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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean J. Environ. Biol. Vol.41 No.4 pp.386-399
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2023.41.4.386

Combined toxic effects of water temperature and polystyrene beads in the brackish water flea

Youn-Ha Lee, Jong-Seok Park, Chaerin Park, Sang-Hyun Cho, Je-Won Yoo, Young-Mi Lee*
Department of Biotechnology, College of Convergence Engineering, Sangmyung University, Seoul 03016, Republic of Korea
* Corresponding author Young-Mi Lee Tel. 02-2287-5448 E-mail. ymlee70@smu.ac.kr

Contribution to Environmental Biology


▪ Increased water temperature enhanced PS beads toxic effects on reproduction and ecdysteroid pathway-related gene expression of D. celebensis.
▪ This study provides a better understanding of the complex toxic interaction between water temperature and microplastics for marine zooplankton.
08/08/2023 04/10/2023 08/11/2023

Abstract


Microplastics and nanoplastics (NMPs) are considered one of hazardous contaminants in marine ecosystems due to their toxic effects, such as reproduction disorder and oxidative stress, on marine organisms. Although water temperature is rising due to global climate change, little information on the toxicological interaction between NMPs and temperature is available. Therefore, in this study, we confirmed the toxicity of NMPs (polystyrene [PS] beads; 0.05- and 6-μm) on brackish water fleas (Diaphanosoma celebensis) depending on increased temperature (30°C and 35°C) at individual and molecular levels. In the chronic toxicity test, the group exposed to high temperatures showed an earlier first reproduction time compared to the normal temperatures group, but it was delayed by co-exposure to NMPs at 35°C. Notably, the total reproduction decreased significantly only after 0.05-μm PS beads exposure at 30°C. Interaction analysis showed that first reproduction time, modulation of the antioxidantrelated gene (GSTS1), heat shock gene (Hsp70), and ecdysteroid pathway-related genes (EcR_A, EcR_B, and CYP314A1) were closely related to temperature and PS beads size. These results indicate that microplastics have size-dependent toxicity, and their toxicity can be enhanced at high temperatures. In addition, higher temperatures and PS beads exposure may have negative effects on reproduction. This study suggests that various factors such as water temperature should be considered when evaluating the toxicity of microplastics in marine ecosystems, and provides an understanding of the complex toxic interaction between water temperature and microplastics for marine zooplankton.


marine organisms , temperature , microplastics , nanoplastics , interaction effect

기수산 물벼룩에서 수온과 polystyrene beads의 복합 독성

이윤하, 박종석, 박채린, 조상현, 유제원, 이영미*
상명대학교 융 합공과대학 생명공학전공

초록

    1. 서 론

    플라스틱은 기계, 건설, 식품, 의료 등 다양한 분야에서 이용되고 있으며 플라스틱의 산업적 필요성이 부각됨에 따라 전 세계적인 생산량 또한 계속적으로 증가하고 있다 (Geyer et al. 2017). 하지만 이들의 부적절한 관리로 인해 많은 양의 플라스틱이 환경으로 배출되고 있으며, 특히 해 양환경은 다양한 오염물질이 최종적으로 유입되는 종착지 로써 해양 플라스틱 오염에 대한 관심이 꾸준히 증가하고 있다 (Cózar et al. 2014). 플라스틱은 전체 해양 폐기물의 80%에 달하는 것으로 알려져 있으며 (Jambeck et al. 2015), 해양환경의 플라스틱은 파도와 모래 등에 의한 풍화, 자 외선에 의한 광산화, 생물학적 분해 등을 거쳐 작은 미세 플라스틱 (Microplastics, MPs; <5 mm) 또는 나노플라스 틱 (Nanoplastics, NPs; <1 μm)으로 분해될 수 있다 (Zbyszewski et al. 2014;Frias and Nash 2019). 미세플라스틱 과 나노플라스틱은 그 작은 크기로 인해 소형 해양생물에 의해서도 섭취될 수 있어 더 큰 크기를 갖는 플라스틱 폐 기물에 비해 다양한 종류의 해양생물에 영향을 끼칠 수 있 는 오염물질로 간주되며, 이들의 섭취는 생식능력 저하, 먹 이 섭식 감소, 대사활동 변화, 산화적 스트레스 등을 유발 할 수 있음이 보고된 바 있다 (Cole et al. 2015;Jeong et al. 2016;Lu et al. 2016).

    지구온난화는 산업혁명 이후 지속적으로 증가한 온실가 스가 원인이 되어 발생한 세계적인 기후문제이다 (Xie et al. 2010). 선행 연구들은 수온의 상승이 해양생물에서 호 흡률 및 에너지 대사율의 증가 (Jang et al. 2022;Kim et al. 2022), 행동 장애 (Yoon and Park 2022), 치사 (Park and Park 2010) 등 부정적 영향을 야기할 수 있으며, 나아가 중 금속 및 유기오염물질을 포함한 수계 오염물질의 독성 영 향이 높은 수온에서 강화될 수 있음을 보고하였다 (Patra et al. 2015;Haque et al. 2020). 최근 사육 온도가 높아지면 미세플라스틱에 의한 독성 영향이 강화된다는 결과가 담 수 물벼룩과 담수 어류 등에서 보고된 바 있다 (Jaikumar et al. 2018;Kumar et al. 2020;Serra et al. 2020;Hasan et al. 2023). 그럼에도 불구하고 해양생물에서 미세플라스틱 영 향과 수온 상승의 복합 영향에 대한 연구는 매우 미흡한 상 황이며, 해양환경의 플라스틱 오염과 수온의 상승을 고려 할 때 이들의 상호작용이 해양생물에 미치는 영향에 대한 연구가 필요하다.

    지각목에 속하는 기수산 물벼룩 Diaphanosoma celebensis는 열대 아시아 지역에서 주로 서식하며 넓은 염분 농도 및 온도 범위에서도 생존이 가능한 소형 갑각류이다. 이들은 해양생태계 내에서 생산자와 상위 포식자 간의 영 양 단계를 연결하는 역할을 수행하는 일차 소비자로, 14일 정도의 짧은 생애 주기와 작은 크기 (adult: 413~1,112 μm), 단성 생식을 통한 높은 유전적 동일성 등 해양 생태 독성 연구에 적합한 특성을 가지고 있다 (Marcial and Hagiwara 2007;Yoo et al. 2021). D. celebensis는 여과 섭식자로써 미 세플라스틱 및 나노플라스틱을 섭취할 수 있으며, 선행 연 구들을 통해 플라스틱 입자의 생물 독성 영향을 평가하 기 위한 시험생물종으로써 활용되어 왔다 (Yoo et al. 2021;Cho et al. 2022). 또한, 20~35°C의 넓은 온도 범위에서 생 존할 수 있어 (Park and Park 2010) 미세플라스틱과 높은 수온의 독성 상호작용을 연구하기에 적합할 것으로 생각 된다.

    본 연구에서는 미세플라스틱과 나노플라스틱의 영향이 고온 조건하에서 어떻게 변화할 수 있는지 확인하기 위해 기수산 물벼룩 D. celebensis를 시험생물로 이용하여 개체 수준에서 생식에 미치는 영향을 확인하였으며, 분자적 수 준의 영향을 확인하기 위해 생식 (ecdysteroid 경로) 및 스 트레스 관련 유전자 (항산화 효소 및 열충격 단백질)의 발 현 변화를 조사하였다. 이는 기후변화로 인한 수온변화가 해양생물에 대한 미세플라스틱 및 나노플라스틱의 독성에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이 될 것이다.

    2. 재료 및 방법

    2.1. 시험생물

    시험생물은 상명대학교 분자독성학연구실에서 배양하 고 있는 기수산 물벼룩 D. celebensis를 이용하였다. 기수산 물벼룩의 배양을 위한 인공 해수 (15 psu, pH 7.8±0.5, D.O. 8.0±0.5 mg L-1)는 인공 해수염 Instant Ocean (Aquarium system, France)을 이용하여 제조하였다. 1.6 L의 인공해수 가 채워진 2 L 유리 비커에 기수산 물벼룩을 약 400개체 배 치한 뒤, 온도 25±1°C와 광주기 dark : light=12-h : 12-h 조건의 배양기 (Plant Growth Chamber, JS Research, Gongju, Korea)에서 배양하였으며 해양 녹조류인 Tetraselmis suecica (1.0~3.0×107 cells L-1)를 먹이생물로 매일 공급하 였다.

    2.2. 시험용액 제조

    모든 시험 용액은 0.05-μm와 6-μm 크기의 polystyrene beads (PS beads; Polyscience, Warrington, PA, USA) 표준 용액 (25 g L-1)을 인공 해수에 희석하여 제조하였으며, 플 라스틱의 분산을 위해 분산제인 Tween 20 (Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA)를 첨가하고 10분간 초음파 처리 (20 kHz, 90% amp.)하였다. 만성 독성시험을 위한 PS beads 농도는 Cho et al. (2022)에 따라 0.8 mg L-1로 선정하였고, 유전자 발현 분석을 위한 노출 시험에서는 0.1, 1, 10 mg L-1 의 농도가 되도록 시험용액을 제조하였으며, 분산제 농도 는 시험용액의 0.001% (v/v) 이하가 되도록 하였다.

    2.3. 노출시험

    수온 상승에 따른 미세플라스틱의 영향 변화를 확인하 기 위해 각각 다른 온도 (25, 30, 35°C)로 설정된 배양기를 이용하였다. 만성 노출시험은 Cho et al. (2022)의 방법에 따라 실시하였으며 생식지표 변화 (첫 산란 시점 및 총 산 란 수)와 개체군 성장률을 확인하기 위해 두 종류의 시험 을 14일간 실시하였다. 첫 산란 시점과 총 산란 수의 확인 은 제조한 PS beads 시험용액 (0.8 mg L-1)을 12-well plate 에 3 mL 채우고, 태어난 지 24시간 미만의 기수산 물벼룩 유생을 well당 1개체씩 노출하여 총 12반복으로 진행하 였다. 개체군 성장률 확인을 위해 50 mL 비커에 시험용액 을 40 mL 채우고, 태어난 지 24시간 미만의 기수산 물벼 룩 유생을 비커당 5개체씩 노출하여 4반복으로 진행하였 다. 생식지표와 개체군 성장률 확인을 위한 노출시험은 T. suecica (1.0×104 cells mL-1)를 매일 공급하여 진행하였고, 배지는 2일마다 새로운 배지로 전량 교체하였다. 유전자 발현 변화 확인을 위한 노출시험에서는 농도별 시험용액 (0.1, 1, 10 mg L-1)을 250 mL 비커에 200 mL 채우고, 태어 난 지 4일 된 기수산 물벼룩 200개체를 48시간 동안 노출 하였으며 노출 기간 중 먹이 공급 및 환수는 실시하지 않았 다. 만성 독성 영향 및 유전자 발현 변화 확인을 위한 모든 그룹의 노출시험은 다른 온도 조건 (25, 30, 35°C)에서 각 각 동일하게 수행되었다.

    2.4. 생식지표 및 개체군 성장률 관찰

    첫 산란 시점을 측정하기 위하여 기수산 물벼룩의 첫 산 란이 시작될 것으로 예상되는 노출 4일차부터 12시간마다 신생 개체를 확인하였으며, 첫 신생 개체가 관찰된 이후에 는 24시간마다 확인하고 제거하였다. 총 산란 수는 노출 기 간인 14일간 노출된 기수산 물벼룩 개체가 낳은 신생 개체 의 수를 모두 합하여 계산하였다. 개체군 성장률은 각 온도 에서 PS beads에 노출한 후 14일간 격일로 폐사한 개체를 제외한 모든 기수산 물벼룩 개체 수를 세어 기록하였으며, Eq. 1에 따라 개체군 성장률을 측정하였다 (Rico-Martinez and Dodson 1992).

    r = ln [ ( D t / D 0 ) ] / t
    (Eq. 1)

    • r=개체군 성장률, Dt=최종 개체군 밀도,

    • D0=초기 개체군 밀도, t=총 관찰 기간

    2.5. Total RNA 추출 및 cDNA 합성

    유전자 발현 변화 확인을 위해 48시간 동안 PS beads 시험용액에 노출된 기수산 물벼룩은 모두 포집하여 1.5 mL microtube에 옮긴 뒤 TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 균질 화 하고 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA는 NanoReady touch (Life Real Inc., Hangzhou, Zhejiang, China)를 이용하여 농도를 확인하였으며, 500 ng의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA의 합성 은 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 이용해 수행 했으며, 합성한 cDNA는 TE buffer로 10배 희석한 뒤 유전 자 분석에 이용하였다.

    2.6. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR)

    PS bead 노출에 따른 항산화, 스트레스 관련 유전자 및 생식 관련 유전자의 발현 양상에 대한 온도 상승의 영향을 알아보기 위하여 D. celebensis의 항산화 효소 유전자 5종 [Copper-zinc superoxide dismutase (CuZnSOD), Manganese superoxide dismutase (MnSOD), Catalase (CAT), Glutathione S-transferase Sigma1 (GST-S1), Glutathione peroxidase (GPx)]과 탈피호르몬 경로 관련 유전자 3종 [Ecdysone receptor A (EcR_A), Ecdysone receptor B (EcR_B), Cytochrome P450 314A1 (CYP314A1)]을 선별하였다 (Yoo et al. 2021;Cho et al. 2022). 열충격 단백질 유전자 3종 [Heat shock protein 70 (Hsp70), Heat shock protein 90b (Hsp90b), Heat shock cognate 70 (Hsc70)]은 D. celebensis 전사체 데이터베이스로부터 확보하였고, 각각의 primer는 유전자별로 [Hsp70 (F: 5′-CACCATCACCAACGACAAG -3′, R: 5′-AAGCAGTAAGATTCCAAACTATTC-3′), Hsp90b (F: 5′-GAAGAACTGAAGACCACATTTG-3′, R: 5′-TGCTTATTACCGCTCTGCTG-3′), 그리고 Hsc70 (F: 5′-TTCAGGGTGGTGTGTTGGC-3′, R: 5′-AATGG TCGTGTTGCGTTGG-3′)] 제작하여 사용하였다. 타겟 유전자 증폭을 위해 primer set을 각각 10 pmole씩, cDNA, 그리고 SYBR Master Mix (KAPA Bioassay System, Wilmington, MA, USA)를 혼합한 후 CFX Connect Thermal Cycler (Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA)에 서 qRT-PCR을 진행하였다. PCR 조건은 95°C에서 10분 간 변성 단계를 거친 후 95°C에서 15초간 변성, 60°C에 서 1분간 프라이머 결합 단계를 35회 순환하도록 하였다. Reference gene은 elongation factor-1beta (EF-1b)를 이용 하였으며, 측정된 C (t) 값을 바탕으로 2-ΔΔΔCt 방법 (Livak and Schmittgen 2001)을 이용하여 상대적 유전자 발현을 계산하였다. 각 시료는 3반복으로 분석하였다.

    2.7. 통계분석

    모든 시험 결과 값은 Sigmaplot version 12.0 (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA) 프로그램을 사용하 여 평균 (mean)±표준편차 (standard deviation) 값을 구 하고 추가 분석에 사용하였다. 온도 및 PS beads 노출에 따른 생식지표의 변화 및 온도 변화에 따른 유전자 발현 의 결과는 GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) 프로그램을 이용하여 그래프를 작 성하였다. PS beads의 노출에 따른 유전자의 발현의 변화 는 각 온도 조건에서 PS beads가 노출되지 않은 그룹을 기 준으로 PS beads 노출군의 상대적 유전자 발현을 계산하 였으며, MeV software (version 4.9; Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA)를 이용해 heat map을 제 작하였다. 각 실험 결과들의 통계적 분석은 SPSS version 26.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 진행하였 다. 기수산 물벼룩의 생식지표의 및 유전자 발현의 변화에 미치는 온도 또는 PS beads 등 단일 변수의 영향은 정규성 검사 (Shapiro-Wilk test, p>0.05) 후 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA) 방법으로 분석하였으며, 각 지표에 미 치는 온도 또는 PS beads의 상호작용 영향은 이원배치 분 산분석 (two-way ANOVA) 방법으로 분석하였다. 그룹 간 유의한 차이가 있는 경우 Tukey 방법에 따라 사후검증을 진행하였다. 분산분석 결과 온도와 PS beads의 상호작용이 있다고 판단된 경우, 유의한 상호작용이 나타난 조건을 확 인하기 위해 온도 및 PS beads의 조합에 따라 추가로 twoway ANOVA를 진행하였다. 모든 통계분석은 p 값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다.

    3. 결과 및 고찰

    3.1. 온도와 PS beads의 만성 노출이 생식지표와 개체군 성장률에 미치는 영향

    본 연구에서 기수산 물벼룩의 첫 산란 시점은 높은 온 도 (30 및 35°C) 조건에 노출된 그룹에서 일반 온도 조건 (25°C)에 노출된 경우보다 각각 0.95, 1.11일 유의하게 빨 라지는 것을 확인하였으며 (Fig. 1A), 비록 통계적으로 유 의하지는 않지만 30°C에 노출된 그룹에서 총 산란 수의 증가가 관찰되었다 (Fig. 1B). 그러나 수온 증가에 따른 성 장률 변화는 관찰되지 않았다 (Fig. 1C). Park and Park (2010)에 따르면 본 연구의 결과와 마찬가지로 30 및 35°C 에서 배양된 D. celebensis의 경우 25°C 배양 그룹과 비교 해 빨라진 첫 산란 시점을 보고하였으며, 특히 30°C에서 배양된 그룹에서 가장 높은 총 자손 생산율이 나타남을 보 고하였다. 선행 연구들은 수온의 상승이 수생생물의 호 흡률 (Khan and Khan 2008) 및 에너지 대사 (Khan and Khan 2008;Jang et al. 2022)를 증가시킬 수 있음을 보고 하였으며, Luo et al. (2017)의 연구에 따르면 일반 배양 조 건 (24°C)보다 상대적으로 높은 온도 (27°C)에 노출된 담 수어류, Gobiocypris rarus에서 증가된 알 생성 및 산란율 을 나타냈다. 이를 고려할 때 높은 온도 조건에 노출된 D. celebensis의 빨라진 첫 산란 시점 및 총 산란 수의 증가는 온도 상승으로 인해 증가된 호흡 및 에너지 대사율의 영향 일 수 있다.

    미세플라스틱은 난분해성 물질로써 수생생물의 장에 축 적되어 먹이 섭취의 감소 및 산화 스트레스의 증가를 야기 할 수 있으며 이에 따라 개체의 생존을 위한 에너지의 할 당을 증가시키고 생식에 필요한 에너지의 할당을 감소시 켜 생식 독성을 나타낼 수 있는 것으로 알려져 있다 (Cole et al. 2015;Sussarellu et al. 2016;Yoo et al. 2022;Jeon et al. 2023). 반면 미세플라스틱에 노출된 담수산 물벼룩 Daphnia magna (Huang et al. 2022), 요각류 Tigriopus japonicus (Lee et al. 2013) 등 소형 동물성 플랑크톤에서 유의한 생식 저해 영향을 보고한 선행 연구들의 결과들 과는 달리, 본 연구에서 25°C의 조건에서 PS beads의 노 출은 D. celebensis의 첫 산란 시점을 지연시키지 않았다 (Fig. 1A). 그러나 35°C의 조건에서는 D. celebensis의 첫 생 식 시점을 각 0.77일 (0.05-μm PS beads)과 0.65일 (6-μm PS beads) 지연시켰고, 30°C 조건에서 0.05-μm PS에 노 출된 개체군에서 PS beads에 노출 되지 않은 그룹과 비교 해 총 산란 수가 2.33마리 유의하게 감소되었다 (one-way ANOVA, p<0.05) (Fig. 1A, B). 이는 미세플라스틱을 포함 한 환경 오염물질의 독성이 높은 온도 조건에서 증가할 수 있다는 선행 연구들의 결과와 일치한다 (Haque et al. 2020;Hasan et al. 2023).

    Hasan et al. (2023)은 높은 온도 조건에 노출된 담수 어 류 Oreochromis niloticus에서 polyamide (PA) 입자의 섭 취가 증가될 수 있으며, 이에 따라 PA 입자로 인한 면역 독 성 및 조직 손상이 증가함을 보고하였다. 또한 Serra et al. (2020)은 D. magna에 대한 PS beads의 독성이 높은 온도 에서 증가될 수 있음을 보고하였으며 이는 높은 온도로 인 해 증가한 대사 요구도 및 먹이 섭취율이 오염물질의 섭취 를 강화하는 요인이 될 수 있다고 추정하였다. 선행 연구들 의 결과를 고려할 때 높은 온도 조건에서 증가된 PS beads 의 생식 독성 영향은 고온 환경에서 D. celebensis의 에너지 대사 및 호흡률이 증가하고, 이로 인해 PS beads의 섭식이 증가하였기 때문일 수 있다. 하지만 높은 온도에서 증가된 PS beads의 생식 독성 영향을 PS beads의 섭취 양상과 연 결지어 해석하기 위해서는 각 온도 조건에서 D. celebensis 의 호흡률, 여과율 및 PS beads 축적 등의 변화에 대한 추 가적인 연구가 필요하다.

    3.2. 온도 및 PS beads의 급성 노출이 항산화 효소, 스트레스, 생식 경로 관련 유전자 발현에 미치는 영향

    환경 유래 물질이 생물체에 유입되는 경우, 대부분의 오 염물질은 생물체에 의해 대사되어 체외로 배출될 수 있 다. 하지만 이들의 대사과정에서 높은 반응성을 가지는 활 성 산소종이 생산될 수 있으며, 과도한 활성산소종은 단백 질을 포함한 다양한 생체 고분자물질을 손상시킬 수 있다 (Magnani and Mattevi 2019;Mailloux 2020;Juan et al. 2021). 항산화 효소는 이러한 활성산소종을 제거하고 불안 정한 상태의 분자를 안정한 상태로 변화시키는 역할을 수 행하며, 열충격 단백질 (heat shock protein, Hsp)은 열, 자 외선, 생체 이물 등 다양한 스트레스에 대응하여 생체 고 분자물질의 구조를 유지하고 기능을 올바르게 수행할 수 있도록 돕는 것으로 알려져 있다 (Wong and Do 2017). 탈 피호르몬인 ecdysteroid는 내분비 호르몬의 일종으로 갑 각류 (Crustacean)의 탈피 과정을 조절하여 성장, 생식, 발 생 등에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Lafont and Mathieu 2007). CYP314A1은 ecdysone을 활성 형태 인 20-hydroxyecdysone (20E)으로 변환하는 역할을 수행 하고, 이렇게 변환된 20E는 ecdysone receptor (EcR)에 결 합하여 하위 호르몬 경로를 활성화함으로써 절지동물의 성장 및 생식을 조절할 수 있다 (Zhu et al. 2006;Niwa and Niwa 2016). 따라서 이들 효소의 활성 및 유전자 발현 변 화는 오염물질 노출에 따른 스트레스 영향 및 생식 독성 영향을 평가하기 위한 유용한 생체지표로 활용되어 왔다 (Trestrail et al. 2020;Cho et al. 2022;Yu et al. 2022). 특히 온도 스트레스는 생물의 에너지 대사를 변화시키고 면역, 항산화 경로 등 체내 다양한 방어기작 경로의 변화를 야기 할 수 있으며 (Park and Kwak 2014;Xu et al. 2018), 고온 환경에 노출된 생물은 체내 항상성을 유지하기 위해 다양 한 항산화 효소 및 열충격 단백질의 생성을 증가시키는 것 으로 알려져 있다 (Park and Kwak 2014;Han et al. 2018;Rahman and Rahman 2021).

    온도 변화에 따른 기수산 물벼룩의 항산화 효소 및 열 충격 단백질 유전자의 발현 변화를 확인한 결과 25°C 대 비 30°C 온도 조건에서 CuZnSOD 및 Hsp70의 발현이 각 각 4.62-, 및 3.74-fold만큼 유의하게 증가하였다 (Fig. 2A, B). 본 연구의 결과와 유사하게 선행 연구들은 높은 온도 조건에 노출된 요각류 Tigriopus kingsejongensis (Han et al. 2018), 흰다리새우 Litopenaeus vannamei (Zhou et al. 2010), 수생 곤충 Chironomus riparius (Park and Kwak 2014)에서 증가된 활성산소종, 항산화 유전자의 발현 및 항산화 효소 활성을 보고하였으며, 동부 굴 Crassostrea virginica의 Hsp 유전자의 발현이 높은 온도에 노출된 경 우 증가될 수 있음을 보고하였다 (Rahman and Rahman 2021). 고온 조건은 산화 스트레스의 생성과 밀접한 관련 이 있는 것으로 알려져 있다 (Oghbaei et al. 2021). 높은 온 도는 잘못된 단백질의 접힘을 유도하며 이들의 축적은 소 포체 스트레스 (endoplasmic reticulum stress, ER stress) 를 야기할 수 있다 (Cao and Kaufman 2014). 이 과정에 서 단백질의 티올기 (thiol, -SH)의 산화성 결합으로 인해 글루타치온 (glutathione, GSH)과 같은 항산화제 및 항산 화 단백질의 기능을 감소시키고 생체 내 활성산소종의 축 적을 야기할 수 있다. 따라서 30°C 온도 조건에서 증가된 CuZnSOD의 발현은 높은 온도 조건이 D. celebensis에 산 화적 스트레스를 유도하였음을 보여주며, 이와 함께 증가 된 Hsp70 유전자의 발현은 높은 온도에서 나타난 산화적 스트레스의 영향이 소포체 스트레스로부터 유도되었을 가 능성을 시사한다.

    반면 온도의 변화는 생물체의 방어기작에 영향을 줄 뿐 만 아니라 특히 절지동물에서 체내 호르몬의 조절에 중요 한 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있으며, 본 연구에서 30°C 온도 조건에 노출된 D. celebensis의 EcR_A 및 EcR_ B의 발현이 각각 1.37- 및 3.29-fold 증가되는 것을 확인 하였다 (Fig. 2C). 본 연구의 결과와 유사하게 Park and Kwak (2014)은 고온 조건에 노출된 C. riparius의 증가된 항산화 유전자 (SOD, CAT, peroxidase; Px 및 glutathione peroxidase; GPx) 및 효소 (SOD 및 GPx) 활성과 함께 생 식 관련 유전자 EcR, estrogen related receptor (ERR), 및 ultraspiracle (USP) 발현의 증가와 빨라진 개체의 발달을 보고하였으며, 이를 높아진 온도 조건에서 나타난 내분비 시스템의 교란의 결과로 제시하였다. 따라서 30°C 온도 조 건에서 증가된 EcR 유전자의 발현은 높은 온도 조건에서 D. celebensis의 내분비계가 손상될 수 있음을 의미하며, 이 는 고온 조건에서 첫 생식의 시기가 빨라진 만성 독성시험 의 결과를 뒷받침한다. 반면 35°C의 조건에서 Hsp70을 제 외한 대부분의 스트레스 및 생식 유전자의 발현이 감소하 였으며, 이는 과도하게 높은 온도 조건에서 세포 방어기작 및 내분비계 조절 기능이 손상되어 항산화 및 내분비 경로 유전자의 조절에 장애가 나타났기 때문일 수 있다.

    미세플라스틱은 수생생물에 의해 섭취되어 다양한 독성 영향을 나타낼 수 있으며 산화 스트레스 및 생식 독성은 미 세플라스틱의 대표적인 생물 독성 영향으로 알려져 있다 (Jeong et al. 2016;Cho et al. 2022). 선행 연구들은 미세플 라스틱에 노출된 해양 로티퍼 Brachionus koreanus, 기수 산 물벼룩 D. celebensis, 흰다리 새우 L. vannamei 및 어류 Danio rerio 및 Hypophthalmichthys molitrix에서 활성산 소종의 증가, 항산화 효소 활성 및 유전자 발현의 증가, 및 생식 관련 유전자의 변화 등 스트레스 및 생식 독성과 관 련한 분자 및 개체 수준의 영향을 보고하였다 (Jeong et al. 2016;Liu et al. 2018;Yoo et al. 2021;Zhang et al. 2021;Cho et al. 2022;Pandi et al. 2022). 본 연구에서 PS beads 의 급성 독성 노출은 스트레스 및 생식 관련 유전자의 발현 을 변화시켰으며, 이들 유전자 발현에 미치는 PS beads의 영향은 각각의 온도 조건에서 서로 다른 패턴을 나타냈다 (Fig. 3). Yoo et al. (2021)의 연구에 따르면 D. celebensis에 서 GST 효소의 활성 및 GST-S1 유전자의 발현이 PS beads 노출에 의해 민감하게 조절되는 생체지표였으며, 따라서 GST-S1의 발현은 PS beads의 독성 영향을 예측하기 위한 중요한 지표로 사용될 수 있을 것으로 판단된다. 본 연구에 서 GST-S1의 발현은 30°C의 조건에서 0.05-μm PS beads 노출된 경우 가장 크게 증가하는 양상을 보였으며 (3.13- to 4.15-fold, compared to non-NMP exposed group at 30°C; Fig. 3A), 이와 유사하게 0.05-μm PS beads 노출에 의한 Hsp90b의 발현 조절은 30°C에서 가장 높게 나타났 다 (3.23- to 10.93-fold, compared to non-NMP exposed group at 30°C; Fig. 3B). 이와 유사하게 높은 온도 조건 과 오염물질 노출이 스트레스 유전자 및 효소 활성 변화 에 미치는 상승적 독성작용은 다양한 수생생물을 이용한 연구를 통해 보고되어왔다. Bae et al. (2016)은 D. magna 에서 구리 (Cu)로 인한 활성산소종 및 지질과산화물의 생 산이 높은 온도 조건에서 유의하게 증가하는 것을 확인하 였으며, Park and Kwak (2014)은 diethylhexyl phthalate (DEHP)에 노출된 C. riparius에서 나타난 항산화 효소의 유전자 발현 및 효소 활성이 높은 온도 조건에서 유의하게 증가될 수 있음을 보여주었다. 선행 연구들의 결과를 미루 어 볼 때 30°C 조건에서 0.05-μm PS beads 노출에 따른 D. celebensis의 GST-S1 및 Hsp90b의 상승적 발현 조절은 높 은 온도 (30°C)가 PS beads로 인한 산화적 스트레스 작용 을 강화할 수 있음을 의미하며, 특히 작은 크기의 PS beads (0.05-μm)에서 상승적 독성작용이 강하게 나타날 수 있음 을 시사한다.

    Hsp90은 잘못 접힌 단백질이 다시 접힐 수 있도록 돕는 샤페론 단백질로 Hsp70 등의 다른 샤페론과 함께 기능을 하는 것으로 알려져 있다 (Mayer and Bukau 2005). Hsc70 또한 열 스트레스하에 발생한 Hsp70에 결합하여 복합체 를 형성하고 분자 샤페론으로 작동하는 것으로 알려져 있 어 (Liu et al. 2012), Hsp90의 발현이 증가할 경우 Hsp70과 Hsc70의 발현도 증가하여 함께 역할을 수행할 것이라 추 측할 수 있다. 일반 온도 조건 (25°C)에서는 PS beads 노출 에 따른 Hsp90b, Hsp70, 및 Hsc70 유전자 발현 양상이 대 체로 함께 상향 및 하향조절되는 것을 확인할 수 있었으 나, 30°C 조건에서 PS beads 노출에 따른 Hsp90b 발현은 Hsp70 및 Hsc70의 발현과는 상반되는 경향을 나타냈다. 이 러한 상반된 유전자 발현의 구체적인 원인은 알 수 없으나, 상승한 온도가 PS beads로 인한 Hsp70과 Hsc70의 합성 능 력 방해 효과를 강화했거나 Hsp90b의 발현이 빠르게 증가 하면서 다른 열충격 단백질과의 발현 시점에 차이가 발생 했을 가능성이 존재하며, 이를 확인하기 위해서는 높은 온 도 조건에서 실제 HSP 단백질의 합성과 관련한 추가적인 연구가 필요하다.

    반면 스트레스 관련 유전자들의 발현과는 달리, PS beads 노출에 따른 생식 관련 유전자 (EcR_A 및 EcR_B) 들의 발현은 35°C 조건에서 가장 유의하게 증가하였으며, 30°C 조건에 10 mg L-1의 PS beads (0.05- 및 6-μm)의 노 출은 EcR 유전자들의 발현을 유의하게 감소시켰다 (Fig. 3C). 고온 조건에서 PS beads 노출에 따른 스트레스 관련 유전자의 발현 변화가 특히 0.05-μm 노출군에서 독성 영 향이 상승적으로 나타난 것과는 달리 생식 관련 유전자의 발현은 동일한 온도 조건에서 PS beads의 크기에 따른 패 턴 차이는 관찰되지 않았다. 이는 높은 온도와 PS beads의 노출이 D. celebensis의 생식 관련 유전자의 발현에 상호작 용을 나타낼 수 있지만, PS beads의 크기에 비해 온도의 변 화가 이들의 상호작용에 더 유의한 영향을 나타내는 요인 으로 해석될 수 있다. 그럼에도 불구하고 ecdysteroid 경로 가 절지동물의 생식과 밀접한 관계가 있다는 것을 고려할 때, 35°C 조건 PS beads (0.05- 및 6-μm) 노출에 따른 EcR 유전자의 발현의 급격한 증가 및 30°C 조건에서 PS beads 노출에 의해 유의하게 감소된 EcR 유전자의 발현은 PS beads 노출에 따른 생식 독성 영향이 높은 온도 조건 (30 및 35°C)에서 강화될 수 있음을 의미한다. 또한 이러한 비정 상적인 탈피 관련 유전자 발현의 조절이 만성 독성시험에 서 나타난 고온 조건과 PS beads의 상승적 독성작용의 원 인이 될 수 있을 것으로 보인다.

    3.3. 생식지표, 성장률, 유전자 발현과 온도 및 PS beads 크기 사이의 상호작용 효과

    생식지표 (첫 생식 시점, 총 산란 수), 성장률 (r) 및 각 유 전자 발현에 대한 온도와 PS beads 크기에 대한 two-way ANOVA 분석 결과, 생식지표 중 첫 산란 시점에 유의한 상 호작용 영향을 나타낼 수 있는 것으로 나타났으나, 총 산란 수 및 개체군 성장률에 미치는 유의한 상호작용은 관찰되 지 않았다 (Table 1). 선행 연구들을 통해 PS beads의 크기 가 작을수록 독성이 높게 나타난다고 알려져 있음에도 불 구하고 본 연구에서는 30°C의 조건에 노출된 경우 6-μm PS beads 노출 그룹만이 첫 생식 시점에 대해 유의한 상호 작용을 나타냈다. 비록 선행 연구에서 해양생물에 미치는 PS beads의 산화 스트레스의 독성 영향이 미세플라스틱의 크기가 작을수록 증가된다는 것을 보고하였으나 (Jeong et al. 2016;Yoo et al. 2021), Jeon et al. (2023)의 연구에 따르 면 세포 독성 영향과는 달리 기수산 물벼룩의 에너지 대사 에 미치는 PS beads의 영향은 미세플라스틱의 크기 특이 적으로 나타날 수 있음을 보여주었다. 저자들은 PS beads 가 D. celebensis의 에너지 대사에 미치는 영향은 PS beads 의 크기에 따른 소화기관 내 축적 양상에 의해 영향을 받 을 수 있을 것이라 제시하였다. 6-μm PS beads의 경우 D. celebensis의 먹이생물과 유사한 크기로 0.05-μm PS beads 에 비해 소화기관 내에 더 높은 축적을 나타내는 점을 고려 할 때 (Yoo et al. 2021), 6-μm PS beads로 인해 낮아진 먹 이의 섭취가 30°C 조건에서 첫 생식 시점에 대해 6-μm PS beads 특이적 상호작용이 나타난 결과의 원인일 수 있다.

    한편 유전자 발현 변화의 경우, 스트레스 관련 유전자의 발현은 30°C에서 0.05-μm PS beads 노출에서 총 7개의 유 전자 (CuZnSOD, MnSOD, CAT, GST-S1, Hsp70, Hsp90b, Hsc70)가 상호작용 영향을 나타냈으며, 6-μm PS beads 노출에 의해 영향을 받은 유전자는 4개 (CuZnSOD, CAT, GST-S1, Hsp70)로 나타났다 (Table 2). 이러한 경향은 35°C 온도 조건에서도 나타났으나 온도가 상승함에 따라 PS beads의 크기에 따른 상호작용 효과를 보인 유전자는 더 적게 나타났다 [0.05-μm, 5개 (MnSOD, GST-S1, GPx, Hsp70, Hsp90b); 6-μm, 5개 (CuZnSOD, MnSOD, GST-S1, Hsp70, Hsp90b)]. 이는 PS beads 노출에 따른 산화 스트레 스의 영향이 높은 온도에 의해 변화할 수 있으며, 극심한 고온 조건 (35°C)의 경우 플라스틱의 크기에 상관 없이 PS beads에 의한 산화적 스트레스의 영향을 증가시킬 수 있음 을 의미한다. 그럼에도 불구하고 상대적으로 낮은 온도 증 가 조건 (30°C)에서 0.05-μm PS beads가 더욱 많은 유전자 들과의 상호작용을 나타냈으며, 이는 해당 조건에서 미세 플라스틱의 크기는 상승적 독성 영향에 중요한 요인으로 작용하며 플라스틱의 크기가 작을수록 더욱 높은 독성 영 향이 나타날 수 있음을 보여준다.

    생식 관련 유전자인 EcR_A, EcR_B 및 CYP314A1의 발 현 조절은 모두 고온과 PS beads의 동시 노출에 상호작용 이 높은 것으로 나타났으며, 30°C와 35°C에서 모든 크기 의 PS beads에 대한 상호작용 영향이 관찰되었다. 이는 D. celebensis의 생식이 높은 온도 및 PS beads 노출에 민감하 게 변화할 수 있으며, 이들의 상호작용 영향을 평가하기에 민감한 지표로 활용될 수 있음을 의미한다. 그럼에도 불구 하고 PS beads의 크기와 관계 없이 각 온도 조건에서 나타 난 유전자 발현 패턴의 유사성을 미루어 볼 때 (Fig. 3C), 온 도의 변화는 D. celebensis의 생식에 대해 PS beads의 독성 영향을 변화시키는 주요 요인으로 작용할 수 있을 것으로 생각된다.

    4. 결 론

    본 연구에서는 PS beads의 독성이 높은 온도 조건에서 강화될 가능성이 있는지 개체 및 유전자 수준에서 확인하 였다. 연구 결과 높아진 온도에서 PS beads에 노출된 기수 산 물벼룩의 항산화, 스트레스 관련 및 ecdysteroid 경로 관련 유전자의 발현을 조절함으로써 생식 및 개체군 성장 에 대한 독성 영향이 더 강화될 수 있음을 확인하였다. 특 히 온도 및 PS beads 노출에 따른 높은 상관관계를 보이 는 5개 유전자들 (MnSOD, GSTS1, EcR_A, EcR_B, 그리 고 CYP314A)은 변화하는 수 환경에서 생물의 건강성을 예측하기 위한 분자지표로써 활용 가능성이 높다. 본 연구 는 미세플라스틱에 대한 독성을 평가하고자 할 때 미세플 라스틱이 존재하는 수 환경의 수온을 포함하는 다양한 물 리화학적 요소가 고려되어야 할 필요가 있음을 제시하였 다. 그러나 미세플라스틱과 온도의 복합 영향을 충분히 이 해하기 위해서는 다양한 독성 발현 경로 (adverse outcome pathway)에 대한 다각적인 연구가 필요할 것이다. 본 연구 는 기후변화에 따라 변화하는 수 환경에서 미세플라스틱 이 해양동물 플랑크톤에 미치는 복합적인 독성 영향을 이 해하는 데 도움이 될 것이다.

    적 요

    미세플라스틱과 나노플라스틱 (NMPs)은 해양생물에 대한 생식 방해, 산화적 스트레스 등의 부정적 영향을 줄 수 있어 해양생태계의 유해오염물질 중 하나로 간주된 다. 전 지구적 기후변화로 해수 온도가 상승하고 있음에 도 불구하고 미세플라스틱과 온도변화 간의 독성학적 상 호 작용에 대한 연구는 제한적이다. 따라서, 본 연구에서 는 기수산 물벼룩 Diaphanosoma celebensis에 대한 NMPs (polystyrene beads; 0.05-, 6-μm)의 온도 상승에 따른 독 성을 개체 및 유전자 수준에서 확인하였다. 개체 수준에서 의 첫 생식 시점은 온도 상승에 의해 빨라지는 양상을 보 였으나 35°C 온도 조건에서 PS beads에 노출된 경우 유의 하게 지연되었다. 총 산란 수는 30°C, 0.05-μm PS beads에 노출된 경우에서만 유의하게 감소하였다. 상호작용 분석 결과 첫번째 생식 시점과 항산화 및 열충격 단백질 유전자 (GSTS1 및 Hsp70) 및 ecdysteroid 경로 관련 유전자 (EcR_ A, EcR_B, 및 CYP314A1)가 온도 및 PS 입자 크기에 주로 영향을 받는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 미세플라스 틱이 크기 의존적인 독성을 가지고 있음을 보여줌과 동시 에 온도 증가로 인해 독성이 강화될 수 있음을 의미한다. 본 연구는 미세플라스틱의 독성을 평가할 때 수온 등 다양 한 요소 또한 고려되어야 한다는 점을 제시하였으며, 해양 동물 플랑크톤에 대한 수온과 미세플라스틱의 복합적 독 성 상호작용에 대한 이해를 제공할 수 있을 것이다.

    CRediT authorship contribution statement

    YH Lee: Methodology, Data curation, Formal analysis, Writing-Original draft, Writing-Review & editing. JS Park: Methodology, Gene expression test. C Park: Methodology, Maintenance. SH Cho: Methodology, Maintenance. JW Yoo: Data curation, Interaction analysis, Writing-Review. YM Lee: Conceptualization, Supervision, Writing-Review & editing.

    Declaration of Competing Interest

    The authors declare no conflicts of interest.

    Figure

    KJEB-41-4-386_F1.gif

    First reproduction time, total reproduction, and growth rate in Diaphanosoma celebensis exposed to polystyrene beads (0.05- and 6-μm; 0.8 mg L-1) under different temperature conditions (25°C, 30°C, and 35°C) for 14 days. The asterisk indicates the significant interaction between temperature and the size of PS beads (two-way ANOVA and Tukey’s post hoc test). Different lowercase letters indicate significant differences between groups exposed to different NMPs at the same temperature, and uppercase letters indicate significant differences between groups exposed to the same NMPs at different temperatures (one-way ANOVA and Tukey’s post hoc test).

    KJEB-41-4-386_F2.gif

    Relative gene expression in Diaphanosoma celebensis exposed to different temperatures (25°C, 30°C, and 35°C) for 48 h. Different lowercase letters indicate significant differences among the temperatures (one-way ANOVA and Tukey’s post hoc test).

    KJEB-41-4-386_F3.gif

    Heat maps of relative mRNA expression of (A) antioxidant enzyme genes, (B) heat shock protein genes, and (C) ecdysteroid pathway-related genes in Diaphanosoma celebensis exposed to PS beads (0.05- and 6-μm) and different temperatures (25°C, 30°C, and 35°C) for 48 h.

    Table

    Results of two-way ANOVA with the influence of temperatures (25°C, 30°C, and 35°C) and size of PS beads (0.05- and 6-μm; 0.8 mg L-1) on first reproduction, total reproduction, and growth rate of Diaphanosoma celebensis

    Results of two-way ANOVA with the influence of temperatures (25°C, 30°C, and 35°C) and size of PS beads (0.05- and 6-μm; 10 mg L-1) on antioxidant (CuZnSOD, MnSOD, CAT, GST-S1, and GPx ), heat shock protein (Hsp70, Hsp90b, and Hsc70 ), and ecdysteroid pathway-related genes (EcR_A, EcR_B, and CYP314A1 ) of Diaphanosoma celebensis

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    Vol. 40 No. 4 (2022.12)

    Journal Abbreviation 'Korean J. Environ. Biol.'
    Frequency quarterly
    Doi Prefix 10.11626/KJEB.
    Year of Launching 1983
    Publisher Korean Society of Environmental Biology
    Indexed/Tracked/Covered By

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