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1. 서 론
고랭지배추는 해발 400 m 이상의 농지에서 재배되는 배추로 강릉, 태백, 삼척, 평창, 정선 등 강원도 지역에서 재배되고 있는 우리나라 주요 채소 작물 중 하나이다 (Lee and Heo 2018). 고랭지배추는 2011년부터 검역 관리 병해충인 씨스트선충에 의한 피해를 받아왔으며 (Ko et al. 2017;AQPA 2023), 최근에는 클로버씨스트선충이 우점하여 고랭지배추에 피해를 주고 있다 (Kwon et al. 2018). 클로버씨스트선충 (clover cyst nematode, Heterodera trifolii, CCN) 은 경제작물에 큰 피해를 주는 주요 식물기생선충 중 하나로 (Subbotin et al. 2010), 고랭지배추 재배 농가는 CCN에 의한 수량 감소로 인해 연간 258억 원 이상의 피해를 받고 있다 (NAS 2021). CCN에 감염된 배추는 초기에는 생육이 불량하고 가장자리 잎이 황화되거나 한낮에 시들음 증상을 보이고, 생육 후기에는 배추가 결구되지 않는 피해 증상을 보인다 (Mwamula et al. 2018).
CCN은 씨스트 (cyst)라는 단단한 껍질로 된 알주머니를 형성하여 생존에 불리한 외부 환경조건으로부터 보호를 받기 때문에 토양에 한 번 감염되면 완전한 방제는 어렵다 (Subbotin et al. 2010). 일반적으로 씨스트선충 방제는 화학적 살선충제를 처리하거나 (Lee et al. 2018), 비기주작물을 이용한 윤작 (Kim et al. 2016a), 선충 저항성인 품종 재배 (Watson et al. 1996), 생물 훈증 효과가 있는 녹비작물을 이용하고 있다 (Ko et al. 2020). 훈증성 살선충제를 처리하고 비닐을 피복하면 씨스트선충을 가장 효율적으로 방제할 수 있으나 (Lee et al. 2018), 강원도 고랭지배추 주산지인 매봉산, 귀네미골, 안반데기 등은 대부분 경사지로 약제 처리 후 비닐 피복이 어렵다 (Lee and Heo 2018). 따라서, 비기주작물 재배, 생물훈증 효과가 있는 녹비작물 처리 등의 방법을 병행하여 씨스트선충을 관리하고 있다 (Kim et al. 2016a;RDA 2023). 이 중에서 배추과에 속하는 기름무 (oil radish), 백겨자 (white mustard) 등 녹비작물은 씨스트선충에 직접적인 살선충 활성을 갖는 글루코시놀레이트 (glucosinolate)를 함유하고 있으며 (Kim et al. 2016b), 경사지에서도 처리할 수 있는 장점이 있어 CCN 방제에 널리 이용되고 있다 (Ko et al. 2020). 그러나, CCN 방제에 이용되고 있는 배추과 녹비작물의 해외 수입 의존도가 높아 안정적 공급을 위해서는 국내 생산이 가능한 녹비작물의 개발이 필요하다. 이에 갯무, 들갓 등 국내 자생 배추과 잡초의 녹비작물로의 활용이 시도되고 있다 (Kim and Ko 2024). 또한, 저항성 배추품종을 이용하면 CCN을 가장 손쉽게 방제할 수 있으나, 국내에는 아직 CCN에 저항성인 배추품종이 없다. 본 연구는 CCN 방제에 활용할 수 있는 녹비작물 선발과 저항성 품종 육종용 소재 선발을 위해 국내 씨앗은행 (https://genebank.rda.go.kr)에서 보유하고 있는 백겨자 식물자원에 대한 클로버씨스트선충 저항성 여부를 검정하고자 수행하였다.
2. 재료 및 방법
2.1. 식물자원 채집 및 육묘
씨스트선충 저항성 검정을 위해 2022년 1월 국립농업과학원 농업유전자원센터의 씨앗은행에서 백겨자 82개 자원을 분양받았다 (Table 1). 직경 90 mm 페트리디쉬에 여과지 1장을 펴놓고 수돗물을 흠뻑 적신 다음 채집한 종자와 배추 종자 (춘광 품종, 대조구)를 각각 20립씩 치상하였다. 실온에서 48시간 경과 후 유근이 확인된 백겨자 종자를 상토가 들어있는 288공 공정육묘 포트에 10립씩 파종하고 항온룸 (25°C, LED 인공광 14D : 10N)에서 본엽 4장이 나올 때까지 15~20일간 재배하여 유묘를 확보하였다.
2.2. 선충 접종원 준비
강원도 고랭지배추 재배지에 우점하고 있는 클로버씨스트선충 (CCN)에 대한 저항성 검정을 위해 국립농업과학원에서 증식하고 있는 CCN의 알을 분양받아 CCN 알 현탁액을 준비하였다 (Kwon et al. 2018). CCN이 감염된 토양 300 cm3를 5 L 부피의 플라스틱 물통에 넣고 약 4 L의 수돗물을 넣어 토양 현탁액을 만들었다. 토양 현탁액을 20 mesh (850 μm)와 60 mesh (250 μm) 체에 순차적으로 거르고, 60 mesh 체 위에 남은 물질은 격자가 있는 사각 페트리디쉬로 옮겨 닮았다 (Barker et al. 1985). 실체현미경 (MZ12; Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 CCN의 갈색 씨스트 (cyst)만 고정병 (micro-container, 지름 2 cm)에 옮겨 담았다. 씨스트를 1 mL 수돗물이 들어있는 5 mL tube 에 옮겨 담고 균질기 (HG-15A; Daihan scientific, Wonju, Korea)를 이용하여 씨스트 껍질을 터뜨려 알 현탁액을 조제하였다. CCN 알을 충분히 확보하기 위해 5 mL tube를 60 mesh (250 μm)와 500 mesh (25 μm) 체에 순차적으로 거르고 60 mesh 위에 남은 찌꺼기를 5 mL tube에 다시 옮겨 담아 균질기로 씨스트를 다시 한 번 갈아주었다. 500 mesh 체 위에 남은 알은 250 mL 비커에 옮겨 담고 수돗물을 추가하여 부피를 100 mL로 조정하였고, 실체현미경을 이용하여 1 mL당 CCN 알 수를 측정하였다.
2.3. 저항성 검정
백겨자 82자원에 대한 CCN 저항성 검정 시험은 1차 시험은 1회 (30개), 2회 (24개), 3회 (28개) 나누어 수행하였으며 저항성으로 나타난 백겨자 자원을 대상으로 2차 저항성 검정 시험을 수행하여 저항성 재현 여부를 확인하였다. 백겨자와 배추 (춘광 품종) 유묘를 저항성 검정용 토양 300 cm3 (강모래 8 : 황토 2 혼합토)가 들어있는 가로 5 cm, 세로 5 cm, 높이 15 cm 크기의 플라스틱 포트에 옮겨 심었다 (n=3). 시험 포트에 CCN 알을 포트당 1,000개의 밀도로 접종하고, 항온룸 (25°C, LED 인공광 14D : 10N)에서 CCN 암컷이 형성될 때까지 20일간 재배하였다.
2.4. 저항성 평가
백겨자의 CCN에 대한 저항성은 Taylor and Sasser (1978)의 방법을 참고하여 뿌리에 형성된 암컷의 개수를 이용하여 평가하였다. 암컷의 숫자가 0개는 극저항성 (highly resistance, HR), 1~10개는 저항성 (Resistance, R), 10개 초과는 감수성 (Sensitivity, S)으로 판정하였다. 선발된 자원의 CCN 저항성 재현성 여부를 평가하기 위한 2차 시험에서도 동일한 기준으로 저항성 여부를 판정하였다. CCN 암컷 밀도 조사를 위해 저항성 검정 시험토양과 식물 뿌리가 들어있는 포트를 통째로 5 L 부피의 플라스틱 물통에 넣고 4 L의 수돗물을 넣어 토양 현탁액을 만들었다. 토양 현탁액을 20 mesh (850 μm)와 60 mesh (250 μm) 체에 순차적으로 거르고 60 mesh 체 위에 남은 물질은 격자가 있는 사각 페트리디쉬로 옮겨 닮았다. 실체현미경 아래서 사각 페트리디쉬에 담긴 클로버씨스트선충 암컷을 계수하였다.
2.5. 통계분석
백겨자 식물자원에 대한 CCN의 저항성 검정 및 평가를 위해 R 프로그램 (https://www.r-project.org)을 이용하여 처리별 암컷 밀도에 대한 일원배치 분산분석 (oneway ANOVA)을 수행하였다. 사후검정은 던컨 다중검정 (Duncan’s multiple range test)을 수행하였으며, 모든 데이터는 평균과 표준편차로 나타냈다.
3. 결과 및 고찰
CCN에 대한 백겨자 식물자원의 저항성 검정 1차 시험 결과는 Table 2와 같다. 저항성 검정 결과 CCN 암컷이 10개를 초과한 시험자원은 Table 작성 시 제외하였다. 1차 저항성 검정은 82개 자원을 1회, 2회, 3회로 나누어 실험하였다. 1회 실험은 총 30개의 백겨자 식물자원에 대한 저항성 검정을 수행하였으며 2개 자원 (IT297309, IT297312)의 CCN 암컷이 10개 미만으로 나타나 CCN에 저항성 (R)이었으나 통계적인 유의성은 없었다. 또한, 1차 실험 대조구인 배추 (춘광 품종) 일부에서 클로버씨스트선충 암컷이 충분히 증식되지 않아 표준편차가 크게 나타났으며 향후 재검정이 필요할 것으로 판단된다. 2회 실험에서는 총 24개의 백겨자 식물자원에 대한 저항성 검정을 수행하였다. 이 중에서 백겨자 7개 자원 (IT302943, IT302951, IT302953, IT302954, IT302963, IT302964, IT302972)의 CCN 암컷 평균 밀도가 1~5개로 저항성 (R)으로 나타났으며 통계적으로 유의미한 차이가 있었다. 3회 검정에서는 총 28개 백겨자 자원을 대상으로 저항성 검정을 수행하였고 6개 자원 (IT302977, IT302984, IT302986, IT302988, IT302991, IT302994)이 CCN에 저항성으로 나타났다. CCN 저항성 검정 1~3차 시험에서 선발된 백겨자 13개 식물자원을 대상으로 저항성 재현성 확인을 위한 2차 시험을 수행하였다 (Table 3). Taylor and Sasser (1978)의 기준에 따라 CCN 암컷의 평균 밀도가 10개 미만으로 나타난 5개 자원 (IT297 309, IT297312, IT302951, IT302953, IT302954)을 저항성으로 판정하였다. 8개 자원 (IT302943, IT302964, IT302 972, IT302984, IT302986, IT302988, IT302991, IT302994) 은 평균 암컷 밀도가 10개 이상으로 나타나 감수성으로 판정하였다. 그러나, 각 개체별로 암컷 밀도를 관찰하였을 때 4개 자원 (IT302964, IT302984, IT302991, IT302994)은 암컷이 0~2개 증식된 개체들이 확인되었다. 국립농업과학원 농업유전자원센터 씨앗은행 (https://genebank.rda.go.kr) 의 자원 기초정보에 따르면 상기 4개 자원 (IT302964, IT302984, IT302991, IT302994)은 해외에서 채집된 야생종으로 선충 저항성 관련 유전형질이 고정되지 않아서 1차 검정 결과와 상이한 결과를 나타냈을 것으로 판단된다.
배추과 (Brassicaceae) 식물은 글루코시놀레이트 (glucosinolate, GLS)라는 2차 대사산물을 생성하는데 (Kim et al. 2016b), GLS는 식물기생선충의 저항성에 관여하는 물질로도 잘 알려져 있다 (Potter et al. 1998, 2000). 최종 선발된 백겨자 5개 자원 (IT297309, IT297312, IT302951, IT302 953, IT302954)과 2021년 CCN에 저항성인 배추과 식물 자원 중 하나인 African mustard (Brassica tournefortii)는 다른 백겨자 자원에 비해 전체 GLS 함량이나 특정 작용기 (functional group)를 가지는 GLS의 함량이 높아서 CCN 에 저항성인 것으로 판단된다 (Ko et al. 2021). 또한, 단일 물질의 효과보다는 서로 다른 물질들의 조합에 의한 것으로 추측되며, GLS 이외에 여러 가지의 생리활성물질 (bioactive compounds) 존재에 대한 보고들도 이루어져 왔다 (Torrijos et al. 2023). 콩씨스트선충의 rhg1, rhg4와 같이 CCN에 저항성인 유전자를 보유하거나 (Lian et al. 2023), 관련 유전자의 발현량이 일반 백겨자 자원들보다 더 높아서 CCN에 저항성으로 나타났을 가능성도 있다 (Zhang et al. 2017). 따라서 백겨자 IT302954 자원의 LC-MS/MS를 이용한 GLS 함량 분석, GWAS (genome wide association studies) 분석 등을 통해 CCN 저항성 검정 결과에 대한 추가 해석이 필요할 것으로 판단된다. 향후 추가 연구 결과에 따라 백겨자 5개 자원 (IT297309, IT297312, IT302951, IT302953, IT302954)과 선행 연구에서 CCN에 저항성인 것으로 나타난 African mustard 1개 자원은 선충 방제용 녹비작물이나 CCN 저항성 배추 품종 육성을 위한 육종 소재로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
적 요
클로버시스트선충 (Heterodera trifolii, CCN)은 국내에서 중요한 식물기생선충 중 하나로, 2017년부터 강원도 고랭지배추에 심각한 피해를 주고 있다. 훈증성 살선충제는 CCN 관리에 좋은 방제 방법이지만, 강원도 고랭지배추 재배지는 경사지가 많아 비닐 피복이 어렵기 때문에 훈증성 살선충제 처리가 어렵다. 이러한 이유로 CCN 관리를 위 한 대체 소재의 개발이 필요한 상황이며, 살선충 피복작물 과 저항성 품종이 대안 중 하나이다. 따라서, 우리는 선충 방제용 녹비작물 또는 저항성 배추 품종 육성을 위한 육종 소재로 활용하기 위해 씨앗은행의 백겨자 (Sinapis alba) 82 개 자원을 대상으로 CCN에 대한 저항성 검정을 수행하였다. 1차 시험에서는 15개의 백겨자 자원이 CCN에 저항성인 것으로 확인되었으며 나머지 자원은 CCN에 감수성 이었다. 선발된 15개 자원 중 13개 자원을 대상으로 CCN 저항성의 재현성 검정을 위해 2차 시험을 수행하였다. 그 결과, 백겨자 5개 자원 (IT297309, IT297312, IT302951, IT302953, IT302954)이 CCN에 저항성으로 나타났다. 최종 선발된 백겨자 5개 자원은 선충 방제용 녹비작물로 활용하거나 CCN에 저항성인 고랭지배추 품종 육성을 위한 유용한 유전자원으로 판단된다.
