서 론
2017년 세계 양식업에서 항균제 소비량은 10,259톤으 로 집계되었고, 2030년에는 13,600톤으로 33% 정도 증가 할 것으로 예상된다 (Schar et al. 2020). 농림축산식품부에 서 발간한 2021년도 국가 항생제 사용 및 내성 모니터링 (동물, 축산물)을 보면, 국내 수산용 항균제 판매실적은 2018년 242톤, 2019년 158톤과 2020년 159톤으로 감소했 다가 2021년에는 다시 226톤으로 증가하는 것으로 보고 되었다. 2021년에 판매된 수산용 항균제 순위는 penicillin (31.1%), tetracyclines (27.8%), macrolides (11.6%), aminoglycosides (9.5%) 및 phenicols (7.5%) 등으로 집계되었 다.
내수면양식장에서 사용된 수산용 항생제는 배출수를 통해 하천으로 방류되는데, Kim et al. (2008)의 조사에 따 르면 한강수계 상류 지역의 동물용 항생제 잔류 실태를 조사한 결과, 최고 검출 농도는 tetracycline 2,096 ng L-1 및 oxytetracycline 1,236 ng L-1까지 이르는 것으로 보고되었 다. 또한, 설파메톡사졸은 평균 67 ng L-1로 검출되어 설파 계 항생제 중 가장 높은 수치를 보였으며, 설파계 항생제 와 같이 사용하는 트리메토프림도 평균 202.3 ng L-1로 비 교적 높은 농도를 나타냈다고 보고되었다. 세균성 질병의 치료목적으로 사용되는 항생제는 생물에 완전히 흡수되 거나 대사되는 약물은 거의 없으므로 접종한 약물을 전부 회수하는 것은 불가능하다 (Kim 2010). 이는 항생제의 자 연계 유출 위험성이 높음을 의미하며, 항생제 내성 병원 균의 출현 가능성 또한 증가한다고 볼 수 있다. 특히, 동물 의 장 (intestine)은 항생제 내성 세균의 병원소 (reservoir of infectious agents) 중 하나이고 (Ash et al. 2002;Salyers et al. 2004), 동물 체외로 방출된 항생제 내성균은 그대로 하수 종말처리장으로 유입되거나, 완벽하게 처리되지 않고 방 류되어 하천 내 항생제 내성 미생물을 발생시킬 수 있다 (Cook et al. 1989;Iwane et al. 2001;Kim et al. 2007). 특히, 내수면양식장의 배출수는 침전조를 거쳐 바로 주변 하천 으로 방류되기 때문에 기존 처리방법 외에 부가적인 처리 방법이 요구된다 (Woodward 1996;Sim et al. 2010;Hwang 2011).
저온 플라즈마를 활용한 수처리 기술은 환경친화적이 고, 안전성이 뛰어날 뿐만 아니라 비용 대비 효과가 우수 한 것으로 알려져 있다 (Kim 2009). 그 가운데서 유전체 장벽 방전 플라즈마 (Dielectric Barrier Discharge Plasma, DBD plasma)는 대기압에서도 고출력 방전이 가능하고 복잡한 펄스 전력 공급기가 없어도 되며 열 발생이 높지 않기 때문에 다양한 분야에서 사용되고 있다 (Kim et al. 2018). DBD plasma가 발생하면 자외선, shock wave, H2O2, 오존 및 각종 라디칼 (·OH, ·H, ·O, ·O2-, ·HO2) 등과 같은 많은 화학적 활성 종이 생성되는데, 특히 플라즈마의 수 중 방전은 다양한 활성 종들이 물속의 오염물질에 직접 접 촉되어 반응 효율성을 향상시킨다 (Locke et al. 2006;Joshi and Thagard 2013;Stratton et al. 2015;Shin et al. 2019).
DBD plasma의 적용 사례를 살펴보면 염료공장 폐수 (Mok et al. 2007;Sun et al. 2008;Jin et al. 2013), 오일공 장 폐수 (Gushchin et al. 2018), 병원 및 제약공장의 폐수 (Haixia et al. 2015;Nguyen et al. 2021) 처리에 효과적이 었고, 농업 분야에서 사용되는 살충제 (Sarangapani et al. 2016; Xingmin et al. 2018), 살균제 (Misra et al. 2014) 및 제초제 (Feng et al. 2008;Jovic et al. 2014;Wardenier et al. 2019) 처리에 대해서도 분해 효과가 입증되었다. 최근에 는 산업폐수에 널리 포함되는 페놀류 화합물 (Shin et al. 2019)과 같은 난분해성 물질의 제거와 병원 배출수 내 포 함된 ciprofloxacin, cefuroxime, ofloxacin 및 amoxicillin과 같은 항생제 제거에도 탁월한 효과가 있는 것으로 확인되 었다 (Nguyen et al. 2021). 그러나 수산양식 분야에서 양식 장 배출수에 포함된 오염물질 처리에 관한 연구는 매우 드 문 실정이다.
따라서, 본 연구는 양식장에서 많이 사용되고 있는 수산 용 항생제인 tetracyclines계 3종 (tetracycline, doxycycline, oxytetracycline), lincosamides계 1종 (clindamycin) 및 macrolides계 1종 (erythromycin)를 대상으로 DBD plasma 처리 에 의한 제거 효과를 규명하기 위하여 실시되었다.
재료 및 방법
1. 시료채취 및 수질분석
충북내수면산업연구소에서 사육 중인 향어 (평균 1,200 g)는 사각 콘크리트 수조 (22 m×22 m×1 m, 484톤)에 1,962마리가 수용되었고, 1일 어체 중 1%의 사료 (참와이 드7S호, JeilFeed, Korea)를 1일 2회 (10시, 16시) 투여하였 다. 수조로 유입되는 사육용수는 남한강 (충북 충주시 소 재) 하천수를 사용하여 1일 30%씩 환수하는 지수식 방식 으로 사육되었다. 사육 수조에서 나오는 배출수는 오후 사 료투여 2시간 후인 18시에 침전조에서 채수하여 실험에 사용하였다.
수온 (Temperature), 수소이온 농도 (pH), 용존산소 (Dissolved oxygen, DO)는 수질측정기 (Multi 3410; WTW, Germany)로 현장에서 측정되었고, 화학적산소요구량 (Chemical oxygen demand, COD), 부유물질 (Suspended solid, SS), 암모니아성 질소 (Ammonium nitrogen), 아 질산성 질소 (Nitrite nitrogen) 및 질산성 질소 (Nitrate nitrogen)는 수질오염공정시험기준 (국립환경과학원고 시 제2022-12호, 2022.2.21.)으로 분석하였다. 본 실험에서 사용한 항생제는 UHPLC-MS/MS (Xevo TQ-XS, Waters Corporation, USA)로 분석하였고 실험결과는 Table 1에 나 타내었다.
2. 항생제 표준용액 제조
항생물질을 분석하기 위하여 사용한 표준물질 (Dr. Ehrenstorfer GmbH, Germany)의 순도는 tetracycline 97.94%, doxycycline 98.0%, oxytetracycline 98.62%, clindamycin 94.1% 및 erythromycin 92.9%이었으며, 표준원액 제조 시 순도 보정을 실시하였다. 각 항생제는 methanol을 사용하 여 표준원액을 만든 뒤 단계적으로 희석하여 농도별 표준 용액을 제조하여 -30°C에 보관하였다. 표준용액의 농도 는 1 mg L-1이었고, 위에서 채수한 양식장 배출수로 10배 희석하여 사용하였다. 실험의 반복 횟수는 3 반복으로 하 여 분석은 각 1회 실시하였다. 본 실험에 사용한 항생제의 화학구조는 Fig. 1에 나타내었다.
3. 시료의 전처리 및 기기분석 조건
본 연구의 시료 전처리 및 기기분석 조건은 Lee et al. (2018) 방법을 준용하였다. 시료 500 mL에 NA2-EDTA 500 mg을 첨가한 뒤, 6N-HCl로 pH를 2까지 조절하였다. 이를 미리 methanol 5 mL와 증류수 5 mL로 활성화한 Oasis HLB (200 mg / 6 cc) 카트리지에 가한 뒤 진공 감압장치에 장착하여 정제하였으며, methanol 4 mL로 2회 용출하였다. 용출액은 질소로 건고하고 methanol 1 mL로 재용해하여 분석시료로 하였다.
UHPLC-MS/MS (Waters Xevo TQ-XS, USA)를 이용하 여 분석을 실시하였고, 분석용 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1×100 mm, 1.7 μm, Waters Coporation)를 사 용하였으며, 컬럼 온도는 40°C를 유지하였다. 이동상 A 는 0.1% Formic acid를 함유한 물, 이동상 B는 0.1% Formic acid를 함유한 Acetonitrile를 사용하였으며, 유속은 0.4 mL min-1, 주입량은 10 μL로 하였다. 질량분석기 조건으로 ESI와 positive 방식으로 nebulization과 collision gas는 질 소와 아르곤으로 분사 및 이온화시켰으며, capillary 온도, capillary voltage는 각각 500°C와 3,800 V로 고정하였다. 기 기분석 조건은 Table 2에 자세히 기술하였다.
4. 표준검정 곡선의 및 분석법 검증
각 항생제의 표준물질을 바탕시료에 첨가하고 전처리 및 기기분석 하여 검량식을 구하였다 (Table 3). 검량곡선 은 표준물질 5개 농도 범위 (0.1, 1, 10, 100, 500 및 1,000 μg ㎏-1)에서 측정 및 분석한 결과, 결정계수 R2은 모두 0.99 이상으로 높은 직진성을 보였다. 검출한계 (limit of detection, LOD)는 신호 대 잡음비 (signal to noise ratio)가 3인 값으로 계산하였고, 정량한계 (limit of quantification, LOQ)는 신호 대 잡음비가 10인 값으로 계산하였다.
회수율은 바탕시료에 0.1 μg kg-1, 0.2 μg kg-1 농도가 되 도록 표준물질을 첨가한 후, 전처리 과정을 거친 값과 거 치지 않은 값의 농도 절대 치를 비교함으로써 측정하였다 (Table 4). 각 농도에서 측정한 회수율은 84.7~106.0%의 값을 나타냈다.
5. DBD plasma 장치 및 운전조건
DBD plasma 발생장치는 반응기, 전원공급기 및 가스공 급장치로 구성되었다 (Fig. 2). 반응기는 시료 300 mL을 처 리할 수 있는 용량이며, 플라즈마를 발생시키는 전극봉을 시료 속에 잠기게 하여 수중 방전을 유도하였다. 전원공급 기의 입력전압은 250 V, 출력전압은 27.8 kV로 설정하여 0 초, 30초, 1분, 2분, 4분, 8분, 16분 및 32분간 처리하였다. DBD plasma를 발생시키기 위하여 반응기 내로 공기 또는 산소 가스를 2 L min-1로 주입하였고, 기타 DBD plasma 처 리조건은 Zhang et al. (2018) 방법을 준용하여 실시하였다.
6. 용존오존 측정
DBD plasma 발생장치의 반응기에 양식장 배출수 300 mL을 채운 후 위와 같은 조건의 전압 세기와 노출 시간 을 주어 처리한 후 분광광도계 (PhotoLab 6100VIS; WTW, Germany)를 이용하여 오존측정키트 (Ozone test kit 10067; Merck, Germany)로 분석하였다.
7. 통계분석
실험결과는 Mean±SD로 나타내었고, 통계처리는 SPSS program (ver. 20)을 이용하여 신뢰도를 산출하였고, Oneway ANOVA, Duncan’s test로 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
결과 및 고찰
저온 플라즈마 장치에서 서로 대향한 전극 사이에 교류 전기장을 인가하면 전기장에 의해 반응 가스 내 전자는 높 은 에너지로 가속되고, 가속된 전자는 산소 분자와 충돌하 여 산소 이온 (O2+)을 만들거나 산소 원자 이온 (2O+)으로 분리된다. 이온 상태는 매우 불안정한 상태이므로 주위의 전자와 결합하여 산소라디칼 (O*)이 되거나 다른 산소 이 온과 결합하여 오존 (O3)을 만들게 된다 (Braithwaite 2000;Conrads et al. 2000). DBD plasma 반응기 내에 산소 함유 량이 높을수록 활성종과 오존의 생성량이 많아져 난분해 성 물질의 제거율이 높아지는 것으로 알려져 있다 (Sato et al. 2008;Park 2013). 그러나 DBD plasma에 의해 발생되는 활성 종들은 대부분 수명이 짧아 일반적인 분석기로는 측 정이 어렵지만, 오존은 비교적 반감기가 길어 측정이 가능 한 것으로 알려져 있어 ( Jo et al. 2013), 본 연구에서는 플라 즈마 처리에 따른 오존량 변화를 조사하였다. Magureanu et al. (2008)에 따르면 DBD plasma로 수중에 녹아있는 methylene blue 분해 효과를 연구한 결과, 플라즈마 발생장 치에 산소를 주입하는 것이 최상의 결과를 나타내었는데, 산소를 30분간 주입한 결과 분해효율은 95%를 초과하는 것으로 보고하였다. 이러한 이유는 플라즈마 처리 시 무기 질화 과정이 일어나게 되는데 처리시간이 경과할수록 이 온성 물질과 유기산 함량은 증가하게 되며, 이러한 과정은 공기보다는 산소 가스를 주입했을 때 더 빠르고 더 많이 생성된다고 보고되었다 (Kim 2013).
본 연구의 전반적인 결과는 Magureanu et al. (2008)의 연구결과와 같은 경향을 보였다. 먼저, DBD plasma에 의 해 발생한 오존량의 변화는 Fig. 3에 나타내었다. 공기 주 입 시 노출 30초부터 유의하게 증가하기 시작하였고, 노출 8분째는 592.9%까지 상승하다가 16분째부터 다시 감소하 기 시작하였다. 산소의 경우 노출 30초부터 유의한 증가 를 보였으며, 8분째 1071.4%까지 높아졌다가 16분 이후부 터 다시 감소하는 경향을 보였다. 즉, DBD plasma 반응기 내 오존이 발생되는 경향은 공기 주입과 산소 주입이 같았 으나, 오존 생성량은 산소가 공기보다 1.8배 정도 더 많았 다. 오존 생성량이 증가했다가 다시 감소하는 경향은 DBD plasma 처리 시 NO 및 NO2 등이 질소화합물로 산화되어 오존을 파괴하는 소거인자 (scavenger)로 작용하였기 때문 으로 알려져 있다 (Pekarek 2003).
저온 플라즈마에 의한 tetracycline계 항생제의 분해 는 hydroxyl radical (·OH)과 오존에 의한 상호작용에 의 한 것으로 보고되었다 (Fang et al. 2022). Yao et al. (2022) 은 ROS (Reactive Oxygen Species)와 Oxytetracycline의 핵 심구조인 C2 site의 acylamino, C4 site의 dimethylamine, C10-C12 structure 및 C12a site의 tertiary alcohol의 상호작용 으로 oxytetracycline 구조가 왜곡되거나 파괴된다고 보고 하였다.
본 실험에서 DBD plasma에 의한 3종의 tetracycline계 항생제는 제거양상과 효율은 비슷하게 나타났다. 우선, 공 기 주입 시 대조구에 비해 유의한 감소를 보인 구간은 노 출 4분째이고 감소 수준은 20.6~23.6%이었다. 노출 8분째 는 36.6~38.1%, 16분째는 53.3~54.3%로 낮아졌고, 노출 32 분째는 77.1~78.1% 감소하였다. 산소를 주입한 결과, 대조 구에 비해 유의한 감소를 보인 구간은 노출 30초째이고 13.7~39.5% 정도 감소하였다. 노출 4분째는 59.6~72.5%로 낮아졌고, 노출 8분째는 70.7~83.5%로 감소하였으며, 노출 32분째는 95.5~96.3%까지 제거되었다 (Figs. 4~6).
Clindamycin에 대한 실험결과, 공기 주입 시는 노출 2분 째부터 유의한 감소가 나타났으며, 노출 8분째는 42.1%, 노출 16분째 54.9% 그리고 노출 32분째는 59.6%로 감소하 였다. 산소 주입 결과는 노출 1분 후부터 유의하게 감소하 였고, 노출 4분째 54.8%, 노출 8분째 67.5%, 노출 16분째는 72.6%로 낮아지다가 노출 32분째 83.0%까지 감소하였다 (Fig. 7). Erythromycin의 결과도 clindamycin과 비슷한 양 상으로 나타났는데, 공기 주입 실험에서는 노출 2분째 대 조구에 비해 유의한 감소를 나타내기 시작하였으며, 노출 4분째 21.2%, 노출 8분째 25.2%, 노출 16분째 43.5% 감소 하다가 32분째는 53.3%까지 낮아졌다. 산소 주입의 경우, 노출 1분째 유의한 감소를 보이기 시작하였고, 노출 4분째 는 51.4%, 노출 8분째 56.3%, 노출 16분째는 63.5%로 낮아 졌으며, 노출 32분째는 74.3%로 감소되었다 (Fig. 8).
따라서, DBD plasma 장치에 공기와 산소를 각각 주입 하면 tetracycline계 항생제는 77.1~78.1%와 95.5~96.3% 가 제거되고, clindamycin은 59.6%와 83.0%가 감소되며, erythromycin은 각각 53.3%와 74.3%가 감소되었다. Tetracycline계 항생제가 clindamycin 및 erythromycin보다 더 빠르게 제거되는 것으로 나타났고, 실험한 모든 항생제의 제거 효과는 공기 주입보다는 산소 주입 시 더 큰 것으로 나타났다.
가축분뇨 공공처리장의 방류수와 증류수에 oxytetracycline과 chlortetracycline 표준물질을 각각 혼합한 다음 DBD plasma (입력전압 21 W)로 발생시켜 처리한 결과, 방 류수에서는 10~15분 만에 제거된 반면에 증류수에서는 30분 만에 제거되어 시료 속에 유기물이 많을수록 더 신 속하게 제거되는 것으로 나타났고, 공기보다 산소 주입 시 분해 효과는 더 큰 것으로 보고되었다 (Kim et al. 2011). 그 이유는 플라즈마 형성으로 만들어진 이온이나 라디칼 활 성 종이 유기물이 많은 방류수 중에 존재하는 이온성 염류 등에 의하여 화학반응이 더욱 증폭된다고 추정되며, 수질 시료 내에 유기물이 많고 산소가 풍부할수록 항생제 처리 효과는 더 크다고 볼 수 있다.
결론적으로 본 연구에서 실험한 DBD plasma 장치에 산 소 (2 L min-1)를 주입한 상태 수중 방전 (출력전압 27.8 kV)을 32분간 일으키면 tetracycline계 항생제는 95% 이상, clindamycin과 erythromycin은 각각 83% 및 74%를 제거할 수 있는 것으로 사료된다.
적 요
본 연구의 목적은 양식장 배출수 내에 포함된 5종의 항 생제 (tetracycline, doxycycline, oxytetracycline, clindamycin 및 erythromycin)를 제거하기 위해 사용한 수중 비열 유전 체장벽 방전 플라즈마 (Dielectric Barrier Discharge plasma, DBD plasma) 장치 안으로 공기와 산소를 각각 주입했을 때 항생제의 제거효율을 비교하는 것이다. DBD plasma를 발생시키기 위해서 주어진 전압은 27.8 kV이었고, 처리간 격은 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 및 32분이었다. 3종의 tetracycline 계 항생제는 공기를 주입했을 때는 4분만에 유의하 게 감소하였고, 산소를 주입했을 때는 30초만에 유의성 을 나타내었다. 32분째 공기와 산소를 각각 주입한 결 과, tetracycline은 78.1%와 95.8%, doxycycline은 77.1%와 96.3% 그리고 oxytetracycline은 77.1%와 95.5% 감소하였 다. Clindamycin은 공기를 주입했을 때 59.6%가 감소되었 고, 산소는 83.0% 감소되었다. 또한, erythromycin은 공기 주입 시 53.3%가 감소되었고 산소 주입 시 74.3%가 감소 하여 두 항생제 모두 tetracycline계 항생제보다 낮은 제거 효율을 보였다. 결론적으로 수중 DBD plasma는 양식장 배 출수 내에 포함된 5종의 항생제를 감소시킬 수 있고, 제거 효율은 공기보다 산소를 주입하는 것이 더 효과적이다.