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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean J. Environ. Biol. Vol.40 No.3 pp.255-266
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2022.40.3.255

Molecular characterization of juvenile hormone signaling pathwayrelated genes in the brackish water flea Diaphanosoma celebensis

Hayoung Cho, Jewon Yoo, Young-Mi Lee*
Department of Biotechnology, College of Convergence Engineering, Sangmyung University, Seoul 03016, Republic of Korea
* Corresponding author Young-Mi Lee Tel. 02-2287-5448 E-mail. ymlee70@smu.ac.kr
28/07/2022 25/08/2022 29/08/2022

Abstract


In crustaceans, molting is regulated by interactions between ecdysteroid and juvenile hormone (JH) signaling pathway-related genes. Unlike the ecdysteroid signaling pathway, little information on the role of JH signaling pathway-related genes in molting is available in zooplanktonic crustaceans. In this study, three genes (juvenile hormone acid O-methyltransferase (JHAMT), methoprene-tolerant (Met), and juvenile hormone epoxide hydrolase (JHEH)) which are involved in the synthesis, receptor-binding, and degradation of JH were identified using sequence and phylogenetic analysis in the brackish water flea, Diaphanosoma celebensis. Transcriptional changes in these genes during the molting cycle in D. celebensis were analyzed. Sequence and phylogenetic analysis revealed that these putative proteins may be functionally conserved along with those of insects and other crustaceans. In addition, the expression of the three genes was correlated with the molting cycle of D. celebensis, indicating that these genes may be involved in the synthesis and degradation of JH, resulting in normal molting. This study will provide information for a better understanding of the role of JH signaling pathwayrelated genes during the molting process in Cladocera.


Juvenile hormone pathway , brackish water flea , gene expression , molting cycle , sequence analysis

기수산 물벼룩의 유충 호르몬 (Juvenile hormone) 신호전달경로 관련 유전자의 특성 분석

조 하영, 유 제원, 이 영미*
상명대학교 융 합공과대학 생명공학과

초록

    서 론

    탈피 (molting) 과정은 절지동물의 정상적인 성장, 발 달, 생식에 중요하다 (Žitňan et al. 2007). 곤충에서 탈피는 ecdysteroid와 juvenile hormone (JH) 신호전달경로 관련 유 전자의 상호 작용을 통해 조절된다 (Miyakawa et al. 2018). 내분비계에 영향을 미치는 다양한 외부 스트레스 요인에 노출되면 두 경로에 속하는 유전자의 발현이 변화하고, 이 는 탈피 주기에 변화를 유도함으로써 결과적으로는 개체 의 성장, 발달과 생식에 악영향을 끼친다 (Palli et al. 2000).

    JH 합성은 전구물질인 farnesyl pyrophosphate (farnesyl- PP)가 farnesoic acid (FA)로 변형된 후 FA는 juvenile hormone acid O-methyltransferase (JHAMT)에 의해 methyl farnesoate (MF)로 전환된다 (Rivera-Perez et al. 2014). 곤충 에서는 MF가 methyl farnesoate epoxidase (MFE)에 의해 active form인 JH III로 전환되고 이후 JH III에서 변형된 JH diol이 JH receptor와 결합하여 downstream 유전자의 발현 을 조절하는 것으로 알려져 있다 ( Jiang et al. 2017). 그러나 기존 연구와 비교 시 갑각류에는 MFE를 암호화하는 유전 자 서열이 존재하지 않는 것으로 확인되었다 (Daimon and Shinoda 2013). 따라서 갑각류에서는 곤충과 달리 JH III 로의 변형 없이 MF가 JH의 최종 active form인 것으로 추 정된다 (Sin et al. 2015). 최근까지 갑각류에서 ecdysteroid 는 탈피를 조절하는 대표적인 호르몬으로 관련 경로의 유 전자 동정과 탈피에서의 역할 등에 대한 연구가 활발하게 이루어진 것 (Kato et al. 2007;Nakagawa and Henrish 2009;Miyakawa et al. 2018)과 달리 JH의 역할과 관련 경로 유전 자들의 정보나 생활사에서의 역할과 ecdyteroid 신호전달 경로와의 상호 작용에 대한 연구는 매우 부족한 실정이다. 특히 갑각류에서 탈피는 내분비계 교란 특성을 갖는 환경 오염물질을 검출하기 위한 바이오마커로 사용되고 있기 때문에 (Giraudo et al. 2017;Chen et al. 2021), 탈피에 영향 을 미치는 내분비계에 대한 분자 수준의 연구가 필요하다.

    기수산 물벼룩인 Diaphanosoma celebensis는 절지동물문 (Arthropoda), 갑각강 (Crustacean), 지각목 (Cladocera)에 속하며 해양생태계에서 1차 소비자이며 상위 영양단계에 에너지 전달자로서 중요한 역할을 담당한다. 배양이 쉽고, 생활사가 짧으며 (4~5일), 단성생식 (parthenogenesis)을 하는 등 모델 생물로서의 장점을 가지고 있어 생태독성연 구에 사용되고 있다 (Marcial and Hagiwara 2007;Kim et al. 2018;Kim et al. 2021). 최근 D. celebensis에서 ecdysteroid 신 호전달경로에 관여하는 cyp314a1, ecdysone receptor (EcR), HR3, E75 등과 같은 유전자가 확인되었고, 탈피 주기와 관 련이 있음을 보고한 바 있다 (In et al. 2019, 2020, 2021).

    본 연구에서는 기수산 물벼룩에서 JH 신호전달경로 관 련 유전자를 동정하고, 탈피 주기에서의 이들 유전자의 발 현 패턴을 비교하여 그 역할을 확인하였다. 이는 지각류에 서 JH 신호전달경로 유전자의 탈피 관련 기능을 이해하는 데 도움이 될 것이다.

    재료 및 방법

    1. 시험생물

    본 연구에서 실험생물로 사용한 기수산 물벼룩 (Diaphanosoma celebensis)은 상명대학교 분자독성학실험실에서 배양하고 있는 것을 사용하였다. 배양액은 해수염 (Instant Ocean, Aquarium systems, Sarrebourg, France)을 증류수에 녹인 후 0.2 μm 필터로 걸러 15 psu의 인공해수를 제조하 여 사용하였다. 사육 조건은 수온 25±1°C, 광주기 12 : 12 (light : dark)로 유지하였고, 먹이는 Chlorella vulgaris를 1.0~3.0×105 cells mL-1의 밀도로 매일 공급하였다.

    2. 유전자서열 및 계통분석

    기수산 물벼룩의 JH 신호전달경로 유전자 (JHAMT, Met, and JHEH)는 D. celebensis RNA seq. local transcriptome database (상명대학교 분자독성학실험실) (Kim et al. 2018) 에서 얻었다. Sequence identity는 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 blast X search tool을 사 용하였고, conserved domain은 NCBI의 conserved domain searching site (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi)를 통해 분석하였다. 계통 분석을 위해 Clustal X (version 1.83)를 이용하여 다중배열을 수행한 후 MEGA (version 6.0)에서 neighbor-joining (NJ) 방법으로 분석 하였다. 계통 분석에서 bootstrap은 1,000회 반복하였고, p-distance model을 사용하였다. 서열 및 계통 분석에 사용 한 생물의 GenBank accession number는 Table 1에 나타냈 다.

    3. RNA 추출 및 cDNA 합성

    탈피 주기에 따른 JH 신호전달경로 유전자의 발현 양상 을 분석하기 위하여 태어난 지 4일 된 기수산 물벼룩 개체 (약 150마리/시료)를 6일간 24시간마다 eppendorf tube 에 모았다. 시료는 Trizol® reagent (Thermo Fisher Scientific Inc., Ambion, MA, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 1% 아가로즈 겔 전기영동과 MaestroNano Spectrophotometer (Maestrogen Inc., Hsinchu, Taiwan)을 이용하여 정량하고 순도 측정을 하였고, A260/A280 비율이 1.8~2.0인 RNA만을 실험에 사 용하였다. cDNA는 0.5 μg RNA를 이용하여 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo Co., Osaka, Japan)를 이용하 여 제조사의 방법에 따라 합성한 후 1/10배 희석하여 사용 하였다.

    4. Quantitative real time reverse transcription - polymerase chain reaction (qRT-PCR)

    qRT-PCR은 KAPA SYBR FAST (Kapa Bioassay systems, MA, USA)를 이용하여 CFX96 real-time PCR system (Bio- Rad Inc., Hercules, CA, USA)에서 진행하였다. 타겟 유전 자의 증폭을 위해 사용된 primer는 primer test를 통해 특이 성을 확인하였고, PCR efficiency (90~105%)와 각 서열 정 보는 Table 2에 나타냈다. 각 PCR mixture는 primer set (각 10 pmol), cDNA 3 μL, 그리고 2×SYBR premix (5 μL)을 포 함하여 최종 용량을 10 μL로 제조하였다. PCR의 반응 조 건은 95°C 10분; 95°C 15초, 60°C 1분을 35회 반복하였고, 특이적인 반응산물의 확인을 위하여 melting curve를 얻고 자 95°C에서 15초, 60°C에서 1 min 반응시키며 초당 0.5°C 씩 올려 반응을 진행하였다. 타겟 유전자의 threshold cycle (Ct) 값은 EF-1b 유전자 (Lee et al. 2021)로 보정하였고, 각 실험은 3회 반복하였다.

    5. 통계분석

    데이터는 평균 (mean)±표준편차 (standard deviation; S.D.)로 표시하였다. 통계적 유의성은 Sigmaplot version 12.0 (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)를 이용하여 t-test로 비교하였다. 분석 결과 p 값이 0.05보다 낮은 경우 통계적으로 유의하다고 판정하였다.

    결과 및 고찰

    1. 유충호르몬 (JH) 신호전달경로 관련 유전자의 확인

    본 연구에서는 JH 신호전달경로 관련 유전자 중 JHAMT, Met 그리고 JHEH 유전자를 동정하였다. JHAMT는 JH 신 호전달경로에서 FA에서 JH III로의 methylation에 작용하 며 곤충에서 최종 산물인 JHs 생합성에 관여하는 효소로 알 려져 있다 (Shinoda and Itoyama 2003). 지금까지 JHAMT 는 주로 곤충에서 알려져 있었으나 최근 갑각류인 Daphnia pulex (Hui et al. 2010)를 비롯하여 Neocaridina denticulate (Sin et al. 2015)에서도 발견되면서 곤충에서와 달리 갑각 류에서는 JHAMT가 FA에서 MF로의 methylation에 작용 하며 최종산물인 MF 생합성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Defelipe et al. 2011).

    유전자 분석 결과 D. celebensisJHAMT (Dc_ JHAMT)의 cDNA 서열은 147 bp의 5′-UTR, 810 bp의 open reading frame (ORF), 54 bp의 3′-UTR로 구성되어 있으며, 269개 의 아미노산을 암호화한다. Dc_ JHAMT 아미노산 서열을 Blast X로 분석한 결과 Daphnia magna의 JHAMT 단백질 (XP_032780651.1)과 44%로 가장 높은 시퀀스 상동성을 보였다. Conserved domain searching 결과 Dc_ JHAMT는 S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases (Ado- Met-MTases or SAM) domain (37-124 aa)을 가지고 있으며 B. mori의 JHAMT과 같이 잘 보존된 SAM-binding motif (E/DXGXG/AXG)를 확인하였다 (Martin and McMillan 2002;Guo et al. 2021). 이는 절지동물의 JHAMT에서 공통 적으로 발견되는 domain으로 AdoMet-MTase는 methyltransfer를 위해 AdoMet를 기질로 사용하여 S-adenosyl- L-homocysteine (AdoHcy) product를 생성하는 효소이다. AdoMet-MTases domain에는 기질인 S-adenosylmethionine 이 결합하는 S-adenosylmethionine binding site가 고도로 보존되어 있는 것으로 알려져 있다 (Li et al. 2013). 본 연구 에서도 AdoMet-MTases domain 내 S-adenosylmethionine binding site는 특히 절지 동물 간에 비교적 잘 보존되어 있 었다 (Fig. 1A). 계통 분석 결과 Dc_ JHAMT는 다른 갑각류 의 JHAMT와 함께 cluster를 이루었으며 같은 지각류인 담 수산 물벼룩 D. magna의 JHAMT와 가장 가까이 위치하였 으며 대형 갑각류와는 서로 구분되었다 (Fig. 1B).

    Met는 JH receptor로 알려져 있으며, 하위 유전자의 JH response elements ( JHRE)에 결합함으로써 JH 신호를 전달 하는 중요한 역할을 담당한다 (Miura et al. 2005;Zhu et al. 2010). 본 연구에서 Dc_Met cDNA partial 서열은 820 bp의 5′-UTR와 1,753 bp의 ORF로 구성되어 있으며 584개의 아 미노산을 암호화하는 것으로 나타났다. Blast X searching 결 과 D. magna의 methoprene-tolerant 단백질 (BAM83855.1) 로 총 695개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 40%의 시 퀀스 상동성을 보였다. Dc_Met 유전자의 N-terminal의 584 개 아미노산을 부분적으로 확보하였음에도 불구하고 D. magna의 Met 단백질과 비교하면 약 100개의 아미노산이 부족함에도 불구하고 해당 단백질의 conserved domain이 주로 N-terminal 부근에 위치하고 있기 때문에 유전자 동 정이 가능하였다. Met는 bHLS-PAS family에 속하는 단백 질로서 JH 신호전달경로에서 최종 생성물인 MF와 결합 하는 수용체로 알려져 있다 ( Jindra et al. 2013). Conserved domain searching 결과 Dc_Met 아미노산 서열은 bHLSPAS family protein에 존재하는 bHLS-PAS domain (10-62 aa)을 비롯하여 2개의 Per-Arnt-Sim (PAS) domain (PAS-A, 110-185 aa; PAS-B, 255-359 aa)이 잘 보존되어 있는 것으로 확인되었다 (Fig. 2A). 특히 PAS-B domain에는 고도로 보존 된 8개의 소수성 아미노산 잔기 (Tyr256, Thr258, Ile266, Val284, Ser301, Leu320, Ser332, Cys349)는 ligand binding site를 나타낸 다 (Miyakawa et al. 2013;Li et al. 2021). 이들 중 6개의 잔 기는 JH-binding pocket을 형성하는 데 관여하는 것으로 알려져 있다 (Li et al. 2011). 최근 Daphnia Met에서 PAS-B domain 내 나머지 2개의 잔기에서 아미노산 치환이 보고 된 바 있다 (Miyakawa et al. 2013). Fig. 2A의 PAS-B domain 의 다중배열에서 보여지는 것처럼 보존된 잔기 중 5번째 위치가 곤충에서 Valine이나 Daphnia에서는 Threonine으 로 치환되었다. 그러나 D. celebensis와 십각류에서는 Serine (Ser301)으로 치환된 것을 확인할 수 있다. 한편 7번째 잔기 의 경우 곤충에서는 Threonine인데, D. celebensis를 포함한 갑각류에서는 모두 Serine (Ser332)으로 치환된 것을 확인할 수 있었다. Miyakawa et al. (2013)은 PAS-B domain 내에 이 러한 한 개 또는 두 개의 아미노산 변이가 곤충과 갑각류 간에 ligand에 대한 Met의 결합 특이성의 차이에 기여했을 것으로 추정하였다. 계통 분석을 진행한 결과에서도 Dc_ Met는 같은 지각류인 Daphnia sp.와 가장 가깝게 cluster를 형성하였다 (Fig. 2B).

    JHEH는 곤충에서 성장, 발달, 탈피 및 번식이 진행되는 동안 JH 분해에 중요한 역할을 하는 효소이다 (Zhang et al. 2005;Mackert et al. 2010). 또한 JHEH는 microsomal epoxide hydrolase (EC 3.3.2.9) family에 속하며 epoxide hydrolases (EHs) 중에서 넓게 분포하는 family 중 하나이다 (Zhou et al. 2014). 특히 EHs는 epoxides를 변형시켜 그 화학적 활 성을 줄이고, 용해도를 높임으로써, 생물학적 활성을 변형 시키는 역할을 한다 (Arand et al. 2005). 최근 JHEH는 갑각 류에서도 곤충에서와 유사한 방식으로 작용할 것으로 추 정되고 있다 (Hyde et al. 2019).

    본 연구에서 Dc_ JHEH cDNA는 442 bp의 5′-UTR, 1,350 bp의 ORF, 그리고 93 bp의 3′-UTR로 이루어져 있으며, 449 개의 아미노산을 암호화한다. Conserved domain searching 을 통해 Dc-JHEH가 고도로 보존된 2개의 domain, epoxide hydrolase N-terminus (EHN) domain (47-156 aa)과 alpha/ beta hydrolase fold인 Abhydrolase domain (142-382 aa) 를 가지고 있음을 확인하였다. Dc_ JHEH는 다른 생물의 JHEH에서 공통적으로 보존된 motif인 “HGWP”를 가지고 있으며, 3개의 catalytic residues인 Asp222, His425, Glu398과 2개의 tyrosine 잔기 (Tyr293, Tyr369)를 가지고 있었다 (Fig. 3A).

    특히 JHEH에서 공통적으로 발견되는 N-terminal membrane anchor motif인 “WWG”는 고등한 생물에서는 잘 보 존되어 있는 반면, 균류, 원핵생물, 원생생물에서는 발견되 지 않는 것으로 알려져 있다 (Zhou et al. 2014). 그러나 본 연구에서 다중배열 결과 “WWG” motif는 곤충류와 대형 갑 각류에서는 잘 보존되어 있으나, D. celebensis를 포함하는 소 형 갑각류인 지각류에서는 “WWS” 형태로 변형되어 있었 다. “WWG” motif는 JHMH가 존재하는 소포체 막에 결합 하는 anchor로서 기능하는 것으로 알려져 있다 (Gilbert et al. 2000). 따라서 변형된 motif를 갖는 Dc_ JHEH가 transmembrane domain을 갖는지 알아보기 위해 TMHMM 2.0 분석을 한 결과 “WWG”를 갖는 Bombyx mori (Zhou et al. 2014)와 Lymantria dispar (Wen et al. 2018)의 JHEH와 같이 N-terminal signal sequence를 가지고 있는 것으로 나타났다 (Fig. 3B).

    또한 잘 보존되어 있는 catalytic triad와 2개의 tyrosine 잔기는 α/β hydrolase 효소에서 전형적으로 나타나는데 epoxide ring의 산소 원자에 양성자를 제공하며 안정하게 해 주는 역할을 한다 (Yamada et al. 2000). 추가로 “HGWP” motif는 Trp149의 주 사슬의 질소와 친핵성 잔기인 Asp227 사이에 수소결합을 형성하면서 촉매 작용을 용이하게 해 주는 역할을 한다 (Zhou et al. 2014). 따라서 본 연구 결과 Dc-JHEH는 α/β hydrolase 효소로서 막 결합 단백질임을 알 수 있다. 계통 분석 결과는 다른 두 유전자와 마찬가지 로 지각류 JHEH가 함께 clustering되었으며 갑각류의 clade 는 곤충의 것과 뚜렷하게 구분되었다 (Fig. 3C).

    아미노산 서열 분석 및 계통 분석 결과를 통해 D. celebensis의 JH 경로 관련 유전자 JHAMT, Met 그리고 JHEH는 갑각류 및 곤충의 해당 단백질과 기능적으로 유사할 것으 로 추정된다. 이러한 결과는 이들 유전자가 D. celebensis의 탈피와 발생 및 생식에 관여할 것임을 제시한다.

    2. 탈피 기간 동안 JH 신호전달경로 관련 유전자 발현 변화

    JH는 20-hydroxyecdysone (20E)와 함께 곤충과 갑각류 의 탈피와 변태 과정을 조절하는 중요한 역할을 담당한다 (Wen et al. 2015). 20E는 탈피와 변태를 촉진하는 역할을 하고, JH은 유충에서 성체로의 발생을 억제하는 역할을 한 다 (Riddiford et al. 2003). D. celebensis의 탈피 주기는 성적 성숙 이전에는 매일 진행되지만 성적 성숙 이후에는 2일에 한 번씩 일어난다고 알려져 있다 (Segwa and Yang 1990). In et al. (2019)은 본 연구와 유사한 배양 조건에서 5일과 7~8 일에 탈피가 관찰되었다고 보고한 바 있다. 그 결과 대표적 인 탈피 호르몬인 20E의 합성을 촉매하는 cyp314A1 유전 자와 20E의 수용체인 EcR의 유전자 발현이 5일과 7~8일 차에 최대 발현량을 보임으로써 탈피 주기와 관련이 있다 고 보고하였다. 그러나 갑각류에서 탈피 주기에 따른 JH 경 로 유전자의 발현 양상은 연구가 매우 드물다.

    본 연구에서는 JH 경로에 관여하는 JHAMT, Met, 그리고 JHEH 유전자의 탈피 주기 내에서의 발현 양상을 추가로 조사하였다. JH 생합성 경로에 관여하는 JHAMT 유전자의 발현은 20E 합성에 관여하는 cyp314A1 유전자와 유사한 양상을 보였으며 D. celebensis의 탈피 주기와 일치하는 경향 을 보였다 (Fig. 4A). 한편 MF의 잠재적 수용체인 Met 유전 자의 발현은 탈피와 탈피 사이에 발현이 증가하는 양상을 보였다 (Fig. 4B). MF 분해를 통해 체내 MF 농도 유지에 중 요한 역할을 하는 JHEH 유전자의 경우 JHAMT 유전자가 최대 발현량을 나타내는 5일 이후 증가하였다가 점차 감소 하는 양상을 보였다 (Fig. 4C).

    MF 유사체인 [3H]-farnesyl diazoketone binding activity 실험 결과 Lobster hemolymph에서 탈피 주기 동안 MF binding activity가 탈피 후에 감소하다가 다음 탈피가 일 어나기 전까지 점차 증가하는 양상을 보인 바 있다 (Chang et al. 1993). 이와 함께 본 연구에서 MF 합성을 담당하는 JHAMT 유전자의 발현이 탈피 주기와 일치하는 경향을 보 임으로써 MF가 탈피에 관여한다는 것을 알 수 있다. 한편, D. melanogaster의 JHAMT 유전자의 knockdown 실험 결 과 변태 과정을 방해하여 개체의 치사를 유도한 바 있으 며 (Niwa et al. 2008), Tribolium castaneaum에서 JHAMT의 RNA interference 실험의 결과에서도 3령기 개체에서 변태 과정이 촉진된다고 보고된 바 있다 (Minakuchi et al. 2008). 따라서 JHAMT가 JH 생합성에 관여함으로써 탈피 조절 뿐만 아니라 정상적인 발생과정에도 중요한 역할을 한다 (Guo et al. 2021).

    Met는 ecdysteroid receptor (EcR)와 retinoid X receptor (RXR)과도 반응할 수 있어서 엑디손 신호 전달을 조절함 으로써 탈피와 변태를 유도하는 데 관여할 수 있다 (Shin et al. 2015). B. mori에서 Met RNAi 실험 결과 조직의 재형 성이 억제되면서 20E에 의해 조절되는 경로가 억제되고, 개체의 치사를 유도한 바 있다 (Guo et al. 2012). 한편 Lepidopteran Helicoverpa armigera의 Met1 유전자의 발현이 탈 피 시기보다는 탈피와 탈피 중간 시기에서 더 높은 발현 양 상을 보여 Met1 유전자가 유충의 발생 시기 동안에 조절된 다고 제시하였다 (Li et al. 2021). 이러한 결과는 본 연구 결 과와 일치하였다. 또한 저자들은 20E와 JH III가 Met1 유 전자의 발현을 증가시킬 수 있으며, 20E의 농도가 더 높아 지면 Met1의 발현이 오히려 억제되는 양상을 보임으로써 Met1의 유전자 발현이 JH와 20E에 의해 조절된다고 제시 하였다. 이러한 결과는 탈피 과정 중 JH와 20E의 cross-talk 를 의미한다 (Li et al. 2019).

    JHEH는 세포 내 JH의 농도를 조절하는 역할을 담당한 다. Lymantria dispar 3령기 유충에서 JHEH1 유전자의 발현 을 12시간마다 확인한 결과 가장 높은 발현이 탈피 후 12~ 24시간에서 관찰된 후 120시간까지 점차 감소하는 양상을 보였다 (When et al. 2018). 유사한 결과가 B. mori JHEH에 서도 관찰된 바 있으며 (Zhang et al. 2005), 본 연구 결과도 이와 같이 탈피 후 증가했다가 점차 감소하는 양상을 보였 다. 완전 변태를 하는 곤충에서 높은 농도의 JH는 유충의 탈피 과정을 유도한다고 알려져 있으며 (Dubrovsky 2005), 따라서 JHEH의 발현량의 감소는 JH의 양을 증가시켜 탈 피를 유도할 것으로 추정된다 (When et al. 2018). 또한 갑 각류에서는 탈피가 일어나기 전에 점차적으로 MF와 엑디 손 양이 증가하다가 탈피 시기 근처에서 최대치에 도달한 후 MF와 엑디손이 빠르게 감소되는데 이는 성공적으로 탈 피가 이루어지는 데 결정적인 요소가 된다 (Lee et al. 1998). 이에 따라 본 연구에서 D. celebensis JHEH 유전자 발현이 탈 피 시기부터 점차 증가하여 탈피가 이루어진 이후 가장 높 게 발현된 결과는 이 시기에 JH의 양을 빠르게 감소시킴으 로써 정상적인 탈피가 이루어지는 데 기여했을 것으로 추 정된다. 한편 상기 곤충과 갑각류에서 보이는 탈피 기간에 따른 JHEH의 발현 양상의 차이는 생물 간의 탈피 및 유충 발생의 시기의 차이에 따라 서로 다른 시료 채집 시기에 영 향을 받을 수 있다 (Chen et al. 2021). 따라서 탈피 및 발생 시기에 따른 JH 경로 관련 유전자의 정확한 역할을 이해하 기 위해 추가적인 연구가 필요하다.

    본 연구에서는 기수산 물벼룩 D. celebensis의 JH 신호전달 경로에 관여하는 JHAMT, Met 그리고 JHEH 유전자의 서열 분석과 계통 분석을 실시하고, 탈피 주기에 따른 이들 유전 자의 역할을 이해하고자 유전자발현 분석을 추가로 진행 하였다. D. celebensis의 JH 관련 유전자는 잘 보존된 domain 을 가지고 있었으며, 아미노산 서열 분석과 계통 분석을 통 해 곤충 및 갑각류의 해당 유전자와 기능적으로 유사할 것 으로 나타났다. 또한 D. celebensis의 탈피 주기에 따른 세 유 전자의 발현변화 결과를 통해 이들 유전자가 JH 합성 및 분해에 관여함으로써 성공적인 탈피에 기여할 것임을 제 시하였다.

    적 요

    갑각류에서 탈피는 ecdysteroid와 juvenile hormone (JH) 신호 경로에 관여하는 유전자의 상호작용에 의해 조절된 다. Ecdysteroid와 달리, 탈피 과정에서 JH 신호 경로 유전 자의 역할은 부유성 갑각류에서는 잘 알려져 있지 않다. 본 연구는 기수산 물벼룩 (Diaphanosoma celebensis)의 JH 신호 경로에서 JH 합성, 수용체, 분해 등에 관여하는 3종의 유전 자 (JHAMT, Met, JHEH)의 염기서열 분석과 계통 분석을 실시하였다. 또한 탈피 주기에서 이들 유전자의 mRNA 발 현양상을 분석하였다. D. celebensis의 JH 관련 유전자는 잘 보존된 domain을 가지고 있었으며, 아미노산 서열 분석과 계통 분석 결과는 이들 단백질이 곤충 및 다른 갑각류의 해 당 단백질과 기능적으로 유사한 특징을 나타낸다. 또한 탈 피 주기에 따른 유충 호르몬 (JH) 신호전달경로 관련 유전 자의 발현변화 결과를 통해 이들 유전자가 JH의 합성 및 분 해에 관여함으로써 D. celebensis에서 성공적인 탈피에 기여 할 것임을 제시하였다. 본 연구는 지각류에서 탈피 주기에 서 JH 경로 유전자의 역할을 이해하는 데 도움이 될 것이다.

    사 사

    본 연구는 한국연구재단 과제 (NRF-2020R1F1A1069 736) 연구비 지원을 받아 수행하였다.

    Figure

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    (A) Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of the AdoMet-MTase domain of Diaphanosoma celebensis JHAMT with those of insects and other crustaceans. The red boxes indicate the S-adenosylmethionine binding site. (B) Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of Diaphanosoma celebensis JHAMT and those of insects and other crustaceans. The tree was constructed with 1,000 bootstrap replicates.

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    (A) Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of bHLS_PAS, PAS-A, and the PAS-B domain of Diaphanosoma celebensis Met with those of insects and other crustaceans. Red triangles indicate ligand-binding sites, and red boxes are modified residues. (B) Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of Diaphanosoma celebensis Met and those of insects and other crustaceans. The tree was constructed with 1,000 bootstrap replicates.

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    (A) Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of Diaphanosoma celebensis JHEH with those of insects and other crustaceans. The red boxes indicate the conserved motif. Red asterisks and black triangles are typically conserved residues. (B) Transmembrane domains of JHEH in D. celebensis predicted using TMHMM 2.0. (C) Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of Diaphanosoma celebensis Met and those of insects and other crustaceans. The tree was constructed with 1,000 bootstrap replicates.

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    Relative mRNA expression of JHAMT (A), Met (B), and JHEH (C) during molting in Diaphanosoma celebensis (4-9 days old). Asterisk indicates data with significant differences by t-test (p<0.05).

    Table

    GenBank accession number of the amino acid sequences used for sequence and phylogenetic analyses in the study

    Primers used in this study

    Reference

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    Vol. 40 No. 4 (2022.12)

    Journal Abbreviation 'Korean J. Environ. Biol.'
    Frequency quarterly
    Doi Prefix 10.11626/KJEB.
    Year of Launching 1983
    Publisher Korean Society of Environmental Biology
    Indexed/Tracked/Covered By

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