서 론

전 세계적으로 플라스틱 사용량의 증가로 사용 후 폐기 된 플라스틱이 분해되면서 해양으로 유출되어 이로 인한 환경오염 문제가 대두되고 있다. 해양뿐만 아니라 토양에 도 문제를 야기하는데, 폐기된 플라스틱을 매립하거나 바이 오고형물 (biosolids), 퇴비와 멀칭 비닐을 사용함으로써 플 라스틱이 토양에도 지속적으로 축적되고 있다 (Wang et al. 2019a;Kumar et al. 2020). 또한, 이러한 플라스틱은 광산화 작용 등으로 미세한 입자로 분해되면서 다른 유해한 화학 물질과 결합하거나, 분해되는 과정에서 유출된 물질이 토양 과 토양을 기반으로 살아가는 생물체에도 영향을 줄 수 있 다고 보고되었다 (Wang et al. 2019a).

플라스틱은 분해되면서 첨가제로 사용한 가소제가 환경 에 유출되는데, 유출되는 대표적인 가소제로는 bisphenol A, bisphenol F, bisphenol S와 같은 비스페놀 화합물 (bisphenol compounds)과, diethyl phthalate (DEP), dibutyl phthalate (DBP), bis(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) 등을 포함한 프 탈레이트 (phthalate)가 있다 (Net et al. 2015). 프탈레이트 가 환경에 유출되면 해양 생물체에 면역체계 및 신경계 독 성을 일으키고, 어류의 혈액생리에 영향을 준다고 보고되었 다 (Oehlmann et al. 2009;Rochester and Bolden 2015;Kim et al. 2021). 토양은 광범위한 오염 물질의 주요 저장소 역 할을 하며, 중국 일부 지역에서는 토양 내 프탈레이트 함유 량이 0.14~2.13 mg kg^-1 (평균 0.99 mg kg^-1), 채소에서 검출 되는 양은 0.15~6.94 mg kg^-1 (평균 1.49 mg kg^-1)인 것으로 보고되었다 (Li et al. 2016). Wang et al. (2013)에 따르면 토 양에서 총 phthalic acid ester (PAE)의 농도는 0.15~9.68 mg kg^-1으로 광범위하게 검출되었고, 그중 di-n-butyl phthalate (DnBP), DEHP, di-n-octyl phthalate (DnOP)가 가장 많은 양의 PAEs이었다. 가장 많이 사용되는 가소제 중 하나인 DEHP는 공기, 물, 토양 등에서 검출되며, 화학적 결합이 아 닌 물리적 결합으로 이루어져 있어 쉽게 환경에 방출되고, 동물과 인간에서 내분비 교란을 일으킨다고 알려져 있다 (Bagó et al. 2005). 또한, Du et al. (2009)은 농작물을 재배할 때 사용하는 멀칭 비닐에서 유래한 DEHP가 식물로 이행 될 가능성이 있다고 보고하였다.

Pectobacterium spp.은 토양에 서식하는 식물병원성 세균 으로 식물 세포벽을 분해하는 효소를 생성하여 다양한 작 물에서 무름병을 일으킨다 (Pérombelon and Kelman 1980). P. carotovorum에 의해 감염된 식물체는 토양과 맞닿는 부 분이나 지하부의 상처부위에 수침상의 병반이 생기며, 포 기 전체로 확산하여 물러지고 썩으면서 악취가 발생한다 (Tournas 2005). 이 병원균은 뿌리, 잎 등 모든 식물 조직에 병을 일으킬 수 있고, 수확 후 저장된 과일과 채소에서도 부패를 일으키는 등 광범위한 작물에 급격히 병을 일으켜 심각한 경제적 손실을 가져온다 (Marquez-Villavicencio et al. 2011;Meng et al. 2017). 본 연구에서는 플라스틱 가소제 인 DEHP가 식물에 무름병을 일으키는 주요 병원균인 P. carotovorum의 생장 및 대사, 병원성과 관련된 pectate lyase 와 pectin 유전자 발현 등에 어떠한 영향을 주는지 in vitro 평가하고자 한다.

재료 및 방법

1. 세균 배양과 개체군 평가

P. carotovorum SCC1는 Luria-Bertani agar (LB, Difco, USA) 에 28°C에서 48시간 배양한 후 단일 콜로니를 LB broth에 접종하여 28°C에서 48시간 배양하였다. 배양한 SCC1 (2.3× 10⁷ CFU mL^-1)을 0.4% glucose가 함유된 M9 broth에 0.01% tween 20과 다양한 농도의 (10, 20, 40, 60, 80, 100 μg mL^-1) DEHP를 첨가하여 28°C에서 160 rpm으로 48시간 동안 배 양하였다. 배양액 1 mL를 9 mL의 0.85% NaCl에 넣고 순차 적으로 희석한 후, 100 μL의 희석액을 LB agar에 도말하고 28°C에서 배양하였다. 48시간 배양 후 colony forming unit (CFU mL^-1)을 측정하였으며, 대조구로는 DEHP가 첨가되 지 않은 배지를 사용하였다.

2. TCA cycle

P. carotovorum SCC1 (2.3×10⁷ CFU mL^-1)는 0.4% glucose 가 함유된 M9 broth에 0.01% tween 20과 20 μg mL^-1의 DEHP를 첨가한 후 배양하였다. DEHP를 처리하지 않은 배지는 대조구로 사용하였다. 48시간 배양 후, 배양액을 13,000 rpm, 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 균주를 모으 고, 각각의 kit assay buffer에 OD₆₀₀=0.1로 현탁하여 사용 하였다. Citrate, glutamate, oxaloacetate, pyruvate, isocitrate, malate, fumarate, succinate, α-ketoglutarate, α-ketoglutarate dehydrogenase (α-KGDH), citrate synthase activity, pyruvate dehydrogenase (PDH), succinate dehydrogenase (SDH), succinyl CoA synthetase (SCS)를 측정하기 위해 각각 assay kits (MAK057, MAK004, MAK070, MAK071, MAK061, MAK067, MAK060, MAK184, MAK054, MAK189, MAK193, MAK183, MAK197, MAK217; Sigma, USA)를 사용하였다.

3. 막 투과성과 ATPase 활성

위와 같이 배양한 균주 배양액에서 원심분리한 균체는 5 mM HEPES buffer (pH 7.2)로 현탁하여 OD₆₀₀=0.5 농도 로 맞춘 후 사용하였다. 1-N-phenylnaphthylamine (NPN; 40 μM stock) 50 μL에 5 mM glucose, 1 mM sodium azide가 포 함된 5 mM HEPES buffer (pH 7.2) 50 μL와 균 현탁액 100 μL를 넣은 후 즉시 Hidex Sense microplate reader (Hidex, Finland)를 이용하여 excitation (355 nm)과 emission (405 nm)에서 측정하였다 (Loh et al. 1984). ATPase 활성을 측 정하기 위해 ATPase/GTPase Activity Assay Kit (MAK113, Sigma, USA)를 사용하였다. 원심분리한 균주를 assay buffer (40 mM Tris (pH 7.5), 80 mM NaCl, 8 mM MgAc₂, 1 mM EDTA)로 현탁하여 사용하였다. 4 mM ATP 10 μL에 현탁액 20 μL를 넣고 30분간 반응시켰다. 반응시킨 후, reagent 200 μL를 넣고 30분간 발색하여 620 nm에서 흡광도를 측정하 였다.

4. 병원성 관련 유전자 발현

DEHP 처리에 의한 P. carotovorum SCC1 균주의 병원성 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 균주 는 위와 같이 배양하고 원심분리하여 준비하였다. 균주는 easy-spin^TM Total RNA Extraction Kit (iNtRON, South Korea) 를 사용하여 RNA를 분리하고, cDNA는 TOPscript RT Dry MIX (Enzynomics, South Korea)를 사용하여 합성하였다. 실 험에 사용한 primer set는 Table 1과 같다. Quantitative realtime polymerase chain reaction (qRT-PCR)을 위해, CFX96 Real-time PCR Detection system (Bio-Rad, USA)을 사용 하였다. qPCR은 95°C에서 10분, 40 cycles 95°C에서 15초, 56°C에서 30초한 후 72°C에서 30초로 유전자의 증폭을 수 행하였다. gyrA 유전자를 정규화하는 데 사용하였으며, 상 대적 발현 정도를 결정하기 위하여 2^-ΔΔΔCt method (Livak and Schmittgen 2001)를 사용하였다.

5. 통계분석

통계분석은 R studio 프로그램 (version 4.0.5, Rstudio Inc., USA)을 이용하였다. 정규성과 등분산 검정을 수행한 후, 분 산분석 (analysis of variance, ANOVA)을 수행하였다. 사후검 정으로 최소유의차검정 (least significant difference, LSD)을 통해 p<0.05에서 유의성을 검정하였다.

결과 및 고찰

DEHP가 P. carotovorum SCC1 균주의 생장에 미치는 영 향을 조사하기 위하여 다양한 농도의 DEHP를 최소배지 에 혼합하여 48시간 동안 배양한 후 CFU mL^-1를 평가한 결과, 실험조건에서는 100 μg mL^-1까지 DEHP를 혼합하 여도 P. carotovorum SCC1 개체군 변화에 유의하게 영향을 주지 않았다 (Fig. 1). 48시간 배양 후 CFU mL^-1를 평가했 기 때문에 실험조건에서 시간에 따른 균주 생장률은 평가 하지 못했지만, 배양조건에서는 배양 후 DEHP 처리에 의 한 SCC1의 개체군 변화는 관찰되지 않았다. 이에 반하여, Shafikova et al. (2018)은 최소배지에서 P. carotovorum subsp. carotovorum 균주에 DEHP를 처리하였을 때, DEHP 농도가 증가함에 따라 biofilm 생성이 억제되고 균의 생장이 증가하 는 것을 흡광도로 측정하였다. 흡광도로 세균의 생장을 측 정하는 것은 세균의 생존 유무를 고려하지 않은 방법인 반 면, 본 연구는 glucose를 영양원으로 넣은 최소배지에 배양 하였고, 살아있는 세균을 측정하는 방식인 colony forming unit (CFU)를 사용하여 실험조건이 다르기 때문에 결과가 상이한 것으로 추측된다.

P. carotovorum SCC1 대사에 DEHP가 미치는 영향을 분석 하기 위하여 세포막 투과성, ATPase 활성, TCA cycle와 관 련한 효소활성 및 대사체를 분석한 결과, 세포막 투과성과 ATPase 활성은 DEHP에 의해 유의하게 영향을 받지 않았 다 (Table 2). 생물체가 프탈레이트에 노출되면, 친유성인 프탈레이트는 세포막의 소수성 영역에 축적되어 이중층이 팽창되고, adenosine triphosphate (ATP) 생성과 같은 세포 막에서 이루어지는 대사를 방해하거나, 지방산과 같은 세 포막에 영향을 주어 세포막 구성을 재편성하는 것으로 알 려져 있다 (Sikkema et al. 1994). Dimethyl phthalate (DMP) 는 Pseudomonas fluorescens의 세균막 변화를 유도하고, 생장 과 에너지 대사와 관련된 생물학적 기능에 영향을 주는 것 으로 알려졌다 (Wang et al. 2019b). 하지만 본 연구에서 실 험한 DEHP의 경우 혼합된 배지에 P. carotovorum SCC1를 배양할 경우, ATPase 활성과 세포막 유동성에 유의한 변 화를 주지 않았다 (Table 2). 또한, 실험한 TCA cycle과 관 련된 효소활성과 대사체 중 Succinyl-CoA synthase 활성만 DEHP 처리에 의해 감소하였다 (Tables 3 and 4). 플라스틱 을 분해하는 과정에서 나오는 산물이 미생물 TCA 대사에 영향을 줄 수 있는데, Pseudomonas sp. AKS2는 Polyethylene succinate 에스테르 결합을 끊어 분해하면서 TCA 순환 대 사산물인 숙신산을 생성하는 것으로 알려졌다 (Tribedi et al. 2012). 또한, polyethylene terephthalate (PET)을 분해하는 미생물은 가수분해를 통해 PET를 terephthalic acid (TPA) 와 ethylene glycol (EG)로 분해하고, TPA는 세포 내에서 다 양한 경로를 통해 protocatechuic acid (PCA)로 전환되어 TCA cycle를 통해 대사되며, 분해산물인 EG는 대사 경로에 따라 TCA cycle의 전구체로 사용될 수 있다고 보고되었다 (Yoshida et al. 2016;da Costa et al. 2020). 이러한 관련 보고 는 주로 미생물이 플라스틱을 생물적으로 분해하면서 발생 한 분해 산물이 다시 미생물 대사에 영향을 주는 경우를 연 구한 것으로 이는 플라스틱 분해 중에 유출되는 프탈레이 트도 간접적으로 다른 미생물 대사 활성에 영향을 줄 가능 성이 있음을 의미한다.

최근에는 플라스틱인 polypropylene (PP)이 Rhodococcus equi의 독성 관련 단백질인 VapA 발현을 유도하여 병원성을 증가시켰다고 알려졌으며 (Hansen et al. 2022), 프탈레이트 가 생물체의 병발생과 관련이 있다는 연구 결과들이 보고 되고 있다 (Igarashi et al. 2006;Gascon et al. 2015;Martins et al. 2016;Tseng et al. 2022). P. carotovorum는 식물 세포를 분 해하는 pectate lyase와 pectinase 등의 효소를 분비하여 식물 에 무름병을 일으키는데, 이 두 효소와 관련한 유전자 발현 에 DEHP가 미치는 영향을 분석한 결과 pectate lyase 효소 를 인코딩하는 pelI와 pelZ의 발현량이 대조구 대비 유의하 게 증가하였고, pectinase를 인코딩하는 pec 발현량은 감소 하였다 (Fig. 2). 기내배양조건에서 P. carotovorum의 병원성 과 관련이 있는 유전자 발현이 DEHP 처리 유무에 따라 달 라지는 것으로 보아, 실제 기주 작물이 있는 토양에 DEHP 가 존재할 경우 작물과 상호작용, 토양과 이화학적 반응 등 이 다양하게 일어날 것으로 예상된다. DEHP가 토양 유형 에 따라 토양미생물에 주는 영향이 다르고, 식물체에 생리 적 변화도 일으키기 때문에 이러한 요인으로 병 발생에 영 향을 줄 수 있어 추후에 식물체에서 검정을 하고자 한다 (Ma et al. 2013;Gao et al. 2020;Ge et al. 2020).

본 연구에서는 DEHP가 혼합된 배지에서 P. carotovorum SCC1를 배양할 경우, 배양조건 내에서는 제한적으로 개체 군 및 Succinyl-CoA synthase을 제외한 TCA 대사 관련 활성 은 유의하게 변화하지 않았지만, 병원성과 관련된 pectate lyase와 petinase의 유전자가 상이하게 발현하였다. 이러한 in vitro 연구 결과는 앞으로 DEHP 등의 물질이 토양에서 P. carotovorum에 의한 병 발생 등에 주는 영향을 연구하는 데 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

적 요

본 연구는 플라스틱 가소제인 DEHP가 식물 병원균 중 하나인 P. carotovorum SCC1 균주에 미치는 영향을 조사하 였다. DEHP가 균주 생장과 대사에 미치는 영향을 조사한 결과, 개체군 변화에 유의한 영향을 주지 않았으며, 세포막 투과성, ATPase 활성에 유의한 변화가 없었지만 TCA cycle 에서 DEHP 첨가에 따라 Succinyl-CoA synthase 활성이 유 의적으로 감소하였다. 병원성 관련 유전자 발현량을 관찰한 결과 pectate lyase 유전자 발현량이 상대적으로 증가한 반 면, pectinase 유전자는 상대적으로 발현량이 감소하였다. 따 라서 DEHP는 P. carotovorum SCC1의 개체군 변화나 대사 에는 유의미한 영향을 미치지 않지만 병원성 관련 유전자 발현에 영향을 미치므로 본 연구 결과는 향후 실제 식물 재 배 조건에서 DEHP가 존재할 때 P. carotovorum의 특성에 관 한 기초연구 자료로 활용할 수 있을 것이라 사료된다.