군에 비해 2배 이상 증가하였다 (p<0.001). 선행연구도 마찬가지로, alachlor와 metazachlor는 세포 내 ROS 생성을 유도하였으며 (Kim et al. 2020, 2021), 고농도 의 metolachlor 노출은 녹조류 Pseudokirchneriella subcapitata의 ROS, 지질 과산화 및 세포막 손상을 초래하였다 (Machado and Soares 2021). 따라서, P. minimum의 ROS 축 적은 PRE에 의한 전자 전달 메커니즘이 붕괴된 광합성 저 해에 의한 스트레스 반응으로 추정된다. 본 연구 결과는, 아 세트아닐라이드계 제초제가 GST에 의해 해독 메커니즘을 거치지만, 고농도 또는 장기간 노출은 광합성 저해와 ROS 축적 및 세포 사멸까지 유발한다는 것을 시사한다.

    적 요

    Pretilachlor (PRE)는 전 세계적으로 사용되는 아세트아 닐리드계 제초제이며 수생 광영양생물에 미치는 영향에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 본 연구에서 해양 와편모 조류 P. minimum를 대상으로 PRE의 생리적, 분자적 독성 영향을 평가하였다. 그 결과, PRE는 P. minimum의 성장률, 색소, 광합성 지표를 유의하게 감소시켰다. 또한, 광합성 관 련 유전자 PmpsbA, PmpsaA 및 항산화 단백질 PmGST의 상 대적 유전자 발현율과 세포 내 ROS 증가가 유의하였다. 이 는 PRE가 P. minimum의 광합성 효율 저하 및 광계 손상을 야기하며, GST가 세포 내 산화 스트레스 및 PRE의 무독화 에 관여함을 보여준다. 본 연구 결과는 PRE를 비롯한 아세 트아닐라이드계 제초제가 해양 와편모조류의 세포 독성을 야기하며, 광합성 저해가 스트레스의 주요 원인임을 제시 한다. 다른 아세트아닐라이드계 제초제가 비표적 광영양 생물에게 미치는 독성 영향은 아직 연구가 부족하므로, 향 후 연구에서 다양한 생물종을 대상으로 추가 연구가 필요 하다.

    사 사

    이 논문은 2020년도 정부 (미래창조과학부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임 (No. 2020R1A2C2013373).

    Figure

    KJEB-39-4-452_F1.gif

    Variation in cell density of Prorocentrum minimum at different time intervals after pretilachlor (PRE) treatment (A), and changes in pigments level after 72 h of PRE treatment (B).

    KJEB-39-4-452_F2.gif

    Effect of pretilachlor (PRE) on the photosystem of Prorocentrum minimum. Variations in photosynthesis efficiency (Fv /Fm) at different time intervals (A), and maximum fluorescence and PIABS after 72 h of exposure (B). Significant differences between the control and treated samples, as determined by one-way ANOVA, are highlighted **p<0.01 and ***p<0.001.

    KJEB-39-4-452_F3.gif

    Effect of pretilachlor (PRE) on photosynthesis-related gene expression after 24 h (A) and 72 h (B) of treatment, and antioxidant gene expression after 24 h (C) and 72 h (D) of treatment. Significant differences between the control and treated samples, as determined by one-way ANOVA, are highlighted *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001.

    KJEB-39-4-452_F4.gif

    Bright-field image and dihydrorhodamine-123 (DHR-123) staining image of Prorocentrum minimum after 24 h of pretilachlor (PRE) treatment (A) and mean reactive oxygen species (ROS) levels (B). Scale bars represent 20 μm and a significant difference between the control and treated samples, as determined by one-way ANOVA, is highlighted ***p<0.001.

    Table

    The effective concentration values of photosynthetic organisms after exposed to pretilachlor

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    Journal Abbreviation 'Korean J. Environ. Biol.'
    Frequency quarterly
    Doi Prefix 10.11626/KJEB.
    Year of Launching 1983
    Publisher Korean Society of Environmental Biology
    Indexed/Tracked/Covered By

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